Name: Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Apprenez à générer des agrégats de taille contrôlée à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant des micropuits et une incubation hypoxique. Cette méthode améliore la différenciation cardiaque et réduit l'hétérogénéité culturelle.

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Nous remercions le Dr Peter Zandstra, dans le laboratoire duquel ce protocole a été développé, ainsi que les Drs Mark Gagliardi et Gordon Keller qui ont aidé à établir les méthodes initiales sur lesquelles ce processus a été basé. L’élaboration du protocole a été appuyée par une bourse d’études supérieures en sciences et technologie de l’Ontario à C.B. et une subvention de la Fondation des maladies du cœur de l’Ontario à Peter Zandstra.

1. Préparation des composants Medium <ol><li> Préparer Wash Medium. Par 100 ml de DMEM / F12, ajouter 1 ml de 100X pénicilline / streptomycine (Pen / Strep), 1 ml de L-glutamine 100X et 5 ml de remplacement de sérum. </li><li> Préparer la constitution chimique définie Basal cardiaque Induction moyenne selon les instructions du fabricant. </li><li> Préparer les réactifs d&#39;achat d&#39;actions suivantes pour les médias qui seront utilisés dans ce protocole. <ol><li> Acide L-Ascorbique: Préparer une solution mère de 5 mg par ml dans 4 ° C, l&#39;eau distillée ultra pure stérile dans un tube conique. <ol><li> Laissez cette solution sur la glace et le tube vortex périodiquement jusqu&#39;à ce que le soluté soit complètement dissous. Filtre à stériliser la solution d&#39;acide ascorbique à l&#39;aide d&#39;un filtre à seringue de 0,22 um. </li><li> Préparer aliquotes de 1 ml de la solution d&#39;acide ascorbique et de stocker ces aliquotes à -20 ° C. Utilisez un aliquote fraîchement décongelé chaque milieu de temps est préparé. </li></ol></li><li> Le jour de la préparation du milieu, Diluer 13 pi de monothioglycérol (MTG) dans 1 ml de Basal cardiaque Induction Medium. Jeter utilisé, MTG dilué. </li><li> Préparer aliquotes de 1 ml de la transferrine (30 mg / ml) pour stocker à -20 ° C. Magasin aliquotes décongelée à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li><li> Préparer l&#39;acide 4 mM chlorhydrique (HCl) contenant 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA). Dans une hotte aspirante, ajouter 30 ul de solution 6,0 N de HCl à 50 ml d&#39;eau distillée ultra pure. Filtre à stériliser la solution en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Ajouter 2 ml de solution de BSA à 25% à la solution 50 ml de HCl. </li><li> Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de BSA. Ajouter 20 pl de solution de BSA à 25% par ml de PBS. </li><li> Préparer Human Bone Morphogenetic Protein 4 (4-BMP) solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug de BMP-4 lyophilisé dans 1 ml d&#39;une solution tampon contenant 4 mM de HCl à 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. </li><li> Préparer Human Fibroblast Growth Factor 2 (bFGF) solution mère(10 ng / ul). Dissoudre 10 pg de bFGF lyophilisé dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. </li><li> Préparer Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) humain solution mère (5 ng / ul). Dissoudre 5 pg de VEGF lyophilisée dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. </li><li> Préparer activine Une solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug lyophilisées activine A dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA). Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. </li><li> Préparer Inhibiteur de Wnt production-2 (2-IWP) solution mère (10 mM). Dissoudre 2 mg IWP-2 dans 429 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 ul aliquotes pour stocker à -80 ° C. </li></ol></li><li> Préparer Complete Cardiac Induction Medium. Pour 100 ml de Basal cardiaque Induction moyenne, ajouter 1 ml de 100x Pen / Strep, 1 ml de 100x L-glutamine, 500 pi de transferrine, 1ml d&#39;acide ascorbique fraîchement décongelé et 300 pi de MTG. Jeter moyen utilisé. </li></ol> 2. Préparation de la plaque de micropuits NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. <ol><li> Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage (composante de kit) à chaque puits qui sera utilisé sur la plaque. Pour veiller à ce que les contacts de la solution, la surface entière à l&#39;intérieur de chaque puits, centrifuger la plaque à 840 g pendant 2 min. </li><li> Incuber la plaque pendant 30 à 60 min à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de rinçage des puits. Laver chaque puits deux fois comme suit: Ajouter 1 ml de PBS à chaque puits, la plaque centrifuge à 840 g pendant 2 min, puis aspirer le PBS. </li></ol> 3. Formation des HPSC Granulats dans la plaque de micropuits NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. <ol><li> Placez Wash Medium dans un bain d&#39;eau C 37 °. NOTE: Le volume requis = 1 ml x nombre de puits de HpSC qui sera dissociée. </li><li> Dissocier hPSCs à des cellules individuelles REMARQUE: Ces étapes décrivent la dissociation des cellules en culture sur plaques de 6 puits - les volumes de réactifs peuvent être mis à l&#39;échelle proportionnellement pour les différents formats de culture. <ol><li> Aspirer le milieu de culture de chaque culture HPSC bien pour la dissociation. Rincer chaque puits avec 1 ml de la dissociation enzymatique, puis aspirer immédiatement l&#39;enzyme de dissociation de chaque puits. NOTE: résiduelle enzyme de dissociation devrait être suffisante pour dissocier les cellules. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de lavage dans chaque puits et se dissocier mécaniquement les cellules de la surface de culture de tissu en pipetant le milieu de lavage avec une micropipette P1000 sur la surface de culture tissulaire. Si la dissociation semble être des amas cellulaires incomplètes et restent, passer la suspension à travers une passoire à ce point. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml et conserverle tube dans l&#39;incubateur pendant que la numération cellulaire est effectuée dans l&#39;étape suivante. </li><li> Effectuer une numération cellulaire: <ol><li> Prélever un échantillon de 10 ul de la suspension cellulaire recueillie dans l&#39;étape précédente. Ajouter 30 pi de bleu Trypan et mélanger la suspension bien par pipetage. </li><li> Transférer 10 pl de cellules colorées au bleu Trypan à chaque chambre d&#39;un hémocytomètre et de visualiser au microscope inversé à l&#39;objectif 10X. Compter les cellules. </li></ol></li><li> D&#39;après les résultats de comptage de cellules, calculer le nombre de puits peuvent être ensemencées à 1,2 x 10 6 cellules par puits de la plaque de micropuits. Calculer Agrégation moyen nécessaire pour ensemencer les cellules à 1 ml par puits. </li><li> Préparer le milieu d&#39;agrégation. Par 10 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 0,5 pi de BMP4 solution mère (concentration finale = 0,5 ng / ml) et Y-27632 ROCK Inhibitor (concentration finale = 10 uM). </li><li> Retirer le tube conique contenant les hPSCs de l&#39;incubateur et centrifuge du tube à 200 xg pendant 5 min. Aspirer le milieu de lavage et de remettre en suspension les cellules dans un milieu d&#39;agrégation à une densité de 1,2 x 10 6 cellules par ml. </li><li> Aspirer la solution de lavage PBS de chaque puits de la plaque de micropuits. En utilisant une micropipette P1000, répartir uniformément et semences 1 ml de la suspension cellulaire à chaque puits sur la plaque de micropuits. Pour semer un grand nombre de puits, vortex périodiquement la suspension cellulaire pour empêcher la sédimentation. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 xg pendant 5 min. Observer la plaque sous le microscope pour confirmer les cellules ont filé au fond de chaque puits. </li><li> Incuber la plaque pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2, 5% de O 2 (hypoxique) incubateur. </li></ol></li></ol> 4. cardiaque Induction Stage 1 <ol><li> Un jour suivant l&#39;agrégation (jour 1), préparer le volume requis de l&#39;étape 1 moyen d&#39;induction (pour une plaque de 24 puits, volume = 1 ml x nombre de puits). Pour 1 ml de complètemilieu d&#39;induction cardiaque, ajouter 1 pl de BMP4 solution mère (concentration finale = 10 ng / ml), 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml) et 0,6 pi d&#39;activine A (concentration finale = 6 ng / mL). Placer le milieu dans un bain-marie à 37 ° C pendant au moins 15 min. </li><li> Retirer la plaque de micropuits de l&#39;incubateur. Inspecter les agrégats sous le microscope. Par rapport à l&#39;agrégation immédiatement post-centrifugeuse, ils doivent apparaître intact avec des bords lisses (plus rond et moins carré que la veille). </li><li> Retirer le surnageant sans déranger les agrégats à l&#39;intérieur de la cupule: <ol><li> Tenir la plaque de micropuits horizontale (ie., Ne pas pencher). Pour chaque puits de la plaque de micropuits, placez la pointe d&#39;une micropipette P1000 à la surface du milieu de culture et contre le bord du puits. </li><li> Retirez lentement le moyen, en faisant attention à ne pas perturber les agrégats au fond de la cupule. Après réduction de til niveau moyen d&#39;environ 1 à 2 mm de la surface de micropuits texturée, incliner lentement la plaque pour recueillir milieu d&#39;un côté du puits (une fois que le volume est suffisamment faible, le mouvement du fluide est considérablement réduite et il est plus facile d&#39;éviter les agrégats se lever de leurs micropuits individuels). pipette lentement le reste moyen dans le puits. </li></ol></li><li> Pour ajouter frais Etape 1 Induction moyenne tout en assurant les agrégats restent dans leurs micropuits individuels: Dessinez 1 ml de la phase 1 milieu d&#39;induction avec une micropipette P1000. Maintenez la pointe de la pipette contre le bord intérieur du puits et distribuer très lentement le moyen contre la paroi intérieure du puits. Répétez l&#39;opération pour les puits restants. </li><li> Retourner la plaque dans l&#39;incubateur dans des conditions hypoxiques pendant 3 jours. </li></ol> 5. Induction cardiaque Etape 2 <ol><li> Le jour 4, place de lavage moyen (volume = nombre de puits x 2 ml) dans un bain d&#39;eau à 37 ° pour un minimum de 15 min. </li><li> Préparer le volume nécessaire de la phase 2 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml): Par ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 2 pi de solution VEGF de stock (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 ul IWP-2 solution mère (concentration finale = 5 uM). Placer le stade 2 préparé un milieu d&#39;induction dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min. </li><li> En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, récolter les agrégats de chaque puits de la plaque de micropuits et de recueillir la suspension totale dans un tube de 15 ml conique (recueillir jusqu&#39;à 10 puits par 15 ml tube). </li><li> Permettre aux agrégats de se déposer pendant 15 minutes dans un incubateur à hypoxique. REMARQUE: Cette étape est importante pour séparer les cellules individuelles et les débris cellulaires des agrégats intacts. </li><li> Aspirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les agrégats dans 10 ml de la pré-chauffé Wash Medium pour éliminer les cytokines inductifs résiduelles (par exemple, l&#39; activine A est une molécule de signalisation puissante , même à très faible concentrations). </li><li> Centrifuger les granulats à 50 x g pendant 2 min. Aspirer le surnageant. Resuspendre les agrégats granulées dans l&#39;induction 2 Medium préchauffée. </li><li> Transférer la suspension totale à une plaque de fixation ultra-bas 24 puits (ULA) à 1 ml par puits. Observer les agrégats sous le microscope comme uniforme, des amas de cellules serrées. Incuber dans des conditions hypoxiques jusqu&#39;au jour 6. </li></ol> 6. cardiaque Induction Etape 3 <ol><li> Le jour 6, préparer le volume nécessaire de la phase 3 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml). Pour 1 