Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire
7 octobre 2016
Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.
L’objectif global de cette procédure est d’imager volumétriquement les cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur des cœurs intacts, d’étudier la fonction des gènes à résolution unitaire au cours du développement cardiaque et dans les cœurs postnataux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés au cours du développement cardiaque, telles que l’étude des fonctions des gènes et l’aide à l’imagerie à résolution unitaire pendant le développement cardiaque et les artefacts animides. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est relativement simple, peu coûteuse et avantageuse dans la mesure où l’analyse temporelle spéciale des fonctions des gènes et des protéines à une résolution unicellulaire dans un embryon ou un cœur intact
.Bien que nous utilisions ce système pour étudier le développement cardiaque chez la souris, vous pouvez également l’utiliser pour étudier d’autres systèmes organiques, tels que les muscles, le cerveau et les poumons, ainsi que dans d’autres organismes modèles. Des embryons positifs aux protéines fluorescentes provenant de mères de confettis R-26 Cre-RET2 traitées au Tamoxifren sont utilisés ici. Commencez la coloration en immergeant chaque embryon fixé au paraformaldéhyde dans un millilitre de PBST à 0,1 % dans les puits d’une plaque à 48 puits.
Incuber pendant deux heures sur une plaque agitée à température ambiante pour perméabiliser les tissus. Ensuite, remplacez la solution de perméabilisation par un mL de tampon de blocage et incubez, en agitant la tête, pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez une dilution de un à 100 de l’anticorps spécifique des cellules endothéliales, PECAM, dans 0,3 millilitre de tampon de blocage pour chaque puits et ajoutez-le aux puits contenant les embryons.
Incuber pendant 48 heures en secouant à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les embryons cinq fois avec du PBST pendant 30 minutes à chaque fois pour éliminer l’excès d’anticorps primaires du tissu. Ensuite, plongez les embryons dans une solution d’anticorps secondaires antivat de chèvre Alexa Fluor 647 et incubez en agitant pendant 48 heures à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière.
48 heures plus tard, après le lavage avant, post-fixez les embryons avec 4 % de PFA pendant une heure à température ambiante en secouant. Ensuite, après avoir lavé deux fois avec du PBS pendant cinq minutes à chaque fois, incubez les embryons avec une coloration nucléaire DAPI pendant dix minutes. Poursuivez avec deux lavages PBS de cinq minutes chacun, puis procédez au nettoyage des tissus.
L’élimination des tissus est l’étape la plus critique de ce protocole afin d’imager le cœur à une résolution unicellulaire. De plus, le choix de la méthode de clarification, qu’il s’agisse d’une échelle ou d’un CUBIC, est également très important afin de préserver les signaux fluorescents dans le cœur embryonnaire intact. Transférez les embryons lavés et tachés dans un flacon à scintillation enveloppé dans du papier d’aluminium, qui contient un millilitre de solution de tartre A2.
Incuber à quatre degrés Celsius avec une légère secousse occasionnelle à la main pendant 48 heures. Après l’incubation de la calamine A2, remplacez la solution dans le flacon par un millilitre de solution de tartre B4 et incubez à quatre degrés Celsius en secouant doucement de temps en temps pendant 48 heures supplémentaires. Incuber les embryons pendant encore 48 heures avec un millilitre d’échelle 70 à quatre degrés Celsius avec des secousses douces occasionnelles comme auparavant.
Enfin, plongez l’échantillon effacé par le tartre dans un millilitre de glycérol à 90 % et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Pour imager, transférez l’échantillon dans une boîte de Pétri à fond de verre avec une quantité minimale de glycérol à 90 % et imagez avec un microscope confocal équipé de capacités à deux photons. Pour le nettoyage de CUCUB, plongez chaque embryon dans un millilitre de CUBIC en secouant doucement de temps en temps pendant 48 heures à 37 degrés Celsius.
Après 48 heures, remplacez la solution par le même volume de réactif CUBIC frais et incubez l’échantillon pendant 48 heures supplémentaires, comme auparavant. Après l’incubation, laver plusieurs fois les embryons traités à CUBIC one avec du PBS en les secouant doucement à la main pour éliminer l’excès de solution de CUBIC one. Ensuite, immergez les embryons dans la solution CUBIC two pendant 48 heures à 37 degrés Celsius avec une légère secousse occasionnelle à la main.
S’il y a un délai avant l’imagerie, incubez séquentiellement les échantillons avec un millilitre de glycérol à 30 %, 50 % et 70 % de PBS pendant 30 minutes chacun. Après avoir parcouru la série, transférez dans une solution de glycérol à 90 % pour un stockage à quatre degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt, imaginez dans une boîte de Pétri à fond de verre avec 90 % de glycérol, comme précédemment.
Cette vidéo montre des coupes optiques d’un cœur E 8.75 traité à l’échelle, de la surface du cœur à la lumière. Le jaune marque l’expression de PECAM et tous les cardiomyocytes apparaissent en vert. La profondeur est de 110,4 microns et il y a 93 tranches au total.
Voici l’image de surface 3D du cœur reconstruit qui vient d’être montrée. Encore une fois, le jaune marque l’expression de PECAM et le vert marque tous les cardiomyocytes. Cette vidéo montre des coupes d’un seul clone progéniteur d’un cœur E 9.5 traité à l’échelle dans la région de la voie d’éjection.
Le jaune marque l’expression PECAM et le clone apparaît en vert. La profondeur est de 36 microns et il y a 10 tranches au total. Cette vidéo montre des sections d’un cœur P two traité CUBIC de la surface à la lumière.
La profondeur est de 130 microns avec trois microns par section. Cette vidéo montre des sections d’un cœur E 17.5 traité CUBIC de la surface à la lumière. La profondeur est de 630 microns avec six microns par section.
