Un haut contenu In vitro Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

L’objectif global de cette plateforme de criblage de réplication des cellules bêta à haut contenu est de faciliter l’étude des voies moléculaires qui limitent la croissance des cellules bêta. Cette méthode peut aider à répondre à des questions importantes dans le domaine de la biologie des cellules bêta. Comme l’une des molécules de signalisation clés et des voies qui contrôlent la régénération des cellules bêta.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet d’augmenter le débit de revêtement cellulaire jusqu’à une évaluation spécifique et l’analyse automatisée des données d’une réplication primaire des cellules d’îlots pancréatiques. L’utilisation de cette technique a le potentiel de s’étendre au développement de la thérapie régénérative pour le diabète. Une maladie qui a un coût sanitaire et économique majeur pour notre société.

Commencez par utiliser une seringue de 10 millilitres chargée de solution digestive pancréatique équipée d’une aiguille de calibre 22 pour chimiculer le canal cholédoque au niveau ou juste distal de la jonction des canaux cystiques et hépatiques communs. En soutenant le canal cholédoque avec une poignée de scalpin, injectez lentement 10 millilitres de solution. Une fois que toute la collagénase a été administrée, utilisez des pinces incurvées et des ciseaux pour séparer le pancréas gonflé du côlon, des intestins, de l’estomac et de la spline descendants.

Placez ensuite jusqu’à deux pancréas dans un tube de 50 millilitres sur de la glace contenant cinq millilitres de solution de digestion pancréatique. Lorsque tout le pancréas a été prélevé, placez les tubes de digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes en remuant doucement toutes les trois minutes. À la fin de la digestion, secouez vigoureusement les tubes verticalement 10 fois.

Et ajoutez 10 millilitres de tampons de lavage à froid aux échantillons. Secouez vigoureusement les tubes cinq fois de plus et placez-les sur de la glace. Ensuite, remplissez les tubes jusqu’à un volume final de 50 millilitres avec un tampon de lavage à froid et retournez les tubes cinq fois.

Ensuite, faites tourner les tissus et versez les surnageants, en prenant soin de ne pas déloger les granulés. Remettez la suspension de la boue tissulaire dans 25 millilitres de tampon de lavage, suivie d’un léger vortex. Répétez les étapes de rotation et de remise en suspension deux fois de plus.

Ils versent les suspensions de tissus à travers un tamis à mailles de 30 mailles dans un bécher stérile de 250 millilitres. Rincez les tubes de digestion avec 20 millilitres supplémentaires de tampon de lavage et versez les lavages sur le filet pour éliminer les tissus pancréatiques et adipeux non digérés. Répartissez le matériau filtré entre deux nouveaux tubes de 50 millilitres et granulez le tissu par centrifugation.

Ensuite, décantez le surnageant et retournez les tubes pour drainer l’excès de tampon. Pour purifier les îlots, ajoutez 20 millilitres de gradient de densité froide aux granules de tissu pancréatique et pipetez doucement de haut en bas cinq fois pour remettre le contenu en suspension de manière homogène. Ensuite, superposez lentement 10 millilitres de HBSS le long de la paroi de chaque tube de gradient en prenant soin de maintenir une interface liquide nette et de séparer les cellules pancréatiques par centrifugation.

Utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la couche d’îlots de Langerhans de l’interface dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Ensuite, lavez les îlots dans 40 à 50 millilitres de tampon de lavage trois fois. Inverser leurs tubes pour remettre les granulés en suspension entre chaque centrifugation.

Après le lavage final, placez les tubes dans une hotte de culture tissulaire. Aspirez le surnageant. Et remettez les granulés en suspension dans six millilitres de milieu d’îlot.

Tamisez les îlots de chaque tube dans des puits individuels de six puits de plaque de culture tissulaire. Et faites tourner la plaque pour recueillir les îlots au milieu des puits. Évaluez la pureté des îlots de Langerhans au microscope.

Pour purifier davantage les îlots, collectez-les à l’aide d’une pipette d’un millilitre et transférez-les dans le puits adjacent à l’aide de six millilitres de milieu d’îlots. Répétez le tourbillonnage des îlots, la collecte, le transfert et l’évaluation microscopique jusqu’à ce que la pureté soit supérieure à 90 %. Ensuite, transférez les îlots dans une seule boîte de culture tissulaire de 10 centimètres contenant 20 millilitres de milieu d’îlots.

Une fois que tous les îlots ont été récoltés, placez la boîte de culture dans un incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. Ensuite, enduisez les puits d’une plaque de 384 puits avec 40 microlitres de 804G, milieu conditionné par puits et placez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un grattoir cellulaire pour détacher doucement les îlots.

Transférez ensuite les îlots dans un tube de 50 millilitres. Collecter les îlots par centrifugation. Ensuite, lavez-les avec 20 millilitres de p, b, s chaud.

Centrifugez pendant une minute. Aspirez le surnageant. Et remettez le granulé en suspension dans zéro virgule deux, cinq pour cent de trypsine.

Incuber les îlots pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour aspirer et distribuer les îlots 10 fois à cinq et 10 minutes. Après la deuxième tritérination, comptez un échantillon de 20 microlitres de cellules d’îlots pancréatiques trypsinisés. Si les tissus sont complètement digérés, suspendez les cellules dissociatives des îlots à quatre virgule cinq fois dix à la concentration de quatre cellules par millilitre dans le milieu de fonction des îlots pancréatiques.

Ensuite, utilisez un aspirateur à collecteur à 12 puits pour retirer le fluide de condition 804G de la plaque à 384 puits préalablement préparée. Et tamisez 70 microlitres d’îlots par puits dans les rangées c à n des colonnes quatre à 21. Laissez les îlots adhérer dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures.

Après deux jours, utilisez l’aspirateur à collecteur à 12 puits pour retirer soigneusement le milieu d’îlot et utilisez une pipette à 12 canaux pour ajouter 35 microlitres de milieu de fonction d’îlot à chaque puits. Transférez ensuite 35 microlitres des deux, x solutions composées d’intérêt fraîchement préparées dans chaque puits. Et retournez les îlots dans l’incubateur pendant encore 48 heures.

Après 48 heures, fixez, colorez et analysez les cultures d’îlots de Langerhans traitées à l’aide d’une plate-forme d’imagerie automatisée à haut contenu. Dans une expérience typique, le taux de réplication des cellules bêta DAPI,-1 et insuline positive est déterminé par le pourcentage de cellules bêta co-exprimant Ki-67. La réplication des cellules alpha est mesurée par le pourcentage de cellules DAPI positives, négatives, glucagon positives, Ki-67.

Par exemple, dans cette expérience représentative, on a observé que le dipryridamole favorise la réplication des cellules bêta mais pas des cellules alpha. Cette technique peut être complétée en sept jours. Suite à cette procédure, les composés qui, dans la réplication des cellules bêta, peuvent être étudiés plus en détail pour révéler les mécanismes d’action.

Cette technique a permis aux recherches dans le domaine de la biologie des cellules bêta d’identifier de nouveaux facteurs de signalisation et de nouvelles voies qui régulent la croissance des cellules bêta. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester la capacité des petites molécules à stimuler sélectivement la régénération des cellules bêta.