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajoutez VEGF solution mère 2 pl (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml). Placer préparé Etape 3 milieu d&#39;induction dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min. </li><li> Utiliser une pipette 5 ml sérologiques pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu&#39;à 10 ml d&#39;agrégats par tube. </li><li> Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats dans le pré-chauffé Etape 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits. </li><li> Au jour 10, le volume nécessaire de préparer de l&#39;étape 3 à induction moyenne (volume = nombre de puits x 1 ml) comme indiqué à l&#39;étape 6.1. </li><li> Utilisez 5 ml pipette sérologique pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu&#39;à 10 ml d&#39;agrégats par tube. </li><li> Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats au stade 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits. </li><li> Incuber dans des conditions hypoxiques pendant deux jours. Au jour 12, commencer l&#39; incubation des cellules à des niveaux d&#39;oxygène normoxiques pendant le reste de la période de culture (37 ° C, 20% de O 2, 5% CO 2). REMARQUE:Après ce point de temps, les cellules ne sont plus cultivées dans des conditions hypoxiques. </li><li> Répétez cet échange milieu complet (étapes 6.2 et 6.3) tous les 4 jours, à partir de 14 jours jusqu&#39;à la récolte de cellules (typiquement, les concentrations de cardiomyocytes pics sont observés après 14 jours de différenciation). </li></ol> 7. cytométrie de flux Analyse de Troponine T (cTnT) Expression Fréquence des micropuits Culture sortie <ol><li> Dissocier les agrégats comme suit: <ol><li> Utiliser une pipette de 5 ml sérologiques pour transférer 1 puits d&#39;agrégats à un tube conique de 15 ml. Centrifuger les agrégats à 50 g pendant 2 min et aspirer soigneusement le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de solution fraîchement dissous 1 mg / ml de collagénase de type II aux agrégats. Transférer la suspension totale à un tube de 1,5 ml. Incuber les agrégats dans la collagénase de type II pendant une nuit à température ambiante. </li><li> Le jour suivant, utiliser une micropipette P1000 pour dissocier doucement les agrégatsdans une suspension homogène de la cellule unique. Si les agrégats ne se dissocient pas facilement, régler les agrégats, aspirer le surnageant, et incuber les agrégats dans 700 ul de Dissociation enzymatique pour 1 à 2 min à température ambiante. pipeter doucement les agrégats 1 à 2 fois avec une micropipette P1000 à dissocier. </li><li> Diluer l&#39;enzyme de dissociation: Ajouter 700 pi de milieu de lavage contenant 14 pi de 1 mg / ml solution de DNase. Prenez un échantillon de 10 pi pour effectuer une numération cellulaire, et centrifuger la suspension restante en utilisant une microcentrifugeuse de paillasse à 300 g pendant 2 min. </li></ol></li><li> Effectuer une numération cellulaire: Colorer le 10 ul comptage échantillon avec un volume égal de bleu Trypan et compter en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Retirez le tube de 1,5 ml contenant les cellules restantes de la microcentrifugeuse. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 200 000 à 500 000 cellules par 100 pi, dans une solution saline équilibrée de Hanks contenant2% de sérum bovin fœtal (HF). </li><li> Pour chaque condition, transférer 100 ul de suspension cellulaire par puits à 2 puits d&#39;une plaque à 96 puits (un puits sera coloré avec l&#39;anticorps cTnT et l&#39;autre sera le contrôle de l&#39;anticorps secondaire). </li><li> Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Retirer le surnageant avec une micropipette multicanaux. </li><li> Fixer les cellules: Ajouter 200 pi de solution de fixation (composant du kit) par puits et incuber la plaque pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Utilisez une micropipette multicanaux de retirer soigneusement le surnageant des puits. Jeter le surnageant dans un conteneur de déchets de paraformaldehyde. </li><li> Laver les cellules fixées à deux reprises: Ajouter 200 pi de HF à chaque puits. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. Les cellules fixées peuvent être stockées pendant jusqu&#39;à une semaine dans HF à 4 ° C. </li><li> Perméabiliser les cellules: <ol><li> Centrifuger la plaque à 300g pendant 2 min. </li><li> Ajouter 100 pi de solution de perméabilisation (composant du kit) à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min et aspirer le surnageant. </li></ol></li><li> Préparer un mélange maître d&#39;anti-cTnT en HF à la concentration optimale pour le numéro de lot donné (La dilution optimale doit être déterminée par titrage et est généralement comprise entre 1: 500 à 1: 2000). </li><li> Pour chaque condition (2 puits par condition), ajouter 100 pi de mélange maître d&#39;un puits (échantillon coloré) et 100 pi de HF plaine à l&#39;autre bien (contrôle d&#39;anticorps secondaire). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> Préparer un mélange maître de l&#39;anticorps secondaire. Transférer un volume de HF qui correspond à 100 pi pour chaque puits (contrôle de l&#39;anticorps secondaire etcTnT tachée) traitée. Ajouter 1 pi d&#39;anticorps secondaire de chèvre anti-souris-APC par 200 ul de HF (dilution 1: 200). </li><li> Colorer les échantillons. Ajouter 100 pi de solution de coloration dans chaque puits (à la fois le contrôle de l&#39;anticorps secondaire et les puits anti cTnT colorés). Incuber les cellules dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 30 min (garder la plaque couverte ou dans l&#39;obscurité après avoir ajouté un anticorps secondaire fluorescent pour éviter photoblanchiment). </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> Transférer les échantillons à 5 ml flux fond rond cytomètre tubes d&#39;analyse et d&#39; effectuer de cytométrie en flux pour le signal dans le canal APC en utilisant les protocoles standards de l&#39;instrument 19. </li></ol>

