Name: Enquête basée sur linterférence ARN de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale Wound (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez comment utiliser l'ARN interférent spécifique de HSP27 pour évaluer le rôle de cette protéine dans la cicatrisation épithéliale cornéenne. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans la guérison des plaies.

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Cette étude a été soutenue par la subvention de recherche pour étudiants (13-14) de l&#39;Université d&#39;Ulsan College of Medicine, Seoul, Corée et une subvention (2014-464) de l&#39;Institut Asan for Life Sciences, Séoul, Corée.

1. Cell Line <ol><li> Culture 10 6 cellules télomérase immortalisées humaines de cornée épithéliale (HCECs) dans une plaque à 6 puits (densité: 1039,9 cellules / mm 2) dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% en utilisant un milieu de croissance de l&#39; épithélium bronchique (BEGM) jusqu&#39;à ce que ils atteignent 95% de confluence. </li></ol> 2. Analyse par Western Blot après Création épithéliales Wounds Scratch <ol><li> Streak une pointe stérile de 200 pi de pipette sur la surface d&#39;un puits d&#39;confluentes HCECs cultivées quatre fois par boîte dans une enceinte de sécurité biologique (classe II, type A2) et incuber HCECs séparément dans un incubateur à 37 ° avec une atmosphère de CO 2 de 5% pendant 1, 5, 10, 30, 60 et 120 min. </li><li> Utiliser une plaque de 6 puits pour six échantillons différents en fonction de la durée d&#39;incubation après la lésion de l&#39;épithélium de la cornée. </li><li> Laver les monocouches HCEC blessés trois fois avec PBS 1x, puis ajouter 2,0 ml BEGM à chaque puits. </li><li> Détachez HCECs utilisant 2ml de 0,25% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA) par puits pendant 5 minutes, centrifuger à 900 g pendant 5 min dans un tube de 15 ml et aspirât de trypsine-EDTA à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. </li><li> Suspendre HCECs avec 1 ml 1x PBS et les transférer dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifugeuse HCECs à 10.000 xg pendant 15 sec et aspirée 1x PBS en utilisant une pipette de 1 ml. </li><li> Remettre en suspension HCECs dans 100 de tampon de lyse glacé pl (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM mM , NaF 25, 2 mM de Na 3 VO 4, le fluorure de phénylméthanesulfonyle 1 mM [PMSF], les inhibiteurs de la protéase [1 pM de pepstatine A, 1 pM de leupeptine et 0,1 uM d&#39;aprotinine] et 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) et mélangez-les bien. </li><li> Incuber les cellules pendant 30 min sur de la glace pour induire la lyse des cellules. </li><li> lysats Centrifugeuse à 4 ° C à 10000 xg pendant 15 min, puis transférer surnageants frais tubes de 1,5 ml (90 aliquotes) et les stocker à -80 ° C. </li><li> Déterminer la concentration totale en protéines des lysats cellulaires en utilisant la pr Bradfordtest otein. 9 </li><li> Charge de 30 ug de protéines cellulaires totales dans un gel d&#39;acrylamide à 10% ou 12% pour le sodium dodécyl électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), puis par électrophorèse transfert séparés des bandes de protéines sur des filtres de nitrocellulose avec un courant de 200 mA pendant 1 heure à 4 ° C C à utiliser dans des essais western blot. </li><li> Bloc nitrocellulose filtres membranes avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST) pendant 1 heure, ajouter des anticorps polyclonaux de lapin primaire contre HSP27 non-phosphorylée (1: 1000 dilution) ou primaire d&#39;anticorps polyclonaux de lapin contre phosphorylée HSP27 (1 : 1000 dilution) dans 5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), et on incube les membranes pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Détecter les bandes immunoréactives en utilisant des anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1: 10000) dans 5% de BSA après lavage pendant 10 minutes, 3 fois avec du TBST. </li><li> Incuber la membrane dans les réactifs de luminol Western Blot (6-7 ml par 10 cm x 5 cm de la membrane) pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Retirer la membrane de la solution de réactif, éliminer le liquide en excès avec une serviette absorbante, et placer dans un protecteur de feuille de plastique. </li><li> Travailler dans une pièce sombre avec une lumière sûre, placer la membrane recouverte d&#39;une cassette de film avec le côté de la protéine vers le haut. </li><li> Placez le film X-ray sur le dessus de la membrane et exposer pendant 1 min. </li></ol> 3. Dosage de transfection de siRNA 10 <ol><li> HCECs de culture à 5 x 10 5 cellules / puits dans une plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% en utilisant BEGM jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent 95% de confluence. </li><li> On dilue le réactif de transfection (2,5 ou 7,5 pi) avec 100 pi de réduction milieu sérique pour la transfection (le facteur de dilution est de 41 ou 14,3) et on dissout le HSP27 spécifique et brouillée siRNA contrôle dans 100 ul de milieu sérique réduit pour créer 10 ou 50 nM de spécifiques HSP27 et embrouillé siRNA contrôle. </li><li> Mélanger 100 μ; La solution de siRNA l avec 100 ul de réactif de transfection dilué (1: 1 ratio) et on incube le mélange pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter les complexes ARNsi-lipide aux cellules. Puis, après 4 médias de changement h pour terminer BEGM et incuber les cellules pendant 2 jours à 37 ° C. </li><li> Analyser les cellules transfectées