Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches
25 septembre 2016
Les méthodes conventionnelles pour initier la différenciation cardiaque sur la base globale de suspension de tiges pluripotentes humaines (cellules hPSCs) sont en proie à la culture hétérogénéité par rapport à la taille des agrégats et la forme. Ici, nous décrivons une méthode robuste pour la différenciation cardiaque en employant des micropuits pour générer taille contrôlée HPSC agrégats cultivés dans des conditions favorisant cardiaques.
Tout d’abord, centrifugez une cellule souche pluripotente humaine unicellulaire, ou suspension HPSC, à 200 fois g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirer le milieu de lavage et remettre en suspension les cellules dans le milieu d’agrégation, à une densité de 1,2 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, ensemencez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits sur la plaque de micropuits préparée et répartissez uniformément les cellules.
Pour ensemencer un grand nombre de puits, vortex périodiquement la suspension cellulaire pour éviter qu’elle ne se dépose. Après l’ensemencement, centrifugez la plaque à 200 fois g pendant cinq minutes. Après le spin, observez la plaque au microscope pour confirmer que les cellules ont tourné au fond de chaque micropuits.
Ensuite, incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur hypoxique 5 %C-O deux, 5 %O deux. Un jour après l’agrégation, inspectez les agrégats au microscope. Par rapport à l’agrégation immédiatement après la centrifugeuse, ils doivent apparaître intacts avec des bords lisses.
Retirez le surnageant en tenant la plaque du micropuits horizontalement et en plaçant la pointe d’une micropipette P-1000 à la surface du milieu de culture et contre le bord du puits. Ensuite, retirez lentement le milieu en faisant attention de ne pas déranger les agrégats au fond des micropuits. Après avoir réduit le niveau du fluide à environ un à deux millimètres de la surface texturée du micropuits, inclinez lentement la plaque et aspirez lentement le milieu restant du puits.
Ajoutez un millilitre de milieu à induction de la première étape préchauffé fraîchement préparé en tenant la pointe de la pipette contre le bord intérieur du puits et en distribuant très lentement le milieu contre la paroi intérieure du puits. Remettez la plaque dans l’incubateur dans des conditions hypoxiques pendant trois jours. Le quatrième jour, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, prélever les agrégats de chaque puits de la plaque de micropuits.
Recueillir jusqu’à 10 puits de suspension d’agrégats dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les agrégats reposer pendant 15 minutes dans un incubateur hypoxique. Une fois que les agrégats se sont déposés, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les agrégats en suspension dans dix millilitres de milieu de lavage préchauffé, pour éliminer les cytokines inductives résiduelles.
Centrifugez les agrégats à 50 fois g pendant deux minutes. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension les agrégats granulés dans un milieu d’induction préchauffé de la deuxième étape. Transférez la suspension d’agrégats sur une plaque de fixation à ultra-faible teneur de 24 puits à raison d’un millilitre par puits.
Observez les agrégats au microscope sous forme d’amas uniformes à cellules serrées. Incuber dans des conditions hypoxiques jusqu’au sixième jour. Le sixième jour, accumulez jusqu’à 10 millilitres d’agrégats par tube conique de 15 millilitres comme précédemment.
Une fois que les agrégats se sont déposés, aspirez le surnageant et suspendez à nouveau les agrégats dans le milieu d’induction préchauffé de la troisième étape. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, redistribuez les agrégats dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits, à raison d’un millilitre par puits. Effectuez un changement complet de milieu au 10e jour de la culture.
Le 12e jour, transférez les cellules dans des conditions de culture normoxiques de 20 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pour le reste de la période de culture. Après 12 jours de différenciation, ce qui correspond à six jours au stade d’induction cardiaque, trois, des contractions moyennes et énergiques à l’échelle de l’agrégat ont été observées. Au 17e jour, 74,8 % des cellules sont positives pour la troponine T cardiaque, par cytométrie en flux, comme l’indique la partie remplie de l’histogramme.
Sont également montrées les cellules colorées avec l’anticorps secondaire seul, comme le montre la section non remplie de l’histogramme. Lors de cette procédure, il est important de bien laver les agrégats le quatrième jour, afin d’éliminer les traces de cytokines, en particulier l’activine-A, qui favorise la différenciation de l’endoderme, au détriment de l’induction cardiaque. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la culture froide de types de cellules inductives dans l’agrégat, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions, telles que la façon dont la signalisation paracrine des tissus embryonnaires voisins influence la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines dans la lignée cardiaque.