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M.U. a un intérêt financier dans la technologie sous-jacente des micropuits.

Il a été observé que la différenciation cardiaque efficace de cellules souches pluripotentes est un processus très variable. Bien qu&#39;il ne soit pas surprenant que les différentes lignées cellulaires présentent différentes inclinations pour la capacité de différenciation de types de cellules spécifiques, il a été observé que l&#39; efficacité de la différenciation cardiaque varie considérablement entre répliquée exécute à l&#39; aide de la même lignée cellulaire 6. Le protocole décrit ici répond à l&#39;une des principales sources de cette variabilité en contrôlant directement le numéro de cellule d&#39;entrée par agrégat. Pour réduire davantage la variabilité entre les courses, il est recommandé que les lignes HPSC adaptées aux passages à cellule unique sont utilisés, car cette forme de résultats d&#39;expansion et d&#39; entretien HPSC dans les populations pluripotentes plus cohérentes par rapport aux fréquences d&#39;expression de marqueurs de pluripotence (par exemple, Oct4, Nanog, Tra-1-60, etc.). Le protocole écrit ici spécifie une taille globale de 1000 cellules pour oinduction cardiaque ptimal de la lignée de cellules souches embryonnaires HES-2. Pour appliquer ce protocole à différentes lignées cellulaires, il est essentiel que l&#39;écran initial de la taille des agrégats être effectuée pour déterminer la taille globale optimale lignée cellulaire spécifique. Bien qu&#39;il n&#39;a pas d&#39;impact directement sur les procédures à suivre ici, nous rappelons au lecteur que les changements dans la taille des agrégats et de la densité globale de la cellule devrait influer sur l&#39;apport d&#39;oxygène. Cela peut devenir une considération pertinente dans les applications en aval. De plus, la mort cellulaire apoptotique est une préoccupation lors de la dissociation de hPSCs aux cellules individuelles. Par conséquent, il est essentiel de veiller à ce que l&#39;inhibiteur de ROCK est présent lors de l&#39;agrégation cellulaire forcé dans les micropuits. Enfin, il est essentiel que le jour 4 de la différenciation des agrégats sont bien lavés pour éliminer les traces de l&#39;activine A, présent dans l&#39;induction 1 moyen, avant remise en suspension dans Induction 2 Medium. Après 4 jours de différenciation, activine A favorise la différenciation de l&#39;endoderme au détriment de la mésoderm induction 20. La principale application de cette technique est de dépister tailles d&#39;agrégats qui favorisent la différenciation cardiaque efficace. Cependant, une des limites de la technique actuelle est qu&#39;il est difficile à l&#39;échelle de production cardiaque à des niveaux cliniquement pertinents en utilisant des plaques de micropuits. Mise à l&#39; échelle de la différenciation cardiaque est généralement effectuée dans des conditions de culture en vrac dans des bioréacteurs de suspension agités 21. Par conséquent, une fois que le système de micro-puits a été utilisé pour déterminer les plages acceptables de la taille des agrégats pour l&#39;induction cardiaque efficace, la prochaine étape à plus grande échelle consiste à déterminer les vitesses de roue bioréacteur qui peut générer la taille de l&#39;agrégat cellulaire désirée. L&#39;une des différences significatives de cette technique par rapport à d&#39;autres méthodes pour la différenciation cardiaque globale basée est qu&#39;il permet de diriger des enquêtes en modulant les effets de la signalisation endogène dans les agrégats ainsi quela co-culture de différents types de tissus à induction / inhibition avec les hPSCs dans l&#39;agrégat 13. Ces types d&#39;enquêtes peuvent éclairer l&#39;élaboration des processus de production cardiaque à grande échelle.

