Criblage à haut débit d'Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

L’objectif global de ce test chromogène est de cribler diverses enzymes dans un format à haut débit contre une sélection de différents substrats chromogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte d’enzymes, telles que la découverte de nouvelles activités enzymatiques pour la dégradation de la biomasse. Le principal avantage de cette technique est que les substrats chromogènes sont disponibles en quatre couleurs différentes, ce qui rend cette technique à haut débit, extrêmement fiable et rentable.

Pour commencer, activez la plaque du kit de dosage du filtre à 96 puits en ajoutant 200 microlitres de solution d’activation à chaque puits. Incuber à température ambiante sans agitation pendant 10 minutes. Utilisez une centrifugeuse et n’importe quelle plaque standard à 96 puits pour la collecte.

Pour faire tourner la solution d’activation existante, ajoutez 100 microlitres d’eau stérile aux substrats d’hydrogel ou de CPH en polymère chromogène et appliquez un vide ou une rotation pour retirer le stabilisant. Répétez le lavage deux fois de plus. Pour préparer la réaction enzymatique, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 mM, un pH de 4,5 et 5 microlitres de solution d’endocellulase avec trois concentrations différentes dans chaque puits de la plaque du kit de dosage.

Placez la plaque de produit sous la plaque du kit de test pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de réaction pendant l’agitation. Ensuite, incubez la plaque du kit de dosage à température ambiante dans un agitateur horizontal à 100 tr/min pendant 30 minutes. Pour recevoir des données fiables, il est nécessaire d’agiter le mélange réactionnel pendant l’incubation.

Placez la plaque du kit de dosage avec la plaque de produit en dessous dans la centrifugeuse et faites tourner à 2 700 x g pendant 10 min. Pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit. Après l’essorage, inspectez visuellement la plaque du produit pour vérifier si le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même.

À l’aide d’un lecteur de plaques, lire l’absorbance de la plaque collectrice à 630 nm pour les différents substrats CPH verts. Analysez et tracez les données selon le protocole texte. Pour effectuer le dosage chromogène avec de la biomasse chromogène rouge insoluble ou de la paille de blé ICB, commencez par ajouter 200 microlitres de solution d’activation dans chaque puits de la plaque de test.

Ensuite, incubez la plaque à température ambiante sans agitation pendant 10 minutes. Retirez le stabilisant en utilisant 100 microlitres d’eau stérile pour laver les puits trois fois. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 mM pH 4,5 et 5 microlitres de 10 unités par millilitre de solution d’endo-xylanase différente.

Positionnez la plaque de produit sous la plaque de substrat pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de substrat pendant l’agitation. Incuber la réaction à température ambiante à 100 tr/min pendant deux heures. Après l’incubation, placez la plaque du kit de dosage avec la plaque de produit en dessous dans la centrifugeuse et tournez-la à 2, 700 x g pendant 10 min pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit.

Vérifiez que le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même. Ensuite, à l’aide d’un lecteur de plaques, on lit l’absorbance de la plaque de collecte à 517 nm pour la paille rouge ICB-blé. Effectuer l’analyse des données selon le protocole texte.

Voici un exemple d’une relation dose-réponse entre le CPH-arabinoxylan et la xylanase à différentes concentrations de l’enzyme où la diminution de la concentration enzymatique peut être observée visuellement. Une quantification spectrophotométrique plus détaillée est utilisée pour tracer l’absorbance en fonction de la concentration enzymatique. Avec l’intensité du signal correspond à l’activité enzymatique.

Dans cet exemple de test utilisé pour le criblage enzymatique, une endo-cellulase a été testée à trois concentrations contre différents substrats CPH. Comme on le voit ici, une activité supplémentaire à celle de la cellulase a été observée pour le CPH-glucane, le CPH-xylan, le CPH-xyloglucan et une faible activité a été observée contre le CPH-galactomannane. Les mêmes substrats CPH ont été digérés avec des enzymes disponibles dans le commerce utilisées comme témoins positifs dans les mêmes conditions.

Les résultats montrent ici que tous les substrats ont été dégradés à des niveaux qui augmentaient avec l’augmentation des concentrations enzymatiques. Dans cette expérience, cinq substrats ICB ont été inclus avec 19 substrats CPH pour analyser les enzymes sécrétées de Phanerochaete chrysosporium dans trois conditions de pH différentes. Les enzymes de P. chrysosporium ont dégradé divers glucanes, amidons et xylanes.

Des signaux plus faibles ont pu être détectés pour les hémicelluloses arabinane et pectique galactane ainsi que pour le RGI. Les enzymes produites étaient plus actives dans des conditions acides que dans des conditions neutres ou légèrement basiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure, si elle est exécutée correctement.

Lors de cette tentative, il est important de ne pas oublier de mélanger la réaction pendant l’incubation. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du criblage à haut débit pour explorer de nouvelles activités enzymatiques pour la biotechnologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation du kit de dépistage.