Il s’agit d’une image de surface 3D du cœur qui vient d’être montrée, reconstruite via le logiciel de reconstruction 3D. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’embryon est fragile et que la pathologie cardiaque peut être facilement perturbée. Suite à cette procédure, d’autres protéines peuvent être réalisées, en utilisant la coloration pour étudier la fonction des gènes lors d’une post-ost lation et faire mousser.
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Aperçu
Cet article présente un protocole d'imagerie volumétrique de cellules marquées par des protéines fluorescentes au sein de cœurs embryonnaires et postnataux intacts. La méthode combine des techniques de clarification tissulaire avec une coloration en montage entier afin d'obtenir une imagerie claire avec une résolution au niveau cellulaire unique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Développement cardiaque
- Imagerie fluorescente
- Analyse de la fonction des gènes
Contexte
- Comprendre les fonctions des gènes durant le développement cardiaque est essentiel.
- L'imagerie à résolution unicellulaire permet une analyse détaillée.
- La méthode s'applique à divers systèmes organiques et organismes modèles.
- Le marquage par protéines fluorescentes améliore la visualisation de cellules spécifiques.
Objectif de l'étude
- Étudier la fonction des gènes à une résolution unicellulaire dans les tissus cardiaques.
- Étudier les processus de développement dans les cœurs embryonnaires et postnataux.
- Proposer une méthode d'imagerie relativement simple et rentable.
Méthodes utilisées
- Utilisation de méthodes de clarification tissulaire.
- Coloration en montage entier de cellules marquées par des protéines fluorescentes.
- Imagerie d'embryons fixés au paraformaldéhyde.
- Application de la méthode à divers systèmes organiques autres que le cœur.
Résultats principaux
- Imagerie réussie de cellules marquées par des protéines fluorescentes dans des cœurs intacts.
- Visualisation claire des fonctions des gènes au cours du développement cardiaque.
- Démonstration de la polyvalence de la méthode dans différents systèmes d'organes.
- Mise en place d'un protocole accessible et efficace.
Conclusions
- Le protocole permet une étude détaillée du développement cardiaque au niveau cellulaire.
- Il peut être adapté pour être utilisé dans d'autres systèmes biologiques.
- Cette méthode améliore notre compréhension des fonctions des gènes au cours du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'imagerie de cœurs embryonnaires et postnataux rendus transparents à une résolution unicellulaire permet une analyse détaillée du comportement et de la différenciation des cellules progénitrices cardiaques au cours du développement. Cette approche facilite la validation de cibles en précisant les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la morphogenèse cardiaque normale et anormale. La méthode offre une confiance prédictive dans les modèles précliniques en reliant la fonction des gènes aux résultats structuraux dans un tissu intact.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant la dynamique clonale dans le tissu cardiaque en développement.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à l'observation directe de la contribution des cellules progénitrices aux structures cardiaques.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans le choix des cibles en associant perturbation génique et résultats phénotypiques à la résolution monocellulaire.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en préservant les signaux fluorescents après clarification.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des tests grâce à des protocoles reproductibles de clarification des tissus et de coloration en montage entier.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme à travers les stades embryonnaires et postnataux grâce à des méthodes de clarification adaptées à chaque stade (ScaLe pour les embryons, CUBIC pour les postnataux).
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la découverte et la validation préclinique en permettant une imagerie cohérente de la fonction génique au cours des différentes étapes du développement.
- Réduction des risques mécanistiques : Révèle la base cellulaire des malformations cardiaques congénitales grâce à l'analyse clonale dans des cœurs intacts.
- Système pertinent pour les maladies : Fournit un modèle riche en contexte physiologique pour l'étude de la morphogenèse cardiaque en lien avec le développement humain.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la continuité de la découverte, depuis les premiers tests d'hypothèse sur des cibles jusqu'à l'identification de composés actifs et la validation préclinique, en permettant des lectures quantitatives et résolues spatialement de la fonction génique dans un tissu cardiaque intact.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en visualisant l'expansion clonale et la différenciation au cours du développement cardiaque.
- Écrans biologiques : Permet la préparation des tests grâce à des protocoles normalisés de clarification et de coloration qui préservent les signaux des épitopes et des protéines fluorescentes.
- Analytique : Génère des données d'imagerie quantitatives en 3D permettant la comparaison de la distribution, de la taille et de la localisation des clones entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en permettant une évaluation longitudinale des phénotypes structuraux cardiaques associés à des perturbations génétiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une capacité d'imagerie réutilisable applicable à divers systèmes organiques (cœur, cerveau, poumon, muscle) et à différents organismes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies de développement cardiaque.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à des étapes définies de clarification et de coloration, compatibles avec l'imagerie confocale et à deux photons.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'avancement ou d'abandon en fournissant une preuve visuelle directe de l'interaction avec la cible et des conséquences phénotypiques dans un tissu intact.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en reliant les phénotypes développementaux précoces à des mécanismes potentiels de défauts congénitaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en marquage par protéines fluorescentes, en immunomarquage sur préparations entières et en techniques de clarification tissulaire.
- Dépend de l'accès à des systèmes de microscopie confocale ou à deux photons capables d'imagerie en profondeur des tissus.
- Exige une standardisation du choix de la méthode de clarification (ScaLe par rapport à CUBIC) selon le stade de développement, afin de préserver l'intégrité tissulaire et le signal.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application du protocole à d'autres systèmes organiques, en raison des variations de densité tissulaire et de la tolérance à la clarification.
- Comprend des limites pratiques telles que la fragilité des tissus lors de la manipulation et le risque de perturbation des pathologies si la clarification n'est pas optimisée en fonction du stade de développement.
