Criblage à haut débit d'Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits
20 septembre 2016
Un test à haut débit pour le criblage enzymatique est décrit. Ce kit de dosage multiplexé prêt à l’emploi comprend des substrats pré-choisis de l’iomasseB hromogèneC (CPH) et des substrats complexes Inon solubles de l’iomasse Bhromogène (ICB). Les enzymes cibles sont les endoenzymes et les protéases qui dégradent les polysaccharides.
L’objectif global de ce test chromogène est de cribler diverses enzymes dans un format à haut débit contre une sélection de différents substrats chromogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte d’enzymes, telles que la découverte de nouvelles activités enzymatiques pour la dégradation de la biomasse. Le principal avantage de cette technique est que les substrats chromogènes sont disponibles en quatre couleurs différentes, ce qui rend cette technique à haut débit, extrêmement fiable et rentable.
Pour commencer, activez la plaque du kit de dosage du filtre à 96 puits en ajoutant 200 microlitres de solution d’activation à chaque puits. Incuber à température ambiante sans agitation pendant 10 minutes. Utilisez une centrifugeuse et n’importe quelle plaque standard à 96 puits pour la collecte.
Pour faire tourner la solution d’activation existante, ajoutez 100 microlitres d’eau stérile aux substrats d’hydrogel ou de CPH en polymère chromogène et appliquez un vide ou une rotation pour retirer le stabilisant. Répétez le lavage deux fois de plus. Pour préparer la réaction enzymatique, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 mM, un pH de 4,5 et 5 microlitres de solution d’endocellulase avec trois concentrations différentes dans chaque puits de la plaque du kit de dosage.
Placez la plaque de produit sous la plaque du kit de test pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de réaction pendant l’agitation. Ensuite, incubez la plaque du kit de dosage à température ambiante dans un agitateur horizontal à 100 tr/min pendant 30 minutes. Pour recevoir des données fiables, il est nécessaire d’agiter le mélange réactionnel pendant l’incubation.
Placez la plaque du kit de dosage avec la plaque de produit en dessous dans la centrifugeuse et faites tourner à 2 700 x g pendant 10 min. Pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit. Après l’essorage, inspectez visuellement la plaque du produit pour vérifier si le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même.
À l’aide d’un lecteur de plaques, lire l’absorbance de la plaque collectrice à 630 nm pour les différents substrats CPH verts. Analysez et tracez les données selon le protocole texte. Pour effectuer le dosage chromogène avec de la biomasse chromogène rouge insoluble ou de la paille de blé ICB, commencez par ajouter 200 microlitres de solution d’activation dans chaque puits de la plaque de test.
Ensuite, incubez la plaque à température ambiante sans agitation pendant 10 minutes. Retirez le stabilisant en utilisant 100 microlitres d’eau stérile pour laver les puits trois fois. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 mM pH 4,5 et 5 microlitres de 10 unités par millilitre de solution d’endo-xylanase différente.
Positionnez la plaque de produit sous la plaque de substrat pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de substrat pendant l’agitation. Incuber la réaction à température ambiante à 100 tr/min pendant deux heures. Après l’incubation, placez la plaque du kit de dosage avec la plaque de produit en dessous dans la centrifugeuse et tournez-la à 2, 700 x g pendant 10 min pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit.
Vérifiez que le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même. Ensuite, à l’aide d’un lecteur de plaques, on lit l’absorbance de la plaque de collecte à 517 nm pour la paille rouge ICB-blé. Effectuer l’analyse des données selon le protocole texte.
Voici un exemple d’une relation dose-réponse entre le CPH-arabinoxylan et la xylanase à différentes concentrations de l’enzyme où la diminution de la concentration enzymatique peut être observée visuellement. Une quantification spectrophotométrique plus détaillée est utilisée pour tracer l’absorbance en fonction de la concentration enzymatique. Avec l’intensité du signal correspond à l’activité enzymatique.
Dans cet exemple de test utilisé pour le criblage enzymatique, une endo-cellulase a été testée à trois concentrations contre différents substrats CPH. Comme on le voit ici, une activité supplémentaire à celle de la cellulase a été observée pour le CPH-glucane, le CPH-xylan, le CPH-xyloglucan et une faible activité a été observée contre le CPH-galactomannane. Les mêmes substrats CPH ont été digérés avec des enzymes disponibles dans le commerce utilisées comme témoins positifs dans les mêmes conditions.