par western blot, comme décrit des sections 4.1 à 4.7. </li></ol> 4. Analyse par transfert de Western pour les cellules transfectées 11 siARN <ol><li> Extrait spécifiques HSP27 et brouillés HCECs siRNA-transfectées contrôle dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant 100 pi de tampon de lyse glacé (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 2 mM (EDTA), mM NaF 25, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), les inhibiteurs de protéase, et 0,5% de Triton X-100, pH 7). </li><li> Incuber les cellules pendant 30 min sur de la glace pour induire la lyse des cellules. </li><li> lysats Pellet à 10.000 xg pendant 15 minutes, puis transférer surnageants frais 1,5 ml baignoirees (90 ul aliquotes) et les stocker à -80 ° C. </li><li> Déterminer les concentrations protéiques des lysats cellulaires en utilisant le dosage des protéines de Bradford. 9 </li><li> Charger les échantillons avec des quantités égales de protéines cellulaires totales sur un gel d&#39;acrylamide 10% ou 12%, sous réserve du gel à SDS-PAGE, et le transfert électrophorétique les bandes de protéines séparées à des filtres de nitrocellulose avec un courant de 200 mA pendant 1 h à 4 ° C à utiliser dans des essais western blot. </li><li> Bloc filtre de nitrocellulose membranes avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST) pendant 1 heure, ajouter des anticorps primaires contre phosphorylée et non phosphorylée HSP27 (1: 1000 dilution), phosphorylée Akt (1: 1000 dilution), non phosphorylée Akt (1: 1000 dilution, utilisée comme marqueur de la survie cellulaire), Bcl-2-protéine associée à X (1: 1000 dilution utilisée comme une protéine pro-apoptotique), et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH; 1 : 200 dilution utilisée comme témoin de charge) dans 5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), etincuber les membranes pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Détecter les bandes immunoréactives en utilisant des anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1: 10000) dans 5% de BSA après lavage 3 fois avec du TBST, 10 min chaque lavage. </li><li> Incuber la membrane dans les réactifs de luminol Western Blot (6-7 ml par 10 cm x 5 cm de la membrane) pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Retirer la membrane de la solution de réactif, éliminer le liquide en excès avec une serviette absorbante, et placer dans un protecteur de feuille de plastique. </li><li> En travaillant dans une chambre noire avec une lumière inactinique, placer la membrane recouverte d&#39;une cassette de film avec le côté de la protéine vers le haut. </li><li> Placez le film X-ray sur le dessus de la membrane et exposer pendant 1 min. </li></ol> 5. Scratch induite Directional Blessant évaluation Dosage de migration cellulaire 12 <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, faire une blessure en faisant glisser une pointe de pipette stérile sur la surface d&#39;un puits de cultures confluentes despécifiques à l&#39;HSP27 ARNsi-transfectée ou HCECs ARNsi transfectée contrôle brouillé. </li><li> Immédiatement après la blessure, se laver les cellules deux fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et les maintenir dans les cultures BEGM dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% pendant 24 heures après la blessure. </li><li> Photographie images HCEC utilisant un microscope droit à grossissement 100X 24 heures après la blessure et d&#39;effectuer l&#39;aplatissement de fond en utilisant le filtre commande dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Utilisation de la commande Sélectionner des mesures, définir la zone d&#39;intérêt (AOI) avec la même forme polygonale taille qui peut couvrir perpendiculairement de bout en bout de la blessure initiale, et de déterminer trois AOI différent dans la zone blessée de chaque échantillon. </li><li> compter automatiquement le nombre de cellules dans chaque champ en utilisant les Count / Taille des options de menu Mesure. </li></ol> 6. cytométrie de flux Analyse de l&#39;apoptose <ol><li> Culture siRNA-transfectées et HSP27 spécifique de contrôle sHCECs chacun contenant 10nM de siRNA ARNi transfecté à une concentration de 5 x 10 5 cellules / puits dans des plaques à 6 puits jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 95% de confluence dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO2 à 5% dans BEGM. </li><li> Détacher HCECs en utilisant 2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par puits pendant 5 minutes, centrifuger à 900 g pendant 5 min dans un tube de 15 ml et aspirât de trypsine-EDTA à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS froid puis remettre en suspension les cellules dans 1 x tampon (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M de NaCl et 25 mM de CaCl2) se liant à une concentration de 10 6 cellules / ml. </li><li> Transférer 100 pl de suspension de cellules (1 x 10 5 cellules) dans un tube de culture de 5 ml. </li><li> Ajouter 5 ul d&#39;isothiocyanate de fluorescéine conjugué à l&#39;annexine V et 5 pi d&#39;iodure de propidium. </li><li> vortexer doucement les cellules et les incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 200 pi de tampon de liaison 1x à chaque tube et on analyse les cellules par un flux cytometer à 1 h. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
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<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt financier ou de propriété dans tous les matériaux ou procédés mentionnés dans cette étude.

