Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide

L’objectif global de cette méthode FINA, qui signifie filtration et isolement des acides nucléiques, est d’isoler rapidement et simplement l’ADN génomique pour l’amplification par PCR à partir d’échantillons complexes, sans utiliser d’instruments de laboratoire tels qu’une centrifugeuse. Cette méthode d’extraction rapide de l’ADN proviral du VIH sur papier a été mise au point pour être incorporée dans un dispositif de diagnostic PCR quantitatif. Le principal avantage de cette technique est que les modules de préparation des échantillons et les tubes PCR peuvent être préparés à l’avance, de sorte que l’extraction de l’ADN prend moins de deux minutes.

Nous avons d’abord développé cette méthode pour l’incorporer dans un échantillon afin de répondre au test de diagnostic précoce du VIH-1 chez le nourrisson à partir de sang au talon. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car il faut de la pratique pour retirer le support du ruban adhésif double face qui maintient la membrane de capture cellulaire sur le côté du tube PCR. Jen Reed, une technicienne principale de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Commencez cette procédure en préparant les matériaux nécessaires à l’assemblage du module de préparation d’échantillons FINA. Préparez le tampon buvard en coupant un carré de 35 x 35 millimètres d’un tampon 100 % coton de 2,6 millimètres d’épaisseur. Préparez un film de paraffine plastique avec un ruban adhésif en papier.

Coupez un morceau de film de paraffine de 25 x 50 mm, puis utilisez un marteau pour percer un trou de 7,14 mm de diamètre au centre du ruban. Préparez une membrane séparatrice de sang en verre lié ou un disque de capture en utilisant un marteau pour perforer un cercle de 8,35 mm de diamètre. Pour assembler le module de préparation d’échantillons FINA, utilisez une pince pour placer le disque de capture au centre du tampon buvard.

Retirez le support de la bande de paraffine et placez-le sur le disque de capture de sorte que l’ensemble de la bande de paraffine laisse le centre du disque de capture exposé. Assurez-vous d’un contact maximal entre le disque et le tampon buvard en étirant légèrement la bande de paraffine pour couvrir le tampon de transfert et en appuyant fermement sur la bande de paraffine pour la coller au tampon de transfert sur tous les bords du disque. Un disque de bande de 5,1 mm est nécessaire pour ancrer la membrane de capture sur le côté du tube qPCR afin d’éviter que la membrane ne bloque la détection de fluorescence de l’instrument de PCR en temps réel.

Préparez ce disque de ruban à l’aide d’un marteau pour perforer un cercle de ruban de diagnostic en polyester double face à partir d’une feuille de ruban. À l’aide d’une pince, retirez un côté de la doublure de l’autocollant de ruban. Placez le ruban dans un tube PCR de 200 microlitres, en le collant d’un côté et vers le bas du tube.

Retirez la deuxième doublure de l’autocollant. Le tube est maintenant prêt à recevoir le disque préparé. La détection de l’ADN proviral à partir de sang total enrichi de cellules LAV 8e5 sera démontrée dans cette vidéo.

Décongelez les pastilles de cellules 8e5 LAV précédemment congelées sur de la glace. Préparez une dilution en série des cellules dans un milieu de congélation avec des concentrations allant de 1 à 400 cellules par microlitre. Pipeter 10 microlitres de cellules de chacune des dilutions dans un microtube à centrifuger.

Ajoutez 100 microlitres d’échantillon de sang total frais traité eDTA séronégatif au VIH-1 dans chaque tube pour créer une courbe standard. Mélangez en remuant doucement le fond du tube cinq fois. Pour commencer la procédure d’extraction de l’ADN, lysez les cellules sanguines en ajoutant du triton X-100 à une concentration finale d’un pour cent.

Mélangez en remuant doucement le fond du tube cinq fois. Le sang doit devenir rouge translucide. Pipetez l’échantillon de sang entier sur le disque de capture.

Un joint étanche entre la bande de paraffine et la membrane de capture assure la circulation du sang à travers la membrane. Et un bon contact entre la membrane de contact et l’ensemble du tampon buvard assure une évacuation rapide de l’échantillon. Laissez l’échantillon tremper à travers le filtre.

Le lysat de sang s’est infiltré dans le disque de capture et le disque apparaît mat. Ajoutez 600 à 1 000 microlitres de 10 mmol d’hydroxyde de sodium goutte à goutte sur le disque de capture. Le filtre passera du rouge au blanc, indiquant l’élimination de l’hémoglobine.

Ensuite, séparez le disque du tampon buvard et appliquez le disque sur le ruban dans le tube PCR préparé. Une fois le filtre placé dans le tube PCR, analysez immédiatement l’échantillon. Préparez le mélange maître qPCR comme décrit dans le texte du protocole et assurez-vous que le filtre est complètement recouvert du mélange maître et reste fixé sur le côté du tube tout au long de la réaction.

Effectuez une amplification à l’aide d’un appareil de PCR en temps réel, comme décrit dans le texte du protocole. Sinon, si la qPCR ne peut pas être effectuée, séchez immédiatement le filtre pendant la nuit dans une boîte contenant du dessicant de sulfate de calcium. Le lendemain, bouchez et placez le tube PCR dans un sachet recouvert d’un dessicant de silice et conservez-le à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’analyse.

Cette méthode permet une amplification efficace du provirus VIH-1 à partir de cellules 8e5 LAV à différents nombres de copies. Les lignes pleines sont des graphiques d’amplification obtenus à partir de quatre répétitions de sang total négatif pour le VIH-1 enrichies de 4 000, 400, 40 et 10 cellules LAV 8e5 avec 500 copies par réaction du témoin interne. La ligne pointillée indique le seuil.

Le graphique suivant montre les courbes standard des valeurs du cycle de quantification calculées à partir du graphique d’amplification vs. log nombre de copies de cellules LAV 8e5 pour 100 microlitres de sang total. L’efficacité calculée de la PCR était de 103 %Les répliques de la courbe standard de l’ADN proviral du VIH ont également une amplification hautement reproductible.

De plus, la présence d’un contrôle interne de 500 copies de l’hydroxypyruvate réductase montre qu’il n’y a pas d’inhibition de la PCR résultant de l’extraction du sang avec cette méthode, indépendamment du nombre de copies du provirus VIH-1 présentes. Les lignes pleines représentent les tracés d’amplification et la ligne pointillée représente le seuil. Suite à cette procédure, les cibles PCR peuvent être amplifiées à partir de différents types d’échantillons pour détecter le gène qui vous intéresse.

Par exemple, des écouvillons de joue pour le dépistage pharmacogénétique ou du sang pour le génotypage rapide de modèles animaux. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes transmissibles par le sang peut être extrêmement dangereux et que des précautions universelles doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.