Dans une culture cellulaire in vitro peut être effectuée dans un certain nombre de modalités, mais elle est généralement effectuée soit dans des conditions adhérentes à deux dimensions ou dans des conditions de suspension en trois dimensions qui récapitulent plus complètement dans des systèmes in vivo. Par conséquent, il y a une tendance croissante dans de nombreux domaines de la recherche pour développer des méthodes robustes pour générer des constructions de tissu en trois dimensions. Dans les scénarios où les types et les processus cellulaires nécessitent un soutien matrice extracellulaire (ECM) des signaux de surface et d&#39; adhérence, en trois dimensions de la culture peut être activé par l&#39; intermédiaire des constructions échafaudés, où les cellules sont cultivées sur ou dans un exogène matrice support 1. Les cellules et les processus qui ne nécessitent pas l&#39; adhésion à une matrice de soutien peuvent être effectuées en suspension que les systèmes unscaffolded composés principalement ou exclusivement de cellules (qui peut alors procéder pour générer leurs propres matrices endogènes) 2,3. Ici, nous présentons un protocole cardiaque différenciation of cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs - cellules souches capables de devenir tout type de cellule dans le corps, que ce soit à partir de sources embryonnaires ou autres) en taille contrôlée, uniforme, des agrégats unscaffolded. Différenciation des hPSCs que les agrégats de suspension est en proie à de grandes variations dans la taille des agrégats à la fois dans une course et entre pistes. Cette variabilité est une conséquence de la méthode habituellement utilisée pour produire ces agrégats, ce qui implique une dissociation mécanique des colonies de cellules. Afin de réduire cette variabilité, un certain nombre d&#39;approches ont été utilisées pour contrôler le nombre de cellules par agrégat, ainsi que le diamètre global de l&#39;homogénéité. Des exemples comprennent la formation d&#39;agrégats dans des microtubes 4 ou 5 gouttes comme tenture, micromodelage définies colonies HPSC bidimensionnelles 6 qui peuvent ensuite être transférés à la suspension, ou la centrifugation des cellules en U ou en plaques multi-puits à fond en V 7,8, 9. Cependant, tous ces approches sont limités par leur faible capacité de production globale. systèmes basés bien utilisent une approche similaire à celle des systèmes de plaques à fond en V, mais la plus petite taille des micropuits (dans ce protocole ayant chacune une largeur de 400 um) permet la génération d&#39;un plus grand nombre d&#39;agrégats uniformes d&#39;une culture-plaque seul puits (diamètre standard de ~ 15,5 mm contenant ~ 1200 micropuits) que celle qui serait produite à partir de toute une plaque de fond en V 10. La formation d&#39; agrégats à base bien a été utilisé dans un certain nombre de paramètres , y compris la différenciation des hPSCs à ectodermique 11, endodermique 12, mésodermiques 13 et 14 extraembryonnaires destins; chondrogenèse de cellules souches mésenchymateuses 15; génération de substrats uniformes pour le dépistage toxicologique 16; et les enquêtes de mécanobiologie 17. Un défi majeur dans le développement de protocoles de fabrication robustes pour la production de cardiom HPSC dérivésyocytes a été le manque de reproductibilité de l&#39;efficacité de la différenciation cardiaque entre les courses. Nous avons déjà démontré que cette variabilité peut être attribuée à l&#39; hétérogénéité de la population à partir HPSC, qui comprend à la fois des cellules auto-renouvellement et de différenciation hPSCs qui expriment des gènes associés à la différenciation neuronale endoderme et 6,18. Signaux sécrétées par ces cellules différenciées impact sur l&#39;induction cardiaque. Plus précisément, l&#39;endoderme extra-embryonnaire favorise l&#39;induction cardiaque, tandis que les cellules progénitrices neurales inhibent l&#39;induction cardiaque. Lors de l&#39; agrégation HPSC, les cellules au sein de la différencier globale et organiser de telle sorte que hPSCs indifférenciées sont entourés par une couche de cellules de l&#39; endoderme extra - embryonnaires qui se développent sur la surface totale 13. En contrôlant la taille des agrégats, on peut moduler le rapport des cellules de l&#39; endoderme cardiaques induisant à hPSCs indifférenciées (de surface au rapport de volume) et d&#39; optimiser ce ratio pour l&#39; induction cardiaque maximale 13.