Les résultats montrent ici que tous les substrats ont été dégradés à des niveaux qui augmentaient avec l’augmentation des concentrations enzymatiques. Dans cette expérience, cinq substrats ICB ont été inclus avec 19 substrats CPH pour analyser les enzymes sécrétées de Phanerochaete chrysosporium dans trois conditions de pH différentes. Les enzymes de P. chrysosporium ont dégradé divers glucanes, amidons et xylanes.
Des signaux plus faibles ont pu être détectés pour les hémicelluloses arabinane et pectique galactane ainsi que pour le RGI. Les enzymes produites étaient plus actives dans des conditions acides que dans des conditions neutres ou légèrement basiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure, si elle est exécutée correctement.
Lors de cette tentative, il est important de ne pas oublier de mélanger la réaction pendant l’incubation. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du criblage à haut débit pour explorer de nouvelles activités enzymatiques pour la biotechnologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation du kit de dépistage.
Aperçu
Cet article décrit un dosage chromogène à haut débit pour le criblage enzymatique utilisant des substrats multiplexés. Le kit de dosage comprend des substrats de gel hydrogel polymère chromogène (CPH) et de biomasse chromogène insoluble (ICB) destinés à tester les endoenzymes dégradant les polysaccharides ainsi que les protéases.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Screening enzymatique
- Biotechnologie
- Dosages à haut débit
Contexte
- La découverte d'enzymes est cruciale pour diverses applications, notamment la dégradation de la biomasse.
- Les substrats chromogènes permettent un suivi visuel de l'activité enzymatique.
- Le test est conçu pour être fiable et peu coûteux.
- Différents substrats offrent une gamme de couleurs permettant une analyse améliorée.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de tester des enzymes contre divers substrats.
- Identifier de nouvelles activités enzymatiques impliquées dans la dégradation de la biomasse.
- Faciliter le criblage à haut débit dans la recherche sur les enzymes.
Méthodes utilisées
- Activation d'une plaque de kit d'essai à filtre de 96 puits à l'aide d'une solution d'activation.
- Incubation des réactions enzymatiques dans des conditions contrôlées.
- Utilisation d'une centrifugeuse pour la collecte du produit.
- Mesure de l'absorbance à des longueurs d'onde spécifiques pour l'analyse des données.
Résultats principaux
- Des activités enzymatiques ont été observées pour divers substrats de CPH et de ICB.
- Des concentrations enzymatiques plus élevées ont conduit à une dégradation accrue du substrat.
- Différents substrats ont présenté des niveaux variables d'activité enzymatique.
- Les conditions acides ont amélioré l'activité enzymatique par rapport aux conditions neutres ou basiques.
Conclusions
- Cet essai offre une plateforme robuste pour le criblage enzymatique.
- Il permet aux chercheurs d'explorer efficacement de nouvelles activités enzymatiques.
- La maîtrise de la technique permet une exécution rapide en moins d'une heure.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle
Le criblage enzymatique à haut débit fait face à des goulots d'étranglement liés à la disponibilité des substrats et à l'extensibilité des tests, limitant ainsi la caractérisation fonctionnelle rapide des enzymes agissant sur les glucides (CAZymes), essentielles pour les applications industrielles dans les secteurs des biocarburants, du textile et de l'alimentation. Ce test chromogénique comble cette lacune technologique en permettant des essais multiplexés de substrats codés par couleur dans un format 96 puits, améliorant la fiabilité prédictive lors de la découverte précoce d'enzymes et soutenant les décisions d'orientation (go/no-go) dans les chaînes d'ingénierie enzymatique. La méthode renforce la continuité translationnelle, de l'identification de cibles à une validation de type préclinique, en fournissant des lectures quantitatives et reproductibles de l'activité sur une grande diversité de substrats polysaccharidiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation fonctionnelle de CAZymes putatives en associant des candidats génétiques à une activité biochimique sur des substrats polysaccharidiques définis.