Aperçu
Cet article présente une méthode robuste de différenciation cardiaque de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) utilisant des micropuits pour générer des agrégats contrôlés en taille. La méthode résout les problèmes d'hétérogénéité des cultures associés aux techniques conventionnelles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Différenciation cardiaque
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) peuvent se différencier en divers types cellulaires, notamment en cellules cardiaques.
- Les méthodes conventionnelles produisent souvent des agrégats de tailles et de formes variables, ce qui affecte les résultats de la différenciation.
- La technologie des micropuits offre une solution pour générer des agrégats uniformes.
- Des conditions favorisant la différenciation cardiaque sont essentielles pour une différenciation efficace.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de générer des agrégats de CSPH contrôlés en taille.
- Améliorer la reproductibilité des résultats de différenciation cardiaque.
- Faciliter les recherches futures en ingénierie des tissus cardiaques.
Méthodes utilisées
- Centrifugation de la suspension de CSP humaines pour former des agrégats.
- Utilisation de plaques à micropuits pour contrôler la taille des agrégats.
- Incubation en conditions hypoxiques pour favoriser la différenciation cardiaque.
- Changements séquentiels du milieu pour induire les stades de différenciation.
Résultats principaux
- Des agrégats uniformes se sont formés et ont été maintenus tout au long du processus de différenciation.
- Une expression significative de la troponine T cardiaque a été observée dans les cellules différenciées.
- Une amélioration de l'élimination des cytokines inductrices a renforcé l'engagement vers la lignée cardiaque.
- Des contractions à l'échelle de l'agrégat ont été observées après 12 jours de différenciation.
Conclusions
- La méthode des micropuits offre une approche fiable pour la différenciation cardiaque des hPSC.
- Des agrégats de taille contrôlée conduisent à des résultats de différenciation plus reproductibles.
- Cette technique peut être utilisée pour approfondir l'étude du développement cardiaque et la modélisation des maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le contrôle de la taille des agrégats lors de la différenciation cardiaque en suspension résout un goulot d'étranglement majeur dans la production de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines : l'hétérogénéité des cultures entraînant des rendements variables. En imposant une formation uniforme des agrégats grâce à la technologie des micropuits, cette méthode améliore la fiabilité prédictive des résultats de différenciation, favorisant ainsi la génération de modèles précliniques reproductibles et évolutifs. Cette approche se positionne alors comme un outil stratégique pour réduire les risques liés à l'engagement dans la lignée cardiaque au cours des phases précoces de la découverte et des applications translationnelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies de signalisation dépendantes de la taille lors de l'induction cardiaque, clarifiant ainsi les facteurs mécanistiques de la spécification des lignées.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité de la formation des agrégats, améliorant la reproductibilité entre les expériences et les équipes.
- Valeur prédictive : Facilite la modélisation de la relation dose-réponse à l'exposition aux morphogènes en standardisant la géométrie des agrégats comme variable contrôlée.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi pour tests : Produit des microtissus uniformes adaptés à l’imagerie à haut contenu et à la quantification des cardiomyocytes par cytométrie en flux.
- Extensibilité : Le format de plaque à micropuits permet le traitement parallèle de plusieurs conditions ou fonds génétiques pour des criblages comparatifs.
- Données quantitatives : Permet une mesure reproductible des cellules positives pour la troponine T cardiaque, utilisée comme paramètre fonctionnel dans les études d’effets de composés ou de perturbations génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Système pertinent pour les maladies : Génère des agrégats cardiaques homogènes et évolutifs pour modéliser les cardiomyopathies héréditaires ou la cardiotoxicité induite par les médicaments.
- Continuité translationnelle : Assure un lien entre la différenciation en phase de découverte et la validation préclinique en fournissant un matériel cellulaire cohérent d’un lot à l’autre.
- Réduction des risques mécanistiques : Réduit les variables perturbatrices dues à l'hétérogénéité de la taille des agrégats, renforçant ainsi la fiabilité des associations entre phénotype et génotype.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en permettant une différenciation normalisée des CESP, qui alimente des applications en aval telles que la modélisation des maladies, la pharmacologie de sécurité et l'évaluation des candidats en médecine régénérative.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant les signaux biophysiques impliqués dans l'engagement vers la lignée cardiaque grâce à un contrôle précis de la taille et de la forme des agrégats.
- Criblage : Fournit des réseaux reproductibles de microtissus pour le criblage de bibliothèques de composés, avec une réduction du bruit lié à la variabilité de l'agrégation.
- Analