Name: Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez la visualisation de la liaison du VIH-1 Gag sur des membranes de vésicules géantes unilamellaires. Cette méthode permet d'étudier les interactions lipidiques et les mécanismes d'assemblage viral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Mohammad Saleem, Jing Wu et Krishnan Raghunathan pour des discussions utiles. Nous remercions également Priya BEGANI d&#39;assistance pendant le tournage. Ce travail est soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 AI071727 (AO) et R01 GM110052 (SLV).

Jour 1: Expression des protéines Gag Utilisation de la transcription in vitro traduction-based System-Lysate Germe de blé 1. Préparation du VIH-1 gag <ol><li> Retirez tous les réactifs du kit de CECF de germe de blé commercial de congélateurs (lysats de germe de blé sont stockés à -80 ° C, d&#39;autres réactifs à -20 ºC). Décongeler sur la glace et mélanger les composants comme indiqué dans le tableau 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (alimentation mix) </td><td></td></tr><tr><td> solution d&#39;alimentation </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Acides aminés </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> méthionine </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1000 pi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (Lysate mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> Des lysats de Germe de Blé </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase eau libre </td><td> 7 pi </td></tr><tr><td> Acides aminés </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> méthionine </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> L&#39;ADN de plasmide dans le tampon TE (1 pg / pl) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> un tampon de réaction </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Compositions contenant des mélanges nécessaires pour les réactions de germe de blé. Remarque: Si l&#39;expérience est conçue pour examiner l&#39;effet de l&#39;élimination de l&#39;ARN par la RNase sur la membrane Gag de liaison, remplacer des inhibiteurs de ribonucléase avec de l&#39;eau sans RNase. L&#39;ADN plasmidique doit être exempt d&#39;impuretés selon les instructions du fabricant. Cependant, plasmids préparés en utilisant classique, mais non, des kits d&#39;isolement de plasmide endotoxine libres ont été utilisés avec succès. L&#39;instruction du fabricant recommande également d&#39;utiliser l&#39;ADN dissous dans l&#39;eau sans nucléase. Si l&#39;on utilise l&#39;ADN en suspension dans du TE [10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) contenant 1 mM d&#39;EDTA], éviter d&#39;utiliser des concentrations plus faibles d&#39;ADN, étant donné que l&#39;EDTA dans du TE peut affecter le rendement. Plasmides dissous dans du tampon TE à une concentration de 0,8 à 1 ug / ul ont été utilisés avec succès. <ol start="2"><li> Tout d&#39;abord ajouter le mélange d&#39;alimentation (Mix-1) dans la cassette de réaction (chambre transparente). Ensuite, ajouter le mélange de lysat (Mix-2) à l&#39;autre chambre (rouge). Ne pas introduire de bulles tout en ajoutant les mélanges dans leurs chambres respectives, puisque cela peut conduire à un échange inefficace des composants de la solution et donc de réduire l&#39;efficacité de la réaction. </li><li> Couvrir les chambres avec le film adhésif fourni avec le kit. </li><li> Insérer la cassette de réaction dans le support de cassette et incubate l&#39;ensemble pendant 24 heures à 24 ° C à une vitesse de agitation constante de 900 tours par minute dans un Eppendorf thermomixer R. </li></ol> Jour 2: Préparer GUVs par électroformation et récolte Germe de Blé lysats 2. Préparation de GUVs <ol><li> lipides aliquotes dissous dans des solvants organiques tels que le chloroforme ou des mélanges de chloroforme et de méthanol dans des flacons en verre avec bouchons à vis bordées de doublures en téflon et enveloppés avec du Parafilm. Manipuler les lipides avec des seringues en verre de type Hamilton, ou le cas échéant, des conseils en plastique chloroforme résistant. Sortir des flacons en verre contenant les lipides à utiliser pour la préparation des GUV du congélateur à -20 ° C. <ol><li> Une fois les flacons sont amenés à température ambiante, assurez-vous par une inspection visuelle que les suspensions lipidiques sont claires. La qualité des lipides, en particulier des lipides acides, tels que le palmitoyl-oléoyl phosphatidylsérine (POPS) et PI (4,5) P2, est important pour des expériences réussies. Ne pas utiliser les lipides qui sonten aliquotes pendant plus de 2 mois. </li></ol></li><li> Préchauffer un bloc chauffant à la température désirée. Cette température doit être d&#39; au moins 5 ° C supérieure à la température de fusion (Tm) du lipide (s) avec la plus haute Tf. </li><li> Calculer les volumes de lipides nécessaires en fonction des rapports molaires désirés lipidiques. Pour étudier la liaison ici Gag VIH-1, en ​​utilisant les rapports molaires suivants , comme indiqué dans le tableau 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lipid mix </td><td> Rapport molaire </td><td> Volume (en ul) </td><td> Concentration en Stock </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8,3 + 6,25 + 58.19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Du cerveau PI (4,5) P2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Les volumes de différents lipides utilisé pour obtenir GUVs. <ol start="4"><li> Ajouter les volumes souhaités de lipides dans un propre flacon de verre à bouchon à vis. </li><li> Diapositives de dimensions 25 x 50 x 1,1 mm 3 et la résistance 70-100 Ohm (comme décrit dans le catalogue) Utilisation ITO-enduit. Placez deux diapositives ITO revêtus sur un banc propre. Chaque chambre de électroformation nécessite deux indium-étain (ITO), les lames de verre revêtues d&#39;. Vérifiez que le côté conducteur de la lame de verre est orientée vers le haut en vérifiant la résistance à l&#39;aide d&#39;un multimètre. Elle doit montrer une valeur d&#39;environ 200 Ω. Assurez-vous que la surface des lames sont propres en essuyant doucement avec 70% d&#39;éthanol en utilisant des lingettes non pelucheux. </li><li> Nettoyer la surface extérieure d&#39;une aiguille d&#39;une seringue par riNsing avec du chloroforme et placer la seringue dans le bloc thermique. </li><li> Placez une nouvelle lame de verre revêtu d&#39;ITO sur le bloc thermique avec le côté conducteur vers le haut et le laisser se stabiliser à la température désirée habituellement environ 2-3 min. Ne pas réutiliser les lames de verre ITO revêtus d&#39;un risque potentiel que l&#39;ITO-revêtement sur les lames de verre pourrait être endommagé pendant les procédures de nettoyage. </li><li> Utiliser un volume de 40-50 ul du mélange lipidique pour chaque diapositive pour l&#39;instant uniforme et rapide étalement des lipides sur la lame de verre. Ajuster le volume total avec un solvant organique approprié tel que le chloroforme. <ol><li> Placer une moitié du volume total du mélange de lipides sur la lame de verre et de se propager immédiatement le lipide en utilisant la seringue nettoyé (étape 2.6) pour laisser un film lipidique uniforme (déplacer l&#39;aiguille 2-3 fois à travers la lame). Étaler le film lipidique doucement (mais rapidement) pour éviter tout dommage à la couche d&#39;ITO mince. Non uniforme épandage ou épandage rugueuse peut conduire à sous-optimalerendements ou hétérogénéité de calcul des GUVs. </li><li> Par conséquent, d&#39;assurer la propagation uniforme en inspectant le film lipidique après se propager avant de passer à l&#39;étape suivante. Si l&#39;opacité du film apparaît trop non uniforme, refaire la procédure en utilisant une nouvelle diapositive. </li></ol></li><li> Placez la lame enduite dans une boîte de Pétri avec la face enduite vers le haut. </li><li> Répétez les étapes 2,6-2,9 pour le reste du mélange en utilisant une autre lame revêtu d&#39;ITO. </li><li> Placez la boîte de Pétri contenant à la fois les lames dans une chambre de dessiccation à vide classique pour 60-90 min pour éliminer toute trace de solvants organiques. </li><li> Pendant ce processus, mettre l&#39;incubateur à la même température que celle du bloc de chaleur (65 ° C dans la plupart des cas) et pré-chauds 300 mM de solution de saccharose dans l&#39;incubateur. </li><li> Après séchage, mettre la boîte de Pétri sur le banc et placer la lame de verre sur une surface propre. </li><li> Nettoyez délicatement un joint de PDMS (figure 1) en utilisant 70% d&#39; éthanol et il comple secdiatement. </li><li> Placez - le sur la lame de verre lipidique revêtu comme le montre la Figure 1 et doucement et fermement appuyez sur afin que les formes de joint un joint étanche à l&#39; eau. Confirmer l&#39;absence d&#39;écarts entre le joint PDMS et la glissière. Il en résulte la formation d&#39;une chambre peu profonde qui retient la solution de saccharose. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figure 1:. La disposition de la lame de verre revêtu d&#39; ITO utilisé pour électroformation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="16"><li> Remplir la chambre avec une solution de saccharose préchauffée sans bulles. </li><li> Placez l&#39;autre lame enduite sur le dessus pour faire un joint étanche. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles. L&#39;assemblage final doit apparaître comme le montre la figure 2. Fixer le usin de chambreclips g de liant. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figure 2:. Représentation schématique de la chambre de électroformation (vue de côté) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="18"><li> Enlever l&#39;excès de saccharose par aspiration et nettoyer les lames à l&#39;aide de lingettes non pelucheux. Fixer les lames à la barre de cuivre de sorte que les côtés conducteurs sont en contact uniforme avec la barre. Faire en sorte que d&#39;un seul côté conducteur de la lame de verre est en contact avec une barre de cuivre. </li><li> Connectez la barre de cuivre à la sortie du générateur de fonction à l&#39;aide des pinces crocodiles. Placer l&#39;assemblage à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur pour permettre à l&#39;ensemble à équilibrer à la température désirée. </li><li> Appliquer une fréquence d&#39;une onde sinusoïdale de 10 Hz et une différence de potentiel de 1 V pendant 90 min. Ensure que la tension est de 1 V par un multimètre comme représenté sur la figure 3. Poursuivre le processus pendant 90 minutes. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figure 3:. Les positions auxquelles les électrodes du multimètre sont placés pour mesurer la fréquence et le courant <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="21"><li> Après 90 minutes, réduire lentement la fréquence de 2 Hz et continuer électroformation pendant 10 minutes supplémentaires. Pendant ce temps, la récolte dans les réactions de traduction in vitro (étapes 3.1 à 3.2). </li><li> Eteindre le générateur de fonction et de permettre l&#39;assemblage refroidir à température ambiante lentement (en éteignant l&#39;incubateur et en laissant la porte de l&#39;incubateur légèrement ouverte). </li><li> Après refroidissement, débrancher les câbles du générateurdes assemblages de glissières. GUVs peut être très fragile et doivent donc être manipulés avec beaucoup de douceur. Ramener ensuite avec précaution l&#39;ensemble sur le banc. </li><li> Démonter la chambre en retirant doucement la lame supérieure en utilisant une pince. Récolter la suspension contenant GUVs de saccharose à l&#39;aide d&#39;une pointe de pi coupé 1000 et le transfert dans un tube propre. Manipuler le tube doucement pour éviter la perturbation de GUVs. </li><li> Utiliser immédiatement les GUVs. GUVs sont stables pendant au moins 90 minutes après la récolte lorsqu&#39;elle est conservée à la température ambiante. </li></ol> 3. Récolte in vitro traduction Réactions <ol><li> Récolter les réactions de traduction in vitro contenant des protéines désirées de la chambre rouge à l&#39; aide d&#39; une micropipette dans un tube. </li><li> Pour éliminer les protéines agrégées, tourner les lysats à 16.200 xg pendant 15 min dans une centrifugeuse de table et transférer soigneusement le surnageant dans un autre tube. </li></ol> 4. Essai de liaison GUV <ol><li> En utilisant une pointe de coupe, mélanger 51; l des réactions de traduction in vitro contenant des protéines traduites et 5 ul de GUVs dans un tube et incuber à température ambiante pendant 2-3 min. </li><li> Joindre une feuille de PDMS avec un petit trou (diamètre 3-4 mm) sur une lamelle propre et assurer l&#39;étanchéité par doucement et fermement le pressant contre la lamelle. </li><li> Placer le mélange de 10 pi de l&#39;étape 4.1 dans le petit trou. </li><li> L&#39;image du mélange sous un microscope à fluorescence confocale inversée épi- ou à la température ambiante. Remarque: Pour éviter l&#39;évaporation, la chambre d&#39;imagerie peut être couverte par une lamelle. </li></ol>

<ol><li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li>
<li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li>
<li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li>
<li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+%284%2C5%29+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li>
<li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li>
<li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li>
<li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li>
<li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li>
<li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li>
<li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202(2014).</li>
<li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li>
<li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li>
<li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li>
<li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li>
<li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation%3A+a+comparison+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li>
<li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li>
<li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles%3A+perspectives+for+membrane+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li>
<li>Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polymer+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li>
<li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-%284%2C5%29-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li>
<li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUV+preparation+and+imaging%3A+minimizing+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li>
<li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li>
<li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxides+promote+large+rafts%3A+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li>
<li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li>
<li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li>
<li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li>
<li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li>
<li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li>
<li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529(2015).</li>
</ol>

Nous déclarons que nous n’avons pas d’intérêts conflictuels.

L&#39;essai de liaison de GUV tel que décrit ci-dessus donne une bonne alternative dans des scénarios où d&#39;autres dosages d&#39;interactions protéine-lipide ont leurs limites. Ce test nous permet d&#39;examiner les interactions entre les myristoylée Gag pleine longueur et des lipides acides avec des chaînes acyles native de longueur dans le contexte de la bicouche lipidique et faire sans de longues flottation centrifugation à travers à haute densité des gradients de saccharose ou d&#39;autres traitements post-liaiso...

l&#39;immunodéficience humaine et le virus de type 1 (VIH-1) est un virus enveloppé qui se réunit à partir des bourgeons et la membrane plasmique (PM) dans la plupart des types de cellules. L&#39;assemblage du VIH-1 des particules virales est entraîné par la protéine virale du noyau 55 kDa , appelée Pr55 Gag (GAG). Gag est synthétisée sous la forme d&#39;une polyprotéine précurseur composée de quatre domaines structuraux principaux, à savoir, la matrice, capside et nucléocapside, p6, ainsi que deux peptides espaceurs SP1 et SP2. Lors de l&#39;assemblage, la matrice (MA) domaine est responsable pour le ciblage de Gag sur le site d&#39;assemblage, la capside (CA) domaine médiatise interactions-Gag Gag, la nucléocapside (NC) domaine recrute ARN génomique viral, et les facteurs p6 recrues d&#39;accueil que l&#39;aide scission de la particule virale à partir de la membrane plasmatique. Gag subit également une modification de la co-traductionnelle par l&#39;addition d&#39;un acide gras à 14 carbones ou un fragment myristate à son extrémité N-terminale. liaison de Gag membrane est une condition essentielle pour l&#39;assemblage viral, puisque mutants qui sont défectueux dans la liaison membrane ne parviennent pas à produire des particules de virus. Nous et d&#39;autres ont montré que la liaison de Gag est médiée par des signaux bipartites au sein du domaine MA membrane: le fragment myristate N-terminale qui médie les interactions hydrophobes avec la bicouche lipidique et un groupe de résidus basiques au sein du domaine MA qualifié de région hautement basique ( HBR) qui interagit avec les lipides acides de la PM 1-4. Des études d&#39;interactions Gag-membrane en utilisant l&#39; expression ectopique de polyphosphoinositide 5 phosphatase IV (5ptaseIV), une enzyme qui catalyse l&#39;hydrolyse du phospholipide acide phosphatidylinositol- PM-spécifique (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] à phosphatidylinositol-4-phosphate, dans les cellules suggère que Gag-PM localisation est médiée par PI (4,5) P2 3,5. Cependant, des études in vitro visant à comprendre les détails plus mécanistes de Gag-PI (4,5) P 2 interactions se sont révélés être difficile pour un certain nombre de raisons. Pourpar exemple, la purification de pleine longueur myristoylés Gag VIH-1 pour des expériences biochimiques a été techniquement difficile au moins en partie en raison de la tendance de Gag à agréger lors de la purification. Par conséquent, des formes tronquées de HIV-1 Gag, comme Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou la forme non-myristoylés ont été fréquemment utilisés dans les études qui nécessitent une purification Gag (par exemple, la résonance magnétique nucléaire, la protéine empreinte, et la surface résonance plasmonique 6-9). Alternativement, couplée à des réactions de transcription-traduction in vitro ont été utilisés pour produire toute la longueur myristoylés Gag VIH-1 dans d&#39; autres études biochimiques 1,2. Typiquement , dans ce système, un plasmide codant pour Gag est transcrit et traduit avec des lysats de cellules eucaryotes (par exemple, les lysats de réticulocytes de lapin) qui sont dépourvues de membranes cellulaires et les ARN messagers , mais qui contiennent la machinerie de la transcription et de la traduction. Après la réaction, les lysats cellulaires contenant Gag sont mélangés avec moimbranes pour l&#39;analyse des interactions Gag avec des lipides. En plus de la facilité de préparation de pleine longueur myristoylés Gag, les méthodes utilisant le système de traduction de transcription in vitro ont un avantage que la synthèse Gag et des réactions de liaison de la membrane subséquente se produisent dans un milieu &quot;cytosol ressemblant eucaryote» qui peuvent mieux représenter les conditions physiologiques. Cette propriété a contribué aux études qui ont montré que les molécules d&#39;ARN liés au domaine de MA régulent la liaison Gag aux lipides acides d&#39;une manière compétitive 1,2,10-12. Toutefois, étant donné que la quantité totale de protéines Gag obtenues dans ces lysats cellulaires ne sont pas élevés, marquage métabolique des protéines avec des acides aminés radiomarqués est nécessaire pour leur détection. En fonction de la méthode pour mesurer les interactions Gag-lipide, une variété de préparations de membranes ont été utilisés. Chacune de ces méthodes a ses forces et ses limites. La plupart des dosages à base de RMN nécessitent l&#39;utilisation de lipides avec un groupe acyle courtles chaînes qui sont (C8-PI (4,5) P 2 par exemple, C4- et) 6,8 soluble dans l&#39;eau. Bien que les méthodes de RMN pour tester la liaison de Gag aux lipides qui ont des chaînes acyles longues trouvés dans les cellules sont en cours d&#39; élaboration, ils ont été utilisés uniquement avec myristoylée ou nonmyristoylated MA jusqu&#39;à 8,13. En variante, les liposomes préparés à partir de lipides qui ont des chaînes acyles longueur natives ont été utilisées dans des procédés biochimiques telles que la flottation des liposomes ou des liposomes fluorescents perles de dosages de liaison 2,3,10,14-16. Cependant, les liposomes utilisés dans ces essais ont de petits diamètres et, par conséquent leurs membranes présentent des courbures fortes et positives. En revanche, au cours de la première phase de l&#39;assemblage des particules dans les cellules du VIH-1-infected, Gag se lie à la PM, qui est presque plane sur l&#39;échelle de Gag, et par la suite induit une courbure négative au cours de bourgeonnement. Par conséquent, les membranes de liposomes avec forte courbure positive et pourraient ne pas être bicouches lipidiques idéales pour étudier les interactions Gag-lipidique. Pour ce qui est des liposomes Flotessais de ation, une autre mise en garde potentiel est que l&#39;exposition des complexes Gag lipidiques à gradient de saccharose hypertonique pendant la centrifugation peut influer sur le résultat expérimental. Pour pallier ces limitations et de fournir un système expérimental complémentaire, des dosages pour la liaison à Gag vésicules géantes unilamellaires (GUVS) ont été développées ces dernières années. GUVs sont des vésicules bicouches lipidiques simples dont les diamètres s&#39;étendre à plusieurs dizaines de micromètres. Ainsi, la courbure de ces membranes ressemble à la PM à l&#39;échelle de Gag. En outre, en raison de sa grande taille, ce qui permet une inspection visuelle au microscope optique, la liaison membrane protéines Gag de fluorescence marqués ou étiquetés à ces vésicules lors du mélange peut être facilement déterminée sans traitement ultérieur des complexes Gag-lipidiques. Nous décrivons ici un protocole pour étudier le VIH-1 Gag membrane de liaison utilisant GUVs obtenus à partir d&#39;une méthode de électroformation. Diverses méthodes telles que l&#39;hydratation douce, hydratation assistée gel, microlançage rofluidic et électroformation 17-22 ont été utilisées pour obtenir GUVs. Pour le protocole décrit ici, le procédé de électroformation est utilisé principalement en raison de son efficacité dans la formation GUVs avec des lipides acides et sa relative facilité d&#39;utilisation sans la nécessité d&#39;installations coûteuses. Etant donné que la visualisation de Gag nécessite un rapporteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP) est génétiquement ajouté à l&#39;extrémité C-terminale de gag (Gag-YFP). Protéines Gag-YFP sont obtenus par des réactions in vitro de transcription et de traduction dans de blé lysats germinales en fonction du débit (CECF) la technologie d&#39;échange continu continu. Dans cette technologie, à la fois l&#39;élimination des sous-produits inhibiteurs des réactions et la fourniture de substrats de réaction et les composants d&#39;énergie sont réalisées dans un mécanisme basé sur une dialyse. Pour ces réactions, un plasmide codant pour Gag-YFP sous le contrôle d&#39;un promoteur T7 est utilisé. Il faut noter, comme indiqué précédemment, les lysats de germe de blé supportent myristoylation sans composants supplémentaires 23,24. En utilisant cette méthode, il a été possible d&#39;obtenir des quantités suffisantes de pleine longueur myristoylés Gag-YFP pour la visualisation de Gag sur les membranes GUV 24. Nous décrivons ici le protocole avec lequel la liaison du VIH-1 Gag à PI (4,5) P2 contenant les membranes GUV peuvent être examinées sans traitement ultérieur long suivant des réactions de liaison et de proposer que cette méthode complète préexistante Gag-membrane des essais de liaison et peut être étendu pour mieux comprendre le VIH-1 Gag-membrane de liaison.

<table><tbody><tr><td>Multimètre numérique</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>Un multimètre générique capable de mesurer la résistance et les volts fera l’affaire.</td></tr><tr><td>Générateur de fonctions</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>Un générateur de fonctions générique capable de générer une onde sinusoïdale à 10 Hz et 1 V est suffisant.</td></tr><tr><td>Lames en verre revêtu d’ITO</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Tout incubateur capable de maintenir avec précision la température sera suffisant</td></tr><tr><td>Chambre à vide</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Jauge 22S, Seringue numéro 702</td></tr><tr><td></td><td>Kit de base en élastomère PDMS Sylgard, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Germe de blé Kit CECF</td><td>BiotechRabbit, Berlin, Allemagne</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&nbsp ;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Albâtre, AL&nbsp ;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Cerveau-PI(4,5)P2&nbsp ;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation du vih-1 gag reliure giant unilamellaires vésiculaires (guv) membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

La protéine structurale du VIH-1, Pr55 Gag (ou Gag) se lie à la membrane plasmatique dans les cellules au cours du processus d&#39;assemblage du virus. liaison de Gag membrane est une étape essentielle pour la formation de particules de virus, car un défaut dans les résultats de liaison de la membrane Gag en déficience grave de la production de particules virales. Pour avoir des détails mécanistiques des interactions avec la membrane lipidique Gag, des procédés in vitro basés sur la RMN, la protéine empreinte, la résonance plasmon de surface, des liposomes flottation centrifugation ou de la fluorescence des lipides bourrelet liaison ont été développés jusqu&#39;à présent. Cependant, chacune de ces méthodes in vitro a ses limites. Pour surmonter certaines de ces limitations et de fournir une approche complémentaire aux méthodes précédemment établies, nous avons développé un test in vitro dans lequel les interactions entre le VIH-1 Gag et membranes lipidiques ont lieu dans un environnement &quot;cellule-like&quot;. Dans cet essai, la liaison Gag à des membranes lipidiques est analysé visuellement à l&#39;aide YFP Taggebase de germe d Gag synthétisé dans un blé dans le système de traduction in vitro et GUVs préparés par une technique de électroformation. Nous décrivons ici le contexte et les protocoles d&#39;obtenir Myristoylated pleine longueur protéines Gag et les membranes GUV nécessaires pour le dosage et pour détecter la liaison par microscopie Gag-GUV.

<html> En utilisant le protocole ci-dessus, nous avons préparé GUVs composés de POPC + POPS + Chol (rapport molaire: 4,66: 2,33: 3). Cette composition a été choisi pour refléter approximativement les PS et le cholestérol des concentrations de PM. Robuste et liaison de Gag efficace a été observée seulement lorsque le cerveau PI (4,5) P 2 a été inclus dans le mélange POPC + POPS + Chol-PI cerveau (4,5) P 2 [rapport molaire (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] dans cet e...

Nous illustrons ici un essai de liaison membranaire in vitro dans lequel les interactions entre le Gag du VIH-1 et les membranes lipidiques sont analysées visuellement à l’aide de Gag marqué YFP synthétisé dans un système de traduction in vitro basé sur des germes de blé et de GUVs préparés par une technique d’électroformation.

Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la liaison de la protéine Gag du VIH-1 sur des membranes de vésicules unilamellaires géantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'assemblage biologique, telles que les rôles joués par les lipides possédant différentes chaînes lipidiques dans la liaison membranaire ou par des protéines virostructurales, comme les protéines Gag virales in vitro.Le principal avantage de cette technique est que la liaison de Gag à la membrane peut être détectée visuellement sur des membranes de vésicules unilamellaires géantes, directement après le mélange, évitant ainsi des étapes post-mélange potentiellement dommageables et longues. La préparation de la protéine Gag du VIH-1 est décrite dans le protocole écrit et doit être réalisée un jour avant la préparation des VUG.Sortir les stocks de lipides du congélateur et les équilibrer à température ambiante. Pendant ce temps, régler la température du bloc chauffant à au moins cinq degrés Celsius au-dessus de la température de fusion la plus élevée des lipides utilisés. Dans cette démonstration, la température est réglée à 65 degrés Celsius, la température la plus élevée que nous ayons utilisée.Les lipides doivent être dissous dans des solvants inorganiques, conservés dans des flacons en verre munis de bouchons vissés doublés de téflon, et enveloppés dans du Parafilm. Une fois décongelés, s'assurer que les suspensions sont limpides. Calculer les volumes de lipides requis selon les rapports molaires/lipides souhaités.Ensuite, aliquoter les volumes calculés dans un flacon en verre propre, à bouchon vissé, à l’aide d’un dispositif résistant au chloroforme, tel qu’une seringue en verre de type Hamilton. Ajuster le volume total avec un solvant organique approprié, comme le chloroforme. Préparer ensuite deux nouvelles lames recouvertes de ITO pour chaque chambre d’électroformation.Vérifiez que le côté conducteur de la lame est orienté vers le haut en mesurant la résistance à l’aide d’un multimètre, qui doit être d’environ 200 ohms. Ensuite, nettoyez délicatement leurs surfaces avec de l’éthanol à 70 % et des lingettes sans peluches. Puis, nettoyez la surface extérieure de l’aiguille de seringue en la rinçant avec du chloroforme, et placez la seringue sur le bloc chauffant.Placez également les lames revêtues d'ITO nettoyées sur le bloc chauffant, côté conducteur vers le haut. En quelques minutes, les lames atteindront la température. Ajoutez alors 40 à 50 microlitres du mélange lipidique sur l'une des lames.Le lipide doit être étalé rapidement, mais de manière aussi uniforme que possible. Ensuite, ajoutez un autre demi-volume du mélange lipidique sur une autre lame de verre, puis étalez-le immédiatement afin d'obtenir un film lipidique uniforme. Soyez rapide et délicat pour éviter d'endommager le fin revêtement d'ITO.Si l'opacité du film apparaît excessivement non uniforme, refaites la procédure en utilisant une nouvelle lame. Ensuite, préparez une deuxième paire de lames pour un mélange lipidique différent du premier. Une couche uniforme de lipides est nécessaire pour obtenir un rendement optimal de GUV et une uniformité compositionnelle des GUV.Conserver les lames dans une chambre à dessiccation sous vide pendant 60 à 90 minutes afin d'éliminer les traces de solvant organique. Pour l'étape suivante, régler un incubateur à la température du bloc chauffant utilisée lors des étapes précédentes, et préchauffer un stock de solution de saccharose à 300 millimolaire à cette température. Préparer également un joint en PDMS en l'essuyant délicatement avec de l'éthanol à 70 %, puis en le laissant sécher complètement.Une fois que les lames ont séché, placez-les sur une surface propre et appuyez doucement mais fermement le joint sur une lame afin que celui-ci forme un scellement étanche. Vérifiez l'absence de bulles d'air entre le joint en PDMS et la lame. Ensuite, remplissez complètement le joint avec la solution de saccharose préalablement réchauffée.Ne laissez aucune bulle. Appuyez maintenant l'autre lame recouverte sur le dessus du joint en l'alignant avec l'autre lame. Assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle et fixez la chambre à l'aide de pinces à levier.Ensuite, éliminez l'excès de solution de saccharose par aspiration et nettoyez les lames à l’aide de lingettes sans peluches. Pour continuer, fixez l’ensemble des lames sur une barre en cuivre de sorte que la face conductrice de chaque lame soit en contact uniforme avec la barre. Puis, reliez la barre en cuivre à la sortie du générateur de fonctions et placez l’ensemble à l’intérieur de l’incubateur, le générateur de fonctions restant à l’extérieur.Une fois la température atteinte, programmer le générateur de fonctions pour appliquer une onde sinusoïdale de 10 Hz et une différence de potentiel de un volt pendant 90 minutes. Vérifier soigneusement que la tension est de un volt à l’aide d’un multimètre. Après 90 minutes, réduire lentement la fréquence à 2 Hz et poursuivre l’électroformation pendant 10 minutes supplémentaires.Pendant ce temps, récoltez la protéine Gag du VIH-1 à partir de la réaction de traduction in vitro préparée la veille. Éliminez les agrégats indésirables en centrifugeant les lysats, puis transférez soigneusement le surnageant dans un autre tube. Après 10 minutes à deux Hz, éteignez le générateur de fonctions, éteignez l’incubateur et laissez la porte de l’incubateur ouverte jusqu’à ce que le dispositif revienne à la température ambiante.Une fois refroidi, amenez soigneusement l'ensemble de lame sur le plan de travail et désassemblez délicatement la chambre en retirant la lame supérieure à l’aide de pinces. Transférez les VUG à l’aide d’une pipette calibrée de 1000 microlitres dont la pointe a été coupée vers un nouveau tube. Manipulez ce tube avec précaution et utilisez les VUG dans les 90 minutes.Ensuite, préparez une chambre d'imagerie. Fixez une feuille de PDMS contenant un petit trou sur une lamelle propre. Appuyez doucement et fermement pour obtenir un scellement étanche.Ensuite, mélanger cinq microlitres de la réaction de traduction in vitro avec cinq microlitres de GUV. Après quelques minutes, transférer le mélange dans la chambre d'imagerie et procéder à l'acquisition des images. Pour éviter l'évaporation, la chambre d'imagerie peut être recouverte d'une lame couvre-objet.En utilisant le protocole décrit, des VUG ont été préparées à partir de POPC, de POPS et de cholestérol dans un rapport molaire de 4,7 : 2,3 : 3. La mesure de la fluorescence des signaux de Gag-YFP sur une VUG montre qu'ils ne sont pas détectables au-dessus du bruit de fond à la surface de la VUG. Toutefois, la protéine Gag-YFP s'est liée efficacement aux VUG lorsque du cerveau-PIP2 a été inclus dans le mélange lipidique.La liaison de Gag est évidente par l'augmentation de l'intensité de fluorescence à la surface de la membrane, qui, lorsqu'elle est analysée, apparaît comme un pic net. Une fois maîtrisée, à condition que la protéine soit disponible sous une forme marquée fluorescentement, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les GUVs et d'utiliser toujours des lipides frais lorsque cela est possible.Cette technique a permis aux chercheurs spécialisés dans l'assemblage des rétrovirus d'étudier in vitro les interactions membranaires des protéines Gag rétrovirales, sans recourir à de longues procédures de Post Mixing, qui pourraient modifier l'état latent des interactions.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Le protocole décrit une approche à haut débit pour déterminer les structures des protéines membranaires par cryo-tomographie électronique et traitement d'images 3D. Il couvre les détails de la préparation des échantillons, collecte, traitement et interprétation des données, et se termine par la production d'une cible représentant de l'approche, le VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe. Ces procédures de calcul sont conçues d'une façon qui permet aux chercheurs et aux étudiants de travailler à...

Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d&#39;enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Cet article décrit une méthode pour visualiser la formation d'une synapse enveloppe du VIH-1 induite par le verre virologique soutenu bicouches planaires par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. La méthode peut également être combiné avec immunofluorescence pour détecter l'activation et la redistribution des molécules de signalisation qui se produisent pendant le VIH-1 induite par l'enveloppe formation de la synapse virologique.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Cet article présente une méthode simple pour la production rapide de vésicules unilamellaires géantes avec des protéines cytosquelettiques encapsulées. La méthode s’avère utile pour la reconstitution ascendante des structures cytosquelettiques dans le confinement et les interactions cytosquelette-membrane.

Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

La diversité des lipides membranaires dans leur structure et leur composition est un contributeur important aux processus cellulaires et peut être un marqueur de maladie. Les simulations de dynamique moléculaire nous permettent d’étudier les membranes et leurs interactions avec les biomolécules à une résolution atomistique. Ici, nous fournissons un protocole pour construire, exécuter et analyser des systèmes membranaires complexes.

Modélisation membranaire réaliste à l’aide de mélanges lipidiques complexes dans des études de simulation

Cet article présente une méthode de préparation de vésicules unilamellaires géantes composées (cGUV) avec une structure vésicule dans vésicule, avec une conductivité électrique personnalisée dans les régions intérieures, annulaires et externes. L’électroformation synthétise des GUV simples, qui sont transformés en stomatocytes et en cGUVs par choc osmotique, fournissant un modèle précieux pour l’étude de la biophysique des cellules nucléées.

Synthèse de vésicules unilamellaires géantes composées : un modèle biomimétique de cellules nucléées

Découvrez la visualisation de la liaison du VIH-1 Gag sur des membranes de vésicules géantes unilamellaires. Cette méthode permet d'étudier les interactions lipidiques et les mécanismes d'assemblage viral.

Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

Explorer plus de vidéos