- Valeur opérationnelle : Favorise un test rapide d'hypothèses grâce à des substrats CPH multiplexés par couleur, augmentant le débit de criblage sans compromettre la fiabilité des données.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant l'activité enzymatique dépendante de la dose, aidant ainsi à la priorisation des cibles dans le développement d'enzymes industrielles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des substrats chromogènes insolubles normalisés (CPH et ICB) qui imitent la biomasse complexe, permettant des évaluations d'activité pertinentes sur le plan physiologique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à des étapes normalisées d'activation, de lavage et de centrifugation, réduisant ainsi la variabilité dans les flux de travail à haut débit.
- Valeur en termes d'évolutivité : Compatible avec les lecteurs de plaques standard en 96 puits et les systèmes de manipulation de liquides, permettant une intégration dans les plates-formes existantes d'évaluation de cocktails enzymatiques ou de bouillons.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en testant l'activité enzymatique dans différentes conditions de pH, reflétant ainsi les environnements de procédés industriels.
- Valeur opérationnelle : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en corrélant la concentration enzymatique à la dégradation du substrat à travers plusieurs types de biomasse (par exemple, paille de blé, glucanes, xylanes).
- Valeur prédictive : Améliore l'alignement des biomarqueurs translationnels en identifiant les profils d'activité dépendants du pH, essentiels à la stabilité des formulations dans des applications détergentes ou liées aux biocarburants.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité entre la phase de découverte précoce et l'identification de candidats, en soutenant la vérification d'hypothèses, la clarification des voies métaboliques et la réduction des risques biologiques associés aux enzymes dégradant les glucides, avant tout investissement dans l'ingénierie protéique ou le passage à l'échelle de la fermentation.
- Découverte en biologie : Permet de clarifier les voies métaboliques en criblant l'activité enzymatique sur des substrats polysaccharidiques spécifiques (par exemple, CPH-glucane, CPH-xylane) afin d'inférer la spécificité du substrat et le rôle fonctionnel.
- Criblage : Offre une prête-utilisation des tests et des résultats quantitatifs par des mesures d'absorbance à 630 nm (CPH) et 517 nm (ICB), permettant une comparaison fiable de variants enzymatiques ou de différentes conditions.
- Analytique : Fournit des données de réponse dose-dépendante qui soutiennent l'analyse statistique et la sélection de résultats positifs, aidant les équipes à classer les candidats enzymatiques selon leur activité et leur spécificité.
- Recherche translationnelle : Assure le lien entre la découverte et le développement préclinique en évaluant la performance enzymatique dans des conditions industriellement pertinentes (par exemple, pH acide, substrats de biomasse complexes).
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour le criblage de bibliothèques d'enzymes, de bouillons ou de mélanges enzymatiques dans plusieurs projets au sein des industries bio-sourcées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les faux positifs grâce à la mesure directe de l'activité sur des substrats insolubles et proches de l'état natif.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à des volumes de réactifs, des durées d'incubation et des paramètres de centrifugation définis, réduisant ainsi la variabilité dépendante de l'utilisateur.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant le criblage rapide de centaines de candidats enzymatiques, réduisant le temps et les coûts associés aux essais biochimiques à faible débit.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en générant des données quantitatives d'activité qui éclairent les décisions d'avancement ou d'abandon dans les campagnes d'ingénierie enzymatique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cinétique enzymatique et en optimisation des dosages chromogéniques pour garantir une préparation précise des substrats et un suivi fiable des réactions.
- Dépend de l'accès à un lecteur de plaques capable de mesurer l'absorbance à 630 nm et 517 nm, ainsi qu'à une centrifugeuse compatible avec les plaques de 96 puits pour le transfert des produits.
- Implique une standardisation inter-équipes des conditions tampons (par exemple, acétate de sodium pH 4,5) et des paramètres d'incubation (par exemple, agitation à 100 tr/min) afin d'assurer la reproductibilité entre différents sites.
- Suppose des adaptations lors du test de substrats non polysaccharidiques, car le dosage est optimisé pour les enzymes actives sur les glucides et peut nécessiter des modifications du tampon ou du substrat pour d'autres classes d'enzymes.
- Comprend des limites pratiques, telles que l'obligation d'éviter toute agitation pendant les étapes d'activation et de stabilisation, ainsi que la nécessité de vérifier visuellement l'égalité du volume des produits après centrifugation pour une interprétation fiable des données.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
