Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches
September 25th, 2016
Les méthodes conventionnelles pour initier la différenciation cardiaque sur la base globale de suspension de tiges pluripotentes humaines (cellules hPSCs) sont en proie à la culture hétérogénéité par rapport à la taille des agrégats et la forme. Ici, nous décrivons une méthode robuste pour la différenciation cardiaque en employant des micropuits pour générer taille contrôlée HPSC agrégats cultivés dans des conditions favorisant cardiaques.
Tout d’abord, centrifugez une cellule souche pluripotente humaine unicellulaire, ou suspension HPSC, à 200 fois g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirer le milieu de lavage et remettre en suspension les cellules dans le milieu d’agrégation, à une densité de 1,2 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, ensemencez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits sur la plaque de micropuits préparée et répartissez uniformément les cellules.
Pour ensemencer un grand nombre de puits, vortex périodiquement la suspension cellulaire pour éviter qu’elle ne se dépose. Après l’ensemencement, centrifugez la plaque à 200 fois g pendant cinq minutes. Après le spin, observez la plaque au microscope pour confirmer que les cellules ont tourné au fond de chaque micropuits.
Ensuite, incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur hypoxique 5 %C-O deux, 5 %O deux. Un jour après l’agrégation, inspectez les agrégats au microscope. Par rapport à l’agrégation immédiatement après la centrifugeuse, ils doivent apparaître intacts avec des bords lisses.
Retirez le surnageant en tenant la plaque du micropuits horizontalement et en plaçant la pointe d’une micropipette P-1000 à la surface du milieu de culture et contre le bord du puits. Ensuite, retirez lentement le milieu en faisant attention de ne pas déranger les agrégats au fond des micropuits. Après avoir réduit le niveau du fluide à environ un à deux millimètres de la surface texturée du micropuits, inclinez lentement la plaque et aspirez lentement le milieu restant du puits.
Ajoutez un millilitre de milieu à induction de la première étape préchauffé fraîchement préparé en tenant la pointe de la pipette contre le bord intérieur du puits et en distribuant très lentement le milieu contre la paroi intérieure du puits. Remettez la plaque dans l’incubateur dans des conditions hypoxiques pendant trois jours. Le quatrième jour, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, prélever les agrégats de chaque puits de la plaque de micropuits.
Recueillir jusqu’à 10 puits de suspension d’agrégats dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les agrégats reposer pendant 15 minutes dans un incubateur hypoxique. Une fois que les agrégats se sont déposés, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les agrégats en suspension dans dix millilitres de milieu de lavage préchauffé, pour éliminer les cytokines inductives résiduelles.
Centrifugez les agrégats à 50 fois g pendant deux minutes. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension les agrégats granulés dans un milieu d’induction préchauffé de la deuxième étape. Transférez la suspension d’agrégats sur une plaque de fixation à ultra-faible teneur de 24 puits à raison d’un millilitre par puits.
Observez les agrégats au microscope sous forme d’amas uniformes à cellules serrées. Incuber dans des conditions hypoxiques jusqu’au sixième jour. Le sixième jour, accumulez jusqu’à 10 millilitres d’agrégats par tube conique de 15 millilitres comme précédemment.
Une fois que les agrégats se sont déposés, aspirez le surnageant et suspendez à nouveau les agrégats dans le milieu d’induction préchauffé de la troisième étape. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, redistribuez les agrégats dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits, à raison d’un millilitre par puits. Effectuez un changement complet de milieu au 10e jour de la culture.
Le 12e jour, transférez les cellules dans des conditions de culture normoxiques de 20 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pour le reste de la période de culture. Après 12 jours de différenciation, ce qui correspond à six jours au stade d’induction cardiaque, trois, des contractions moyennes et énergiques à l’échelle de l’agrégat ont été observées. Au 17e jour, 74,8 % des cellules sont positives pour la troponine T cardiaque, par cytométrie en flux, comme l’indique la partie remplie de l’histogramme.
Sont également montrées les cellules colorées avec l’anticorps secondaire seul, comme le montre la section non remplie de l’histogramme. Lors de cette procédure, il est important de bien laver les agrégats le quatrième jour, afin d’éliminer les traces de cytokines, en particulier l’activine-A, qui favorise la différenciation de l’endoderme, au détriment de l’induction cardiaque. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la culture froide de types de cellules inductives dans l’agrégat, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions, telles que la façon dont la signalisation paracrine des tissus embryonnaires voisins influence la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines dans la lignée cardiaque.
