Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels
25 décembre 2016
Ce protocole décrit un colorant technique de transfert de chargement fluorescent scalpel qui mesure la communication intercellulaire par les canaux des jonctions lacunaires. Gap communication intercellulaire jonctionnelle est un processus cellulaire majeur par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue et la perturbation de cette signalisation cellulaire a des effets néfastes sur la santé.
L’objectif global est de fournir un test simple pour mesurer la communication intercellulaire jonctionnelle lacunaire à travers une population de cellules de mammifères pouvant répondre à un large éventail de besoins pharmacologiques et toxicologiques in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie, par exemple si un composé affecte le développement ou le maintien d’un tissu, en dérégulant la communication intercellulaire jonctionnelle lacunaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une évaluation simple et rapide de la fonction des jonctions lacunaires dans une grande population de cellules en réponse à des toxiques et des toxines.
Ajna Uzuni, une assistante de recherche de premier cycle de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer l’expérience, ensemencez trois fois 10 cellules épithéliales hépatiques de rat WB-F344 dans des plaques de culture de 35 millimètres de diamètre contenant du milieu modifié d’Eagle et 5 % de sérum fœtal-bovin. Cultivez les cellules dans un incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent 100 % de confluence et poursuivez le traitement expérimental des cellules.
Pour poursuivre les expériences dose-réponse, ajoutez 10 microlitres et 20 microlitres d’une solution mère de phénanthrène à 100 % préparée à deux millimolaires, et quatre microlitres, six microlitres et huit microlitres d’une solution mère de phénanthrène à 20 millimolaires dans de l’acétonitrile à 100 % à trois plaques de cellules contenant deux millilitres de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution mère. Ensuite, ajoutez quatre microlitres, six microlitres, huit microlitres, 10 microlitres et 20 microlitres d’une solution à 100 % d’acétonitrile à trois plaques de cellules contenant deux millilitres de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution d’acétonitrile pour servir de contrôle du véhicule. Après avoir ajouté l’acétonitrile, incubez les plaques.
Pour effectuer des expériences de réponse temporelle, ajoutez sept microlitres d’une solution mère de 20 millimolaires de phénanthrène dans de l’acétonitrile à 100 % à trois plaques de cellules, contenant deux millilitres de milieu de croissance pour chaque point temporel. Ensuite, ajoutez sept microlitres d’acétonitrile à 100 % à trois plaques de cellules, contenant deux millilitres de milieu de croissance pour chaque point temporel, pour servir de contrôle du véhicule. Incuber les plaques pour chaque point temporel désigné.
Jetez le milieu de culture en le versant doucement. Rincez les cellules avec trois millilitres de PBS, et décantez ou aspirez entre les rinçages. Pipette d’un millilitre d’un milligramme par millilitre de colorant jaune lucifer dissous dans du PBS dans chaque plaque cellulaire.
Préchargez le colorant dans les cellules en pinçant le scalpel entre l’index et le pouce. Placez le scalpel perpendiculairement et à cinq millimètres du bord de la plaque de culture, puis utilisez la gravité pour permettre au scalpel de rouler doucement de cet angle perpendiculaire à un angle de 15 degrés. Faites rouler la lame à travers une population de cellules dans trois zones différentes de la plaque totale.
Ensuite, incubez les cellules avec la solution LY pendant trois minutes à température ambiante. Décantez ou aspirez le LY et rincez les cellules pour éliminer tout colorant extracellulaire et éliminer la fluorescence de fond extracellulaire. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre d’une solution de formol tamponnée à 4 % de phosphate pour fixer les cellules.
Observez les cellules fixes à l’aide d’un microscope à épifluorescence à un grossissement de 200x. Alignez toutes les plaques de manière à ce que la ligne d’indentation soit parallèle au champ de vision horizontal. Une série d’images SL-DT a été générée à partir de cellules épithéliales hépatiques de rat WB-F344 traitées avec des doses croissantes de phénanthrène.
La diminution de la migration du colorant fluorescent jaune Lucifer est causée par des doses croissantes de phénanthrène, démontrant l’inhibition croissante induite par le toxique de la communication intercellulaire jonctionnelle lacunaire, ou GJIC. La fraction des valeurs de contrôle, ou FOC, obtenue à partir des images SL-DT a été moyennée, analysée statistiquement, puis représentée graphiquement. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les transferts Western de protéines de transduction simples peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires.
Par exemple, ces composés activent-ils des événements mitogènes de perforation cellulaire ?
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Aperçu
Ce protocole décrit une technique de transfert de colorant fluorescent par chargement au scalpel permettant de mesurer la communication intercellulaire via les jonctions communicantes. Cette méthode fournit un essai simple pour évaluer la communication intercellulaire par jonctions communicantes dans les cellules de mammifères, ce qui est essentiel pour comprendre l'homéostasie tissulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Toxicologie
Contexte
- La communication intercellulaire par jonctions gap est essentielle au maintien de l'homéostasie tissulaire.