Dans cette étude, nous avons évalué le rôle potentiel de HSP27 dans la lésion de l’épithélium cornéen en utilisant des approches in vitro . Les étapes critiques impliquaient la transfection d’un ARNi pour l’inactivation de HSP27 afin d’observer la fonction de HSP27 dans les cellules soumises à un stress. Notamment, un rôle de HSP27 a été révélé par ces expériences dans la migration des cellules épithéliales et l’apoptose lors de la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Contrairement aux études précéd...

Les cellules épithéliales de la cornée (CECS) tombent en continu dans le film lacrymal, alors qu&#39;ils sont simultanément remplacées par des cellules du limbe et des couches basales épithéliales de la cornée. 1 Divers facteurs de stress extrinsèques peuvent induire l&#39;apoptose et la desquamation de CECs. 2 Les protéines de choc thermique (HSP) sont hautement conservée et peut être divisé en deux familles selon la taille moléculaire. 3 la plus grande famille HSP comprend HSP90, HSP70 et HSP60, et la plus petite famille comprend HSP27. 4 la phosphorylation de HSP27 est connue pour jouer un rôle important dans la survie des cellules et est nécessaire pour la migration cellulaire en raison du rôle de cette protéine dans l&#39; actine remodelage. 5-7 par conséquent, nous avons tenté de tester le rôle potentiel de HSP27 phosphorylation dans la migration de la CCE et de l&#39; apoptose dans un modèle in vitro de cicatrisation épithéliale. L&#39;interférence ARN (ARNi) en utilisant soit des petites ou courtes ARN interférents (siRNA) a gel&#39; intérêt à la fois la biologie également exonéré fondamentale et appliquée, car elle permet potentiellement l&#39;expression d&#39;un gène d&#39;intérêt à être renversé vers le bas. 8 Ici, nous avons utilisé siRNA spécifiques HSP27 pour évaluer la contribution des HSP27 à la guérison de la plaie de la CCE et de l&#39; apoptose. Les méthodes traditionnelles d&#39;ARNi pour le gene knock-down dans les cellules utilisent des duplexes d&#39;ARN synthétiques, comprenant deux oligonucléotides 21-mères non modifiés qui peuvent être assemblés pour créer des ARNsi. L&#39;ARNi siRNA que nous avons utilisé dans cette étude est une méthode simple et très efficace pour transfecter des cellules, et ce réactif travaille avec diverses lignées cellulaires immortalisées. Dans la présente étude, nous démontrons les méthodes utilisées pour cette analyse, y compris un essai induit scratch-plaie directionnelle, western blot, siRNA essai de transfection, immunofluorescence et cytométrie en flux.

<table><tbody><tr><td>Enceinte de sécurité biologique</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp ; Daejeon, République de Corée&nbsp ;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Classe II, type A2</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>ARNi siRNA ; siRNA de contrôle brouillé et siRNA spécifique à HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Milieu de croissance de l’épithélium bronchique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la protéase&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., Saint-Louis, MO</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &#956 ; M Pepstatine A, 1 &#956 ; M Leupeptine, 0,1 &#956 ; M Dosage</td></tr> de <tr><td>la protéine Aprotinin Bradford&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Bradford dosage des protéines&nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtres à nitrocellulose</td><td>Amersham, Little Chalfont, Royaume-Uni</td><td>RPN3032D</td><td>Membrane western blot</td></tr><tr><td>non phosphorylée HSP27&nbsp ;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351 Dilution</td><td>1:1 000 (HSP27 totale)</td></tr><tr><td>HSP27 phosphorylée (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594 Dilution</td><td>1:1 000 HSP27 a été phosphorylée au niveau de Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg ; RNAiMAX réactif&nbsp ;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Akt phosphorylé (Ser473)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA</td><td>n° 4060</td><td>Dilution 1:1 000 Akt a été phosphorylé au niveau Ser473 (marqueur de survie cellulaire)</td></tr><tr><td>Akt non phosphorylé&nbsp ;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>Dilution 1:1 000 (Akt totale)</td></tr><tr><td>Protéine X associée à Bcl-2&nbsp ;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>n° 4062</td><td>1:1 000 (marqueur protéique anti-apoptotique)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>n° 4063</td><td>Marqueur de contrôle de charge 1:1 000 (gène de ménage)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin de chèvre conjugués à la peroxydase de raifort</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>dilution 1:10 000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>Milieu sérique réduit pour la transfection</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Japon</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Allemagne</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à six puits</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35,00 mm de diamètre / puits</td></tr><tr><td>Boîte de culture à 24 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>N-Bioteck, Inc., Séoul, Corée du Sud</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Santa Cruz Biotechnologie, Santa Cruz, Californie</td><td>sc-2323&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td> Film radiographique de <td>cytométrie en flux</td></tr><tr><td></td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Cassette de radiographie médicale avec écran vert 400&nbsp ;</td></tr><tr><td>réactif de luminol western blot</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Kit de détection de l’apoptose I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

enquête basée sur l&#39;interférence arn de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale wound

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Le petit ARN interférent (siRNA) est l’une des méthodes d’interférence d’ARN les plus largement utilisées pour le silençage à court terme de gènes codant pour des protéines. Le siRNA est un duplex d’ARN synthétique créé pour cibler spécifiquement un transcrit d’ARNm afin d’induire sa dégradation et il a été utilisé pour identifier de nouvelles voies dans divers processus cellulaires. Il existe peu de rapports concernant le rôle de la protéine de choc thermique phosphorylée 27 (HSP27) dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Ici, des cellules épithéliales cornéennes humaines en culture ont été divisées en un groupe témoin brouillé transfecté par siRNA et un groupe transfecté par siRNA spécifique à HSP27. Des tests de plaie directionnelle induits par le grattage, ainsi que le western blot et la cytométrie en flux ont ensuite été effectués. Nous concluons que HSP27 joue un rôle dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes qui peut impliquer l’apoptose et la migration des cellules épithéliales. Vous trouverez ici des descriptions étape par étape de la préparation des échantillons et du protocole d’étude.

L&#39;expression de HSP27 phosphorylée significativement augmentée à 5, 10, et 30 minutes après zéro blessant comparé à HCECs 13 non blessés. L&#39; analyse par transfert de Western a révélé que l&#39;expression de HSP27 phosphorylée et la protéine Akt phosphorylée ont tous deux été significativement réduite, alors que l&#39;expression de Bax était significativement augmentée dans HCECs d&#39;ARNsi spécifique à une transfection HSP27 (figure 1A-E). L&#39;expre...

Dans la présente, nous présentons un protocole permettant d’utiliser le petit ARN interférent spécifique de la protéine de choc thermique 27 (HSP27) pour évaluer la fonction de HSP27 pendant la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. L’interférence ARN est la meilleure méthode pour inhiber efficacement l’expression des gènes afin d’étudier la fonction des protéines dans divers types de cellules.

Enquête basée sur l&#39;interférence ARN de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale Wound

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

L'objectif général de cet essai de transfection d'ARN est d'utiliser un ARN interférent petit spécifique de la HSP27 afin d'évaluer le rôle potentiel de la HSP27 dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la fonction de la protéine de choc thermique 27 au cours du processus de cicatrisation des plaies épithéliales. Le principal avantage de cette technique est que l'ARN interférent petit est un ARN sensible au sucrose conçu spécifiquement pour cibler un transcrit d'ARN messager et induire sa dégradation.Il a été utilisé pour identifier de nouveaux espaces de ravageurs dans divers processus cellulaires. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur la cicatrisation des lésions de l'épithélium cornéen, elle pourrait également s'appliquer à d'autres systèmes tels que la peau et la muqueuse. La procédure sera démontrée par Soon-Suk Kang, un technicien de mon laboratoire.Pour commencer cette procédure, cultiver des cellules épithéliales cornéennes humaines dans une plaque de six puits avec un milieu de croissance pour épithélium bronchique à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 95 pour cent. Ensuite, diluer 2,5 microlitres ou 7,5 microlitres du réactif de transfection avec 100 microlitres de milieu à faible teneur en sérum destiné à la transfection. Puis, dissoudre un ARNi spécifique de HSP27 et un ARNi contrôle désordonné dans 100 microlitres de milieu à faible teneur en sérum afin de préparer respectivement une solution d'ARNi spécifique de HSP27 à 10 nanomolaire et une solution d'ARNi contrôle désordonné à 15 nanomolaire.Ensuite, mélanger 100 micro litres de solution d'ARNi avec 100 micro litres de réactif de transfection dilué et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. Puis, ajouter les complexes lipidiques d'ARNi aux cellules. Après une incubation de quatre heures, changer le milieu pour un milieu de croissance complet de l'épithélium bronchique, puis incuber les cellules deux jours à 37 degrés Celsius avant l'analyse par immunobuvardage sur transfert (western blot).À cette étape, extraire les HCEC transfectées par le siARN spécifique de HSP27 et le siARN contrôle désordonné dans une hotte de sécurité biologique en utilisant 100 µL de tampon de lyse glacé. Incuber ensuite les cellules pendant 30 minutes sur de la glace afin d'induire la lyse cellulaire. Ensuite, centrifuger les lysats à 10 000 ×g pendant 15 minutes.Ensuite, transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Déterminez ensuite les concentrations en protéines des lysats cellulaires à l'aide du dosage des protéines de Bradford. Chargez alors les échantillons contenant des quantités égales de protéines cellulaires totales sur un gel d'acrylamide à 10 pour cent ou 12 pour cent.Soumettez le gel à une électrophorèse SDS-PAGE, puis transférez électrophorétiquement les bandes protéiques séparées sur des membranes de nitrocellulose avec un courant de 200 milliampères pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, bloquez les membranes de nitrocellulose avec du lait écrémé à cinq pour cent dans du TBST pendant une heure. Puis ajoutez les anticorps primaires et incubez les membranes toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur.Le lendemain, laver les membranes trois fois avec du TBST en laissant dix minutes pour chaque lavage. Ensuite, détecter les bandes immunoréactives à l'aide d'anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort dans 5 % de BSA. Puis, incuber les membranes dans les réactifs de chimiluminescence pour immunoblot pendant une minute à température ambiante.Retirez la membrane de la solution réactif. Ensuite, éliminez le liquide excédentaire à l’aide d’un chiffon absorbant et placez-la dans une pochette plastifiée. Puis, insérez la membrane recouverte dans une cassette pour film, côté protéines vers le haut.Placez un film radiographique sur les membranes et exposez-le pendant une minute. Dans une cabine de sécurité biologique, créez une plaie en faisant glisser une pointe de pipette stérile à travers les cultures confluentes de cellules HCEC transfectées avec un ARNsi spécifique de HSP27 ou un contrôle ARNsi brouillé. Immédiatement après la création de la plaie, lavez les cellules deux fois avec du PBS 1X et