<table><tbody><tr><td>Aide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à</td><td></td><td></td><td></td>la pipette</tr><tr><td>Pipettes sérologiques (5 à 25 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>Aspirateur ou Pasteur</tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td><td></td>coniques de 15 et 50 ml</tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 & micro ; Filtre</td><td></td><td></td><td></td>à seringue</tr><tr><td>5 % CO2, 5 % O2, et incubateur de culture cellulaire à humidité contrôlée&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Incubateur hypoxique (faible teneur en oxygène)</td></tr><tr><td>5 % CO2, 20 % O2, et incubateur de culture cellulaire à humidité contrôlée.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à basse vitesse avec rotor à godets oscillants équipée d’un porte-plaque&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes P2, P20, P200 et P1000 et pointes associées&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé avec objectifs de phase 4X, 10X et 20X&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixation ultra-basse (ULA) Plaques à 24 puits&nbsp ;</td><td>Corning/Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td>de<td>microcentrifugation de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de paillasse</tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée stérile ultrapure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg ; C congélateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Toxique ; L’aliquotage de MTG est fortement recommandé pour minimiser l’oxydation due aux ouvertures répétées. Les aliquotes peuvent être stockées à 4 &deg ; C jusqu’à 3 mois, -20 &deg ; C est recommandé pour le stockage à long terme.</td></tr><tr><td>StemPro-34 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639-011</td><td>Milieu d’induction cardiaque basale ; Le supplément est stocké à -20 &deg ; C et le milieu basal à 4 °C.</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D Technologies</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Technologies</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Technologies</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Réactifs Direct</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde corrosif (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100x Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Remplacement du sérum knockout</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563</td><td>Enzyme de dissociation</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400</td><td>plaques StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>Plaques Microwell</td></tr><tr><td>Solution de rinçage Aggrewell</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>Microwell Rinsing Solution</td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibiteur de ROCK</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée Hank’s</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483</td><td></td>Plaque</tr> à <tr><td>96 puits (pour coloration FACS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif de perméabilisation intraprep</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2389</td><td>Kit avec 2 parties : solution de fixation et solution de perméabilisation ; Néomarqueurs toxiques</td></tr><tr><td>d’anticorps cTnT</td><td>²</td>.<td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris-IgG APC anticorpsSondes</td><td>moléculaires</td><td>ThermoFisher A865</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubes de cytométrie à flux rond à fond</td><td>FACS dépendant</td><td></td><td></td> de la machine</tr></tbody></table>

aggregate optimization taille en micropuits pour base suspension-cardiaque différenciation des pluripotentes humaines cellules souches

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

La différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) est généralement réalisée dans des agrégats de cellules en suspension. La formation conventionnelle d’agrégats de hPSC implique la dissociation des colonies cellulaires en amas plus petits, le contrôle de la taille des amas étant grossièrement contrôlé en pipetant la suspension cellulaire jusqu’à ce que la taille souhaitée soit atteinte. L’un des principaux défis de la différenciation cardiaque conventionnelle basée sur les agrégats des hPSC est que l’hétérogénéité de la culture et la désorganisation spatiale conduisent à un rendement variable et inefficace des cardiomyocytes. Nous et d’autres avons déjà rapporté que la taille globale des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peut être modulée pour optimiser l’efficacité de l’induction cardiaque. Nous avons relevé ce défi en utilisant une approche évolutive basée sur les micropuits pour contrôler les paramètres physiques de la formation des agrégats, en particulier la taille et la forme des agrégats. La méthode que nous décrivons ici consiste en l’agrégation forcée de nombres de hPSC définis dans des micropuits, et la culture ultérieure de ces agrégats dans des conditions qui dirigent l’induction cardiaque. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle en fonction de la taille et du nombre de puits utilisés. En utilisant cette méthode, nous pouvons obtenir des résultats de culture constants avec des fréquences de cardiomyocytes supérieures à 70 %.