Aperçu
Cet article présente une méthode robuste pour la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes humaines (CSPH) utilisant des micropuits pour générer des agrégats de taille contrôlée. La méthode résout les problèmes d'hétérogénéité de culture associés aux techniques conventionnelles.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Biologie des cellules souches
- Différenciation cardiaque
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPH) peuvent se différencier en divers types cellulaires, y compris les cellules cardiaques.
- Les méthodes conventionnelles aboutissent souvent à des agrégats de tailles et de formes variées, affectant les résultats de différenciation.
- La technologie des micropuits offre une solution pour générer des agrégats uniformes.
- Les conditions favorisant la différenciation cardiaque sont essentielles pour une différenciation efficace.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour générer des agrégats de CSPH de taille contrôlée.
- Améliorer la cohérence des résultats de différenciation cardiaque.
- Faciliter la recherche ultérieure en ingénierie tissulaire cardiaque.
Méthodes utilisées
- Centrifugation de la suspension de CSPH pour former des agrégats.
- Utilisation de plaques à micropuits pour contrôler la taille des agrégats.
- Incubation dans des conditions hypoxiques pour favoriser la différenciation cardiaque.
- Changements séquentiels de milieu pour induire les étapes de différenciation.
Résultats principaux
- Des agrégats uniformes ont été formés et maintenus tout au long du processus de différenciation.
- Une expression significative de la troponine T cardiaque a été observée dans les cellules différenciées.
- L'amélioration de l'élimination des cytokines inductives a amélioré l'engagement de la lignée cardiaque.
- Des contractions à l'échelle de l'agrégat ont été notées après 12 jours de différenciation.
Conclusions
- La méthode des micropuits fournit une approche fiable pour la différenciation cardiaque des CSPH.
- Les agrégats de taille contrôlée conduisent à des résultats de différenciation plus cohérents.
- Cette technique peut être appliquée pour étudier davantage le développement cardiaque et la modélisation des maladies.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Controlling aggregate size in suspension-based cardiac differentiation addresses a key bottleneck in hPSC-derived cardiomyocyte production: culture heterogeneity leading to variable yields. By enforcing uniform aggregate formation via microwell technology, this method enhances predictive confidence in differentiation outcomes, supporting scalable and reproducible preclinical model generation. This positions the approach as a strategic tool for de-risking cardiac lineage commitment in early discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of size-dependent signaling pathways in cardiac induction, clarifying mechanistic drivers of lineage specification.
- Operational Value: Reduces variability in aggregate formation, improving reproducibility across experiments and teams.
- Predictive Value: Supports dose-response modeling of morphogen exposure by standardizing aggregate geometry as a controlled variable.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces uniform microtissues suitable for high-content imaging and flow cytometry-based cardiomyocyte quantification.
- Scalability: Microwell plate format allows parallel processing of multiple conditions or genetic backgrounds for comparative screening.
- Quantitative Output: Enables consistent measurement of cardiac troponin T-positive cells as a functional readout for compound or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Generates scalable, homogeneous cardiac aggregates for modeling inherited cardiomyopathies or drug-induced cardiotoxicity.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage differentiation with preclinical validation by providing lot-to-lot consistent cellular material.
- Mechanistic De-risking: Minimizes confounding variables from aggregate size heterogeneity, increasing confidence in phenotype-to-genotype associations.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized hPSC differentiation, which feeds into downstream applications such as disease modeling, safety pharmacology, and regenerative medicine candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing around biophysical cues in cardiac lineage commitment through precise control of aggregate size and shape.
- Screening: Delivers reproducible microtissue arrays for compound library screening with reduced noise from aggregation variability.
- Analytics: Facilitates quantitative flow cytometry and imaging readouts (e.g., cardiac troponin T) with improved signal-to-noise due to population homogeneity.
- Translational Research: Provides a scalable source of cardiomyocytes for preclinical functional assays, including contractility and electrophysiology.
- Enterprise Reuse: Microwell plates can be reused across projects and cell lines, supporting platform-level standardization in stem cell differentiation workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in differentiation outcomes by minimizing biological noise from aggregate size variation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized, scalable aggregate formation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in early cardiac programs by reducing false negatives from inefficient differentiation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted resource allocation based on reliable cardiomyocyte yield metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture, aggregate handling, and hypoxic incubation systems.
- Dependent on access to microwell plates with defined well dimensions and low-attachment surfaces.
- Necessitates standardized medium exchange protocols to avoid aggregate disruption during washing steps.
- Requires validation across hPSC lines to ensure size-to-differentiation efficiency relationships are consistent.
- Limited by the need for specialized equipment (hypoxic incubators, low-attachment plates) and optimized cytokine wash steps to prevent off-target differentiation.