- La perturbation de cette communication peut entraîner des effets néfastes sur la santé.
- Cette technique permet une évaluation rapide de la fonction des jonctions gap.
- Elle peut être appliquée dans diverses études pharmacologiques et toxicologiques.
Objectif de l'étude
- Mesurer les effets des composés sur la communication intercellulaire par jonctions communicantes.
- Proposer une méthode fiable pour évaluer le développement et le maintien des tissus.
- Faciliter la recherche en toxicologie concernant l'impact des toxines sur la communication cellulaire.
Méthodes utilisées
- Ensemencer les cellules épithéliales hépatiques de rat WB-F344 dans des plaques de culture.
- Cultiver les cellules jusqu'à atteindre une confluence de 100 %.
- Appliquer les traitements expérimentaux aux cellules.
- Utiliser le transfert de colorant fluorescent pour évaluer la communication intercellulaire.
Résultats principaux
- La technique permet d'évaluer la fonction des jonctions communicantes dans de grandes populations cellulaires.
- Elle fournit des informations sur la manière dont les toxiques affectent la communication intercellulaire.
- Efficacité démontrée dans diverses études in vitro.
- Un protocole rapide et simple améliore l'efficacité de la recherche.
Conclusions
- Cette méthode constitue un outil précieux pour la recherche en toxicologie.
- Elle aide à comprendre le rôle des jonctions communicantes dans la santé des tissus.
- Des études futures pourront élargir ses applications en pharmacologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La communication intercellulaire par jonctions communicantes (GJIC) sert de biomarqueur fonctionnel pour évaluer la perturbation de l'homéostasie tissulaire par des toxiques et pour analyser les effets protecteurs de produits naturels. La technique de transfert de colorant fluorescent par chargement au scalpel (SL-DT) permet une évaluation rapide au niveau des populations de l'inhibition de la GJIC, soutenant ainsi la détection mécanistique des risques en phase précoce de découverte. Cet essai fournit une prédiction fiable pour hiérarchiser les composés selon leur impact sur les voies de communication cellulaire essentielles au fonctionnement des organes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en associant l'exposition à un composé à la perturbation de la communication intercellulaire par jonctions gap, en tant que mécanisme de toxicité.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à la mesure directe de l'activité des canaux intercellulaires dans des populations cellulaires vivantes.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en identifiant des biomarqueurs précoces d'effets indésirables sur le maintien tissulaire et l'homéostasie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval en établissant une compétence de base en matière de communication intercellulaire par jonctions gap (GJIC).
- Valeur opérationnelle : Fournit des lectures quantitatives normalisées du transfert de colorant, compatibles avec l'automatisation et l'imagerie à haut débit.
- Extensibilité : Adaptée à des tranches de tissus in vivo et compatible avec la microscopie à fluorescence automatisée afin d'augmenter le débit d'échantillons.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique grâce à des mécanismes conservés de communication intercellulaire jonctionnelle (GJIC) à travers les espèces.
- Déminimisation du risque mécanistique : Précise si les phénotypes observés résultent d'une perturbation de la communication intercellulaire plutôt que d'effets hors cible.
- Décisions ajustées au risque : Guide les critères de progression en quantifiant les relations structure-activité dans la modulation de la GJIC.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test SL-DT sert d'outil exploratoire pour obtenir des informations mécanistiques, utilisé avant l'optimisation du composé afin d'éliminer les substances présentant un risque élevé de perturbation tissulaire.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant la manière dont les toxiques ou les produits naturels modifient les réseaux de signalisation intercellulaire.
- Écrantage : Assure la préparation des tests grâce à des mesures fonctionnelles reproductibles, basées sur des populations, reflétant la communication au niveau tissulaire.
- Analytique : Génère des valeurs de fraction du témoin (FOC) permettant des comparaisons statistiques entre différentes doses et points temporels.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les stratégies de biomarqueurs en reliant la fonction de la communication jonctionnelle à des résultats relatifs à l'intégrité tissulaire dans des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une plateforme réutilisable dans divers programmes de développement en toxicologie, pharmacologie et nutraceutique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant une mesure fonctionnelle directe de l'activité des canaux jonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à un chargement simple à l'aide d'un scalpel et à une imagerie à point final fixe.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en reliant la perturbation précoce de la communication intercellulaire par jonctions gap à des effets tissulaires indésirables ultérieurs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en identifiant les composés qui préservent l'homéostasie de la communication intercellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, en manipulation de colorants fluorescents et en microscopie épifluorescente.
- Dépend d'une technique standardisée de lame et de durées d'incubation constantes pour un transfert fiable du colorant.
- Exige un accord entre les équipes sur les seuils d'analyse d'images et les paramètres morphométriques.
- Adaptable à différents types cellulaires de mammifères et à des tranches de tissus moyennant l'optimisation des paramètres de chargement et de fixation.
- Limité à l'évaluation de l'activité fonctionnelle des canaux ; ne permet pas de distinguer entre l'expression des connexines, leur phosphorylation ou leurs états de régulation.