les agrégats de taille contrôlée de manière efficace hPSCs peuvent être formés en utilisant le système de micro-puits, dépendant uniquement de la concentration des cellules et la surface de microtitration. Après une brève centrifugation, le nombre approprié de cellules (1000 dans ce protocole) sont réunis dans chaque puits (figure 1A). Fait important, ces cellules rétablir les connexions intracellulaires dans les 24 heures, et ne doivent plus remplir le puits, mais apparaissent sous forme d&#39; agrégats compacts avec des bords lisses (figure 1B). Ces agrégats fournissent les matières premières pour une différenciation plus poussée vers un destin cardiaque. Si les cellules ne parviennent pas à former des grappes serrées, cela suggère possible la mort cellulaire après la dissociation et réagrégation et la pertinence des concentrations de repiquage de cellules et inhibiteurs de ROCK simples pour une lignée cellulaire particulière devrait être examinée. Les trois jours suivants à micropuits montrent peu de changement dans morpho globallogie, bien que certains la croissance est évidente. Lorsqu&#39;ils sont retirés de la cupule, les agrégats doivent maintenir leur tour, la morphologie serrés et être d&#39;une taille similaire à l&#39;autre (figure 1C). ULA culture dans des plaques à 24 puits permettra en outre l&#39;expansion des cellules et la croissance. Le jour 8, après la première exposition à la signalisation activine, et l&#39; inhibition de Wnt, les agrégats commencent à apparaître sous forme d&#39; agrégats plus grands et plus lumineux (Figure 1D). Pendant cette période, les débris cellulaires considérable sera évident au fond de chaque puits et doit être enlevé en permettant de régler les agrégats avant de retirer les médias. De temps en temps, de nombreux agrégats vont fusionner ensemble. Cela ne va pas inhiber la différenciation d&#39;autres agrégats dans le puits, bien que ces agrégats «super» ont tendance à ne pas présenter les modifications morphologiques observées avec des agrégats plus petits et sont moins susceptibles de subir une différenciation complète. &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Résultats de la différenciation Suite à des changements morphologiques notables aux agrégats avec une augmentation de la taille et l&#39;aspect des régions fibreuses organisées. Le jour 12, les agrégats contractants peuvent être observés. Ceux - ci seront toujours composées de grandes cellules transparentes et comprennent souvent une vaste matrice extracellulaire à l&#39;extérieur de l&#39;ensemble (figure 2). Alors que les contractions agrégées à l&#39;échelle indiquent une différenciation réussie, l&#39;expression cardiaque marqueur peut également être observé dans les agrégats qui ne semblent pas se contracter. Après la dissociation des agrégats et immunomarquage, la majorité des cellules sont positives pour le marqueur cTnT des cardiomyocytes par cytométrie de flux (Figure 3). L&#39;expression de ce marqueur est stable dans les cellules et peut être observé dans les agrégats aussi tard que le jour 19 de la différenciation. 1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Chronologie de HPSC différenciée vers un destin cardiaque Immédiatement après l&#39; agrégation, les cellules remplissent presque chaque micropuits (A).. Un jour plus tard, les agrégats semblent condensés et lisse (B). Cette morphologie persiste même lorsque les agrégats sont retirés des micropuits et étalées dans des plaques à puits (C). Le jour 8, les agrégats commencent à se développer et apparaissent plus légers en couleur (D). Barre d&#39; échelle:. 250 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> Figure 2: Granulats Begin contractant par Jour 12 de Différenciation Après six jours d&#39;induction cardiaque Étape 3 moyenne, contractions agrégées à l&#39; échelle énergiques ont été observés (panneau supérieur:. Détendreation, panneau central: contraction). Le panneau inférieur est dérivé de soustraire les panneaux supérieurs et intermédiaires, avec la plupart des différences significatives apparaissant comme noires ou blanches (flèches). Barre d&#39; échelle:. 250 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> Figure 3:. Immunomarquage pour Troponine T dans Differentiated hPSCs Au jour 17, la plupart des cellules sont positives pour la troponine T cardiaque par cytométrie de flux (histogramme rempli). Sont également indiquées les cellules colorées avec l&#39; anticorps secondaire seul (histogramme non rempli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les méthodes conventionnelles pour initier la différenciation cardiaque sur la base globale de suspension de tiges pluripotentes humaines (cellules hPSCs) sont en proie à la culture hétérogénéité par rapport à la taille des agrégats et la forme. Ici, nous décrivons une méthode robuste pour la différenciation cardiaque en employant des micropuits pour générer taille contrôlée HPSC agrégats cultivés dans des conditions favorisant cardiaques.

Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Commencez par centrifuger une suspension de cellules souches pluripotentes humaines, ou HPSC, en simple cellule, à 200 × g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez le milieu de lavage et resuspendez les cellules dans un milieu d'agrégation, à une densité de 1,2 × 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, ensemencez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de micropuits préparée, et répartissez uniformément les cellules.Pour ensemencer un grand nombre de puits, vortexez périodiquement la suspension cellulaire afin d'éviter la décantation. Après l'ensemencement, centrifugez la plaque à 200 × g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, observez la plaque au microscope afin de confirmer que les cellules ont été déposées au fond de chaque micropuits.Ensuite, incuber la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur hypoxique contenant 5 % de CO₂ et 5 % de O₂. Un jour après l'agrégation, examiner les agrégats au microscope. Par rapport aux agrégats juste après la centrifugation, ils doivent apparaître intacts avec des bords lisses.Retirer le surnageant en tenant la plaque de micropuits horizontalement et en plaçant la pointe d'une micropipette P-1000 à la surface du milieu de culture, contre le bord du puits. Ensuite, retirer lentement le milieu en prenant soin de ne pas perturber les agrégats situés au fond des micropuits. Après avoir réduit le niveau du milieu à environ un à deux millimètres de la surface texturée des micropuits, incliner lentement la plaque et aspirer doucement le milieu restant du puits.Ajoutez un millilitre de milieu d'induction fraîchement préparé et préchauffé de première étape en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi interne du puits, puis en délivrant très lentement le milieu contre la paroi intérieure du puits. Replacez la plaque dans l'incubateur dans des conditions d'hypoxie pendant trois jours. Au quatrième jour, utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour récolter les agrégats de chaque puits de la plaque à micropuits.Prélevez jusqu'à 10 puits de suspension d'agrégats dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les agrégats se tasser pendant 15 minutes dans un incubateur hypoxique. Une fois les agrégats tassés, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les agrégats en suspension dans dix millilitres de milieu de lavage préchauffé, afin d'éliminer les cytokines inductrices résiduelles.Centrifuger les agrégats à 50 × g pendant deux minutes. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et resuspendre les agrégats en pellet dans un milieu d'induction préchauffé de stade deux. Transférer la suspension d'agrégats dans une plaque à 24 puits à attachement ultra-faible, avec un millilitre par puits.Observer les agrégats au microscope comme des agrégats cellulaires compacts et uniformes. Incuber dans des conditions d’hypoxie jusqu’au sixième jour. Au sixième jour, regrouper jusqu’à 10 millilitres d’agrégats par tube conique de 15 millilitres, comme précédemment.Une fois les agrégats déposés, aspirez le surnageant et resuspendez les agrégats dans le milieu d'induction préchauffé de stade trois. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, répartissez les agrégats dans une plaque de culture à 24 puits à attachement ultra-faible, avec un millilitre par puits. Effectuez un changement complet de milieu au jour 10 de la culture.Le jour 12, transférer les cellules dans des conditions de culture normoxiques à 20 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pour la durée restante de la culture. Après 12 jours de différenciation, correspondant à six jours dans le milieu d'induction cardiaque de stade trois, des contractions vigoureuses au niveau de l'ensemble des agrégats ont été observées. Au jour 17, 74,8 % des cellules sont positives pour la troponine T cardiaque, selon la cytométrie en flux, comme indiqué par la partie remplie de l'histogramme.On voit également des cellules marquées uniquement par l'anticorps secondaire, indiquées par la section non remplie de l'histogramme. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien laver les agrégats au quatrième jour, afin d'éliminer les traces de cytokines, en particulier l'activine-A, qui favorise la différenciation en endoderme au détriment de l'induction cardiaque. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la culture à température contrôlée de types cellulaires inducteurs au sein de l'agrégat, peuvent être mises en œuvre pour répondre à d'autres questions, par exemple sur la manière dont la signalisation paracrine provenant des tissus embryonnaires voisins influence la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines vers la lignée cardiaque.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la culture de cellules uniques avec une plateforme microfluidique, qui utilise un nouveau concept de conception de micropuits pour permettre l’isolement de cellules uniques à haute efficacité et la culture clonale à long terme.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Ici, nous présentons un protocole de différenciation des cardiomyocytes robuste, rapide et évolutif pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cardiomyocytes dérivés à l’aide de cette méthode à grande échelle peuvent fournir un nombre suffisant de cellules pour leur utilisation efficace dans la modélisation des maladies cardiovasculaires humaines, le criblage de médicaments à haut débit et potentiellement des applications cliniques.

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Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

Un ensemble de protocoles pour la génération et la cryoconservation de sphéroïdes cardiaques (CS) à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme cultivés dans un format multidimensionnel à haut débit est présenté. Ce modèle tridimensionnel fonctionne comme une plate-forme robuste pour la modélisation des maladies, les criblages à haut débit et conserve sa fonctionnalité après cryoconservation.

Génération, criblage à haut débit et biobanque de sphéroïdes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes d’origine humaine

Les organoïdes sont devenus des outils précieux pour la modélisation des maladies. La matrice extracellulaire (MEC) guide le destin cellulaire pendant la génération d’organoïdes, et l’utilisation d’un système qui ressemble au tissu natif peut améliorer la précision du modèle. Cette étude compare la génération d’organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des ECM d’origine animale et des hydrogels sans xéno.

Etude comparative des matrices de membrane basale pour l’entretien des cellules souches humaines et la génération d’organoïdes intestinaux

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Apprenez à générer des agrégats de taille contrôlée à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant des micropuits et une incubation hypoxique. Cette méthode améliore la différenciation cardiaque et réduit l'hétérogénéité culturelle.

Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal

Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches

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