maintenez-les dans un milieu de croissance pour épithélium bronchique à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.24 heures après la blessure, acquérir l'image des CÉC à l'aide d'un microscope droit à un grossissement de 100x et effectuer l'aplatissement du fond en utilisant la commande de filtre dans le logiciel d'analyse d'image. À l'aide de la commande de sélection des mesures, définir la zone d'intérêt à l'aide d'une forme polygonale de taille identique, capable de couvrir perpendiculairement la blessure initiale de bout en bout. Ensuite, déterminer trois zones d'intérêt différentes dans la zone lésée de chaque échantillon.Comptez automatiquement le nombre de cellules dans chaque champ à l'aide de l'option de menu Mesure du nombre. L'analyse par immunotransfert illustrée ici a révélé que l'expression de HSP27 phosphorylée et d'Akt phosphorylé était significativement réduite. Alors que l'expression de Bax était significativement augmentée dans les HCEC transfectées par un ARNi spécifique de HSP27.L'expression de HSP27 phosphorylée a été réduite de 30 pour cent et de 40 pour cent respectivement dans les cellules transfectées avec 10 nanomolaire et 15 nanomolaire de siRNA spécifique de HSP27, par rapport aux cellules transfectées avec un siRNA contrôle. De plus, l'expression de HSP27 non phosphorylée a été réduite de 20 pour cent et de 30 pour cent respectivement dans les cellules transfectées avec 10 nanomolaire et 15 nanomolaire de siRNA spécifique de HSP27. Le test de migration directionnelle induite par rayure a indiqué qu'après 24 heures de lésion, les cellules transfectées avec le siRNA spécifique de HSP27 à 10 et 15 nanomolaires présentaient une migration réduite.En outre, les HCEC transfectées avec un ARNsi spécifique de HSP27 ont subi une mort cellulaire plus importante par apoptose et nécrose par rapport aux cellules transfectées avec un ARNsi contrôle désordonné, comme le montre la cytométrie en flux. Une fois maîtrisée, la technique de transfection d'ARN peut être réalisée en 24 heures si elle est correctement effectuée. Après avoir suivi ces procédures, un épisode tel que le « lock mouth » peut être induit afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la fonction initiale de la protéine de choc thermique 27 dans la cicatrisation des lésions épithéliales de la cornée.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser un ARN interférent petit spécifique de la protéine de choc thermique 27 pour évaluer le rôle potentiel de la protéine de choc thermique 27 dans la cicatrisation des plaies épithéliales de la cornée. N'oubliez pas que le travail avec des ARN interférents petits et des réactifs peut présenter des risques, et que des équipements de protection tels qu'une cabine de sécurité biologique et un masque de protection doivent toujours être utilisés lors de la réalisation de ces procédures.

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Génétique

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Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.

Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène

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Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de maladies.

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Ici, des modèles animaux basés sur la souris et le lapin sont développés pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen afin de cribler de nouveaux traitements et le mécanisme sous-jacent.

Modèles animaux ex vivo et in vivo pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen

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Imagerie de cellules vivantes de globes ex vivo intacts à l’aide d’un nouveau support imprimé en 3D

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Etablissement d’un modèle d’inflammation cornéenne sévère chez le rat basé sur le curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes

La culture ex vivo d’organes de cornée porcine et la cicatrisation des plaies épithéliales constituent un moyen économique, éthique, reproductible et quantitatif de tester la toxicité oculaire des produits chimiques. Ils aident également à élucider les mécanismes sous-jacents à la régulation de l’épithélialisation et de la réparation tissulaire, et à évaluer les traitements pour traiter la kératopathie diabétique et le retard de cicatrisation des plaies.

Évaluation de la toxicité thérapeutique et chimique à l’aide de cornées porcines cultivées sur des organes et de la cicatrisation des plaies épithéliales

Découvrez comment utiliser l'ARN interférent spécifique de HSP27 pour évaluer le rôle de cette protéine dans la cicatrisation épithéliale cornéenne. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans la guérison des plaies.

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