Mesure In vitro Activité ATPase pour Enzymatic Caractérisation

L’objectif global de cette procédure est de quantifier l’activité ATPase in vitro des protéines purifiées pour la caractérisation fonctionnelle. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser de nouvelles ATPases présumées, évaluer les activateurs ou inhibiteurs potentiels efficaces et déterminer la contribution de domaines ou de résidus particuliers à l’activité de l’ATPase. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple et sensible pour mesurer l’activité de l’ATPase in vitro et qu’elle peut être facilement optimisée.

Préparez des stocks de tous les réactifs nécessaires à l’incubation avec des protéines purifiées comme indiqué dans le protocole textuel. Prémélangez 100 millimolaires de chlorure de magnésium et 100 millimolaires d’ATP dans un rapport de un pour un juste avant de mettre en place la réaction d’hydrolyse de l’ATP. Préparez et étiquetez des tubes de 1,5 millilitre pour prélever des échantillons à intervalles réguliers tout au long de la réaction.

Préparez des tubes pour prélever des échantillons à des moments de zéro ainsi qu’à des moments de 15, 30, 45 et 60 minutes. Ajoutez 245 microlitres de 1x tampon HNG dans chaque tube pour diluer les échantillons prélevés à partir des réactions d’hydrolyse de l’ATP à une dilution de un à 50. Ensuite, préparez un bain de glace sèche et d’éthanol pour congeler rapidement les échantillons afin d’arrêter la réaction.

Dans un seau à glace en caoutchouc ou un autre récipient sûr, ajoutez plusieurs morceaux de glace sèche et versez soigneusement suffisamment de 70 % à 100 % d’éthanol pour couvrir la glace sèche. Diluez la protéine purifiée dans un tampon 1X HNG et conservez-la sur de la glace. Configurez les réactions d’hydrolyse de l’ATP dans les tubes de 0,5 millilitre préparés en ajoutant un volume d’eau précalculé pour atteindre un volume de réaction final de 30 microlitres.

Suivi de six microlitres de 5X HNG ou d’un autre tampon, de trois microlitres de 100 millimolaires de chlorure de magnésium mélangé ATP et de 0,25 à cinq micromolaires de protéines. Incuber une condition de contrôle négatif tampon uniquement dans laquelle aucune protéine n’est ajoutée. Ensuite, retirez cinq microlitres de la réaction à fois zéro.

Diluez ensuite l’aliquote un à 50 dans le tube préparé de 1,5 millilitre contenant 245 microlitres de tampon HNG. Congelez immédiatement l’échantillon dans le bain d’éthanol à la glace sèche. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pour permettre à l’hydrolyse de l’ATP de se produire pendant une heure.

À chaque intervalle, prélever cinq aliquotes d’un microlitre de la réaction et les ajouter aux tubes d’échantillonnage étiquetés contenant le tampon HNG comme précédemment. À la fin de la réaction d’hydrolyse de l’ATP, placez les échantillons dilués dans un congélateur à 80 degrés Celsius pour les stocker. Pour vous assurer que tous les échantillons sont complètement congelés, attendez au moins 10 minutes avant de continuer.

Décongeler les échantillons dilués contenant des aliquotes de réaction d’hydrolyse de l’ATP à chaque point temporel à température ambiante. Ensuite, préparez une plaque à 96 puits contenant des échantillons et des étalons de phosphate. Dans un tube de 0,5 millilitre, diluez l’étalon de phosphate de 800 micromolaires à 40 micromolaires en ajoutant 5,5 microlitres de l’étalon à 104,5 microlitres de tampon HNG.

Bien mélanger et ajouter 100 microlitres de cet étalon de phosphate de 40 micromolaires au puits A1 de la plaque de 96 puits. Ajouter 50 microlitres de tampon HNG aux puits B1 à H1 pour des dilutions en série de l’étalon de phosphate d’une à une. Retirez 50 microlitres de phosphate de 40 micromolaires du puits A1, ajoutez-le aux 50 microlitres de tampon de dosage du puits B1 et mélangez.

Ensuite, retirez 50 microlitres du puits B1 et ajoutez-le au puits C1, en continuant les dilutions dans le puits G1. Jetez 50 microlitres du puits G1 après le mélange pour vous assurer que chaque puits a le même volume. Eh bien, H1 ne doit contenir que du tampon pour créer un étalon de phosphate de 40 à zéro micromolaire. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de chaque échantillon en double dans la plaque.

Ajoutez des échantillons du même point temporel en colonnes verticalement et de différents points temporels horizontalement. Cela permet d’obtenir jusqu’à huit échantillons et cinq points temporels par plaque. À l’aide d’une pipette stérile, prélever suffisamment de réactif de détection de phosphate de méliptate vert de malachite pour ajouter 100 microlitres à chacun des puits contenant des échantillons et des étalons.

Ajoutez le réactif de détection dans une boîte pour faciliter le pipetage à l’aide d’une pipette multicanaux. Ne versez pas le réactif de détection directement dans la boîte car une contamination par le phosphate est susceptible de se produire. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de réactif de détection de phosphate dans chaque puits et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas un nombre constant de fois sans introduire de bulles, en travaillant dans l’ordre du dernier point temporel au premier point temporel.

Laissez la plaque à température ambiante pendant 25 minutes ou selon les instructions du fabricant. Pour quantifier les résultats, lire l’absorbance des échantillons à 650 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques d’absorbance. Des résultats représentatifs des ATPases cinétiques et finales sont présentés, dans lesquels l’activité des formes sauvages et mutantes de la sécrétion ATPase/EPSE de type deux est déterminée en présence et en absence d’une cardiolipine stimulante.

Voici les résultats d’une ATPase cinétique stimulée par la cardiolipine, démontrant la libération linéaire de phosphate au fil du temps pour l’EPSE de type sauvage et un double mutant de lysine, avec de l’albumine sérique bovine servant de contrôle négatif. Ces données peuvent être représentées par la quantité de phosphate libérée par minute divisée par la concentration en protéines afin de quantifier et de comparer l’activité ATPase de chaque protéine. Les données indiquent que deux résidus de lysine, K417 et K419, contribuent à l’activité ATPase stimulée par la cardiolipine de l’EPSE.

La comparaison de l’activité ATPase des mêmes protéines sans stimulation par la cardiolipine montre que ces deux résidus de lysine ne contribuent pas à la faible activité basale de l’EPSE, mais plutôt à la capacité de la protéine à être stimulée par la cardiolipine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier rapidement et précisément l’activité ATPase des protéines purifiées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de tenir compte de la sensibilité du réactif de détection du phosphate

Pour éviter la contamination par le phosphate, nous vous recommandons d’utiliser des ustensiles en plastique jetables et de l’eau ultra-pure et d’effectuer une chromatographie d’exclusion stérique ou d’échange d’ions après la purification des protéines.