Combiné proche infrarouge imagerie fluorescente et la tomographie par Micro-calculé pour Directement Visualizing cérébrale thromboembolies

Le but général de cette technique d'imagerie directe des thrombus est de visualiser de manière quantitative des thromboembolies cérébrales marquées par fluorescence in vivo et ex vivo, en utilisant des nanoparticules d'or, la tomodensitométrie et l'imagerie fluorescente proche infrarouge. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'hémostase et de la thrombose, telles que la réponse orthopédique grave, dépendante du temps ou de la dose, des thromboembolies cérébrales à l'activateur tissulaire du plasminogène ou à de nouveaux agents thrombolytiques en cours d'étude. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, après injection intraveineuse de nanoparticules d'or, la micro-TDM à haute résolution permet de capturer l'évolution dynamique des thromboembolies cérébrales en visualisant quantitativement leur localisation et leur charge in vivo, puis confirmée par l'imagerie ex vivo du thrombus en fluorescence proche infrarouge.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Jeong-Yeon Kim, post-doctorante de mon laboratoire. Après avoir prélevé de 300 à 1 000 microlitres de sang artériel par ponction cardiaque, ajouter 70 microlitres de l'échantillon à 30 microlitres du facteur de coagulation activé approprié, 13 sondes fluorescentes sensibles à l'activité de réticulation du fibrine, puis charger le mélange obtenu dans une seringue de trois millilitres équipée d'une aiguille de calibre 23. Ensuite, injecter le sang marqué dans un tube en polyéthylène de 20 centimètres de long et laisser le sang coaguler à température ambiante.

Après deux heures, transférez le tube à quatre degrés Celsius pendant 22 heures, puis découpez le tube en morceaux de 1,5 centimètre. À l’aide d’une seringue de trois millilitres remplie de PBS, expulsez le caillot de chaque morceau de tube dans des puits individuels d’une plaque à six puits contenant du PBS. Lavez les caillots trois fois avec du PBS, puis insérez une seringue de un millilitre remplie de sérum physiologique, équipée d’une aiguille de 30 gauge, dans une extrémité d’un tube PE10 de 15 centimètres et aspirez soigneusement un caillot lavé unique dans l’extrémité opposée du tube.

Ensuite, reliez le tube PE10 chargé de thrombus à un tube PE50 d'une longueur de trois centimètres et doté d'une extrémité effilée de 200 microns de diamètre. Après avoir confirmé l'anesthésie par l'absence de réponse à une pincée des orteils, désinfectez la zone chirurgicale avec du Bétadine et de l'alcool à 70 %, puis utilisez un scalpel pour pratiquer une incision verticale d'un centimètre entre l'oreille gauche et l'œil gauche. Collez l'extrémité distale de la fibre optique d'un débitmètre laser Doppler sur la surface osseuse temporale gauche exposée, un millimètre à gauche et quatre millimètres en dessous du bregma, puis commencez la surveillance Doppler.

Effectuez ensuite une incision médiane verticale de trois centimètres à travers les tissus mous péri-vasculaires afin d'exposer la région du bulbe carotidien gauche. À l’aide d’un fil de soie noir stérile 6-0, ligaturez l’artère carotide commune proximale gauche, puis ligaturez l’artère carotide interne gauche et l’artère ptérygopalatine gauche à l’aide de fils de soie noirs stériles 7-0. À l’aide d’une cautérisation électrique monopolaire, cautérisez l’artère thyroïdienne supérieure gauche, puis utilisez des fils de soie noirs stériles 7-0 pour ligaturer lâchement l’artère carotide externe proximale gauche et pour ligaturer étroitement l’extrémité distale du vaisseau.

Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour créer un trou de 0,2 à 0,25 micron entre les sites ligaturés de l'artère carotide externe et insérez le cathéter contenant le thrombus dans le trou tout en relâchant la ligature proximale de l'artère carotide externe. Avancez le cathéter dans l'artère carotide commune afin de le maintenir en place, puis resserrez à nouveau la ligature proximale de l'artère carotide externe. Coupez l'extrémité distale de l'artère carotide externe par cautérisation et faites pivoter l'extrémité proximale libre de l'artère carotide externe dans le sens horaire pour aligner le vaisseau avec l'artère carotide interne tout en retirant le cathéter.

Ensuite, desserrer le ligature de l'artère carotide interne et avancer immédiatement le cathéter d'environ neuf millimètres jusqu'à la bifurcation de l'artère cérébrale moyenne et de l'artère cérébrale antérieure. Maintenant, resserrer à nouveau le point de suture de l'artère carotide interne autour du cathéter et appuyer doucement sur la seringue pour injecter le thrombus dans la zone de bifurcation. Si un débit sanguin inférieur ou égal à 30 % par rapport à la valeur de base est observé sur le Doppler, retirer le cathéter et ligaturer immédiatement l'extrémité proximale de l'artère carotide externe.

Pour imager le thrombus par micro-tomodensitométrie au point temporel expérimental approprié, diluer les nanoparticules d'or ciblant le fibrine à une concentration de 10 milligrammes par millilitre dans du PBS 10 millimolaire et soniquer l'agent d'imagerie du thrombus pendant 30 minutes afin d'assurer une suspension homogène des nanoparticules. Ensuite, injecter 300 microlitres des particules ciblant le fibrine dans la veine péniennes de l'animal expérimental. Transférer l'animal sur le plateau de l'appareil de micro-TDM et utiliser un fil attaché à une épingle pour tirer doucement sur les dents supérieures antérieures afin de redresser le cou.

Cinq minutes après l'injection des nanoparticules d'or, commencez l'imagerie. Pour visualiser le thrombus par imagerie ex vivo en proche infrarouge, placez le tissu cérébral excisé dans l'appareil d'imagerie avec la base orientée vers le haut. Obtenez des images des thromboembolies marquées par fluorescence dans les artères du cercle de Willis.

Ensuite, positionnez le tissu avec le sommet orienté vers le haut et imagez les thromboembolies corticales. Hydratez le tissu avec quelques gouttes de solution saline, puis, à l’aide du dispositif matrice cérébrale selon les instructions du fabricant, obtenez rapidement six tranches coronales cérébrales de deux millimètres d'épaisseur. En maintenant les tranches hydratées avec la solution saline, effectuez des images supplémentaires en infrarouge proche des surfaces antérieure et postérieure des sections.

Pour quantifier la zone de thrombus après l'imagerie par micro-TDM, ouvrez les fichiers de séquence d'images et sélectionnez Image, puis Type, puis 8 bits afin de convertir les images en niveaux de gris 8 bits. Lorsqu'un pixel des fichiers d'images TDM correspond à 0,053 millimètre, utilisez Analyser Définir l'échelle pour entrer un, 0,053 et millimètres respectivement pour Distance en pixels, Distance connue et Unité de longueur. Ensuite, sous Éditer, choisissez Sélection, puis Spécifier afin de placer une région d'intérêt sur une zone du parenchyme cérébral ne contenant ni thrombus ni région hyperdense liée à l'os.

Étant donné que la région d'intérêt spécifiée s'applique à chaque coupe de la pile, vérifiez que cette région ne chevauche aucune zone hyperdense dans l'une des coupes. Ensuite, sous Plugin, sélectionnez Région d'intérêt et Soustraction du fond dans la Région d'intérêt, puis saisissez deux pour le Nombre d'écarts-types par rapport à la moyenne. Recherchez les lésions hyperdenses liées aux thromboembolies et zoomez sur la zone lésionnelle.

Maintenant, choisissez Image, puis Adjust et Threshold, et saisissez une valeur de seuil inférieur de 22 et une valeur de seuil supérieur de 255. Sélectionnez Over/Under pour afficher en bleu les pixels situés en dessous de la valeur de seuil inférieur, les pixels seuillés en niveaux de gris, et les pixels situés au-dessus de la valeur de seuil supérieur en vert. Ensuite, utilisez l'outil de sélection à main levée pour dessiner des régions d'intérêt entourant les lésions hyperdenses liées aux thromboembolies, sans inclure de zones osseuses.

Utilisez Analyser, Définir les mesures pour choisir Aire, Valeur moyenne de gris et Densité intégrée (aire multipliée par la moyenne). Cochez les options suivantes : Limiter au seuil et Afficher l'étiquette. Utilisez Analyser Mesurer pour obtenir les données quantifiées, puis enregistrez les résultats.

Ces images de micro-CT de base ont été obtenues in vivo cinq minutes après l'injection de nanoparticules d'or ciblant le fibrine, une heure après un accident vasculaire cérébral embolique chez la souris. Le thrombus cérébral est clairement visible au niveau de la zone de bifurcation de l'artère cérébrale moyenne et de l'artère cérébrale antérieure au niveau de l'artère carotide interne distale. Les images de suivi de micro-CT montrent l'absence de modifications du thrombus du cercle de Willis chez les animaux traités au sérum physiologique, tandis que les animaux traités par l'activateur tissulaire du plasminogène présentent une dissolution progressive du thrombus du cercle de Willis au fil du temps, indiquée par les flèches bleues.

Il existe une forte corrélation entre la densité au scanner in vivo et l'imagerie proche infrarouge ex vivo pour les thromboembolies résiduelles à 24 heures. Par exemple, dans ces images, les zones hyperdenses au micro-CT, mises en évidence par les particules d'or ciblant le fibrinogène, correspondent directement aux zones de signal proche infrarouge identifiées par la sonde fluorescente sensible à l'activité de réticulation du facteur de coagulation 13A, qui se lie au caillot au cours du processus de maturation du caillot préformé. De plus, comme illustré dans ces images, la coloration au TTC peut être utilisée pour évaluer les effets de la thrombolyse sur les lésions cérébrales ischémiques chez des animaux témoins traités au sérum physiologique par rapport à ceux traités par l'activateur tissulaire du plasminogène.

Une fois maîtrisée, cette technique d'imagerie micro-CT in vivo et d'imagerie fluorescente ex vivo des thrombus en proche infrarouge peut être réalisée en environ une heure si elle est correctement effectuée et si les sondes d'imagerie sont disponibles. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des nanoparticules d'or non agrégées et ciblant le fibrine pour l'imagerie directe des thrombus cérébraux par micro-CT. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la microscopie électronique ou la SMICP, c'est-à-dire la spectrométrie de masse avec plasma couplé inductivement, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la distribution tissulaire et la cinétique sanguine des nanoparticules d'or.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des accidents vasculaires cérébraux ou de la recherche cardiovasculaire pour explorer le thromboembolisme dans des modèles animaux présentant une thrombose coronaire ou une infarctus cérébral embolique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des caillots marqués aux fluorochromes pour modéliser un accident vasculaire cérébral thromboembolique chez la souris, ainsi que de réaliser un imagerie en série et une quantification des thromboembolies cérébrales in vivo puis ex vivo, permettant ainsi de suivre l'évolution du thrombus.