Enquête basée sur l'interférence ARN de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale Wound

L’objectif global de ce test de transfection d’ARN est d’utiliser le petit ARN interférent spécifique de HSP27 pour évaluer le rôle potentiel de HSP27 dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant le processus de cicatrisation des plaies épithéliales. Le principal avantage de cette technique est que le petit ARN interférent est un ARN sensible que le saccharose a créé pour cibler spécifiquement un transcrit d’ARN messager afin d’induire sa dégradation.

Il a été utilisé pour identifier de nouveaux processus cellulaires dans l’espace parasitaire. Bien que cette technique puisse donner un aperçu de la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes, elle peut également s’appliquer à un autre système tel que la peau et la muqueuse. Soon-Suk Kang, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette procédure, cultivez des cellules épithéliales cornéennes humaines dans une plaque à six puits avec un milieu de croissance de l’épithélium bronchique à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’ils se confluent à 95 pour cent. Ensuite, diluez 2,5 microlitres, ou 7,5 microlitres du réactif de transfection avec 100 microlitres de milieu sérique réduit pour la transfection. Ensuite, dissolvez le siRNA spécifique de HSP27 et le siRNA contrôlé brouillé dans 100 microlitres ou un milieu sérique réduit pour créer respectivement 10 nanomolaires de siRNA spécifique de HSP27 et 15 nanomolaires de siRNA de contrôle brouillé.

Ensuite, mélangez 100 microlitres de solution d’ARNi avec 100 microlitres de réactif de transfection dilué et incubez le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. Par la suite, ajoutez des complexes lipidiques siRNA aux cellules. Après une incubation de quatre heures, remplacer le milieu par le milieu de croissance de l’épithélium bronchique complet et incuber les cellules deux jours à 37 degrés Celsius avant l’analyse par transfert Western.

Dans cette étape, extrayez les HCEC transfectés transfectés de siRNA spécifiques de HSP27 et brouillés dans une enceinte de sécurité biologique à l’aide de 100 microlitres de tampon de lyse glacé. Ensuite, incubez les cellules pendant 30 minutes sur de la glace pour induire la lyse cellulaire. Ensuite, centrifugez les lysats à 10 000 fois G pendant 15 minutes.

Par la suite, transférez les surnageants dans des tubes frais de 1,5 millilitre et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Après cela, déterminez les concentrations protéiques des lytats cellulaires à l’aide du test de protéines de Bradford. Ensuite, chargez les échantillons avec des quantités égales de protéines cellulaires totales sur un gel d’acrylamide à 10 % ou 12 %.

Soumettez le gel à la page SDS et transférez électrophorétiquement les bandes de protéines séparées dans les filtres à nitrocellulose avec 200 milliampères de courant pendant une heure et quatre degrés Celsius. Ensuite, bloquez les membranes filtrantes en nitrocellulose avec cinq pour cent de lait écrémé dans du TBST pendant une heure. Ajoutez ensuite des anticorps primaires et incubez les membranes pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur.

Le lendemain, lavez les membranes trois fois avec du TBST en prévoyant dix minutes pour chaque lavage. Ensuite, détectez les bandes immunoréactives à l’aide d’anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort dans cinq pour cent de BSA. Par la suite, incubez les membranes dans les réactifs de luminol Western Blot pendant une minute à température ambiante.

Retirez la membrane de la solution réactive. Ensuite, retirez l’excès de liquide avec une serviette absorbante et placez-les dans un protecteur en feuille de plastique. Ensuite, placez la membrane recouverte dans une cassette de film avec le côté protéique vers le haut.

Placez un film radiographique sur les membranes et exposez-le pendant une minute. Dans une enceinte de sécurité biologique, faites une plaie en faisant glisser une pointe de pipette stérile sur les cultures confluentes de HCEC transfectés par des siRNA spécifiques de HSP27 ou brouillés. Immédiatement après la blessure, lavez les cellules deux fois avec 1XPBS et maintenez-les dans un milieu de croissance de l’épithélium bronchique à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

24 heures après la blessure, prenez l’image HCEC à l’aide d’un microscope droit à 100x et effectuez l’aplatissement de l’arrière-plan à l’aide de la commande filter du logiciel d’analyse d’images. À l’aide de la commande de sélection des mesures, définissez la zone d’intérêt avec la même forme polygonale qui peut couvrir la blessure initiale perpendiculairement d’un bout à l’autre. Ensuite, déterminez trois zones d’intérêt différentes dans la zone blessée de chaque échantillon.

Comptez automatiquement le numéro de cellule dans chaque champ à l’aide de l’option de menu de mesure de la taille du nombre. L’analyse par transfert Western présentée ici a révélé que l’expression de HSP27 phosphorylée et d’Akt phosphorylée était toutes deux significativement réduite. Alors que l’expression des dos était significativement augmentée dans les HCEC transfectés par des siRNA spécifiques de HSP27.

L’expression phosphorylée de HSP27 a été réduite de 30 % et 40 % dans 10 nanomolaires et 15 nanomolaires de cellules transfectées de siRNA spécifiques de HSP27, respectivement, par rapport aux cellules témoins transfectées de siRNA. De plus, l’expression non phosphorylée de HSP27 a été réduite de 20 % et 30 % dans dix cellules nanomolaires et 15 nanomolaires de cellules transfectées de siRNA spécifiques de HSP27, respectivement. Le test de plaie directionnelle induite par le grattage a indiqué que 24 heures après la blessure, les cellules transfectées par siRNA spécifiques de HSP27 à 10 et 15 nanomolaires exibitées ont réduit la migration.

De plus, les siRNA transfectés spécifiques de HSP27 ont subi une plus grande mort cellulaire apoptotique et nécrotique par rapport aux cellules transfectées par cytométrie en flux. Une fois maîtrisée, la technique de transfection de l’ARN peut être effectuée en 24 heures si elle est effectuée correctement. À la suite de ces procédures, un épisode comme une bouche verrouillée peut être généré afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la fonction initiale de la protéine de choc thermique 27 dans la cicatrisation des plaies épithéliales de la cornée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le petit ARN interférent spécifique de la protéine de choc thermique 27 pour évaluer le rôle potentiel de la protéine de choc thermique 27 dans la cicatrisation des plaies épithéliales de la cornée. N’oubliez pas que travailler avec de petits ARN interférents et des réactifs peut être dangereux et que des précurseurs tels qu’une enceinte de sécurité biologique et un masque de protection doivent toujours être utilisés lors de l’exécution de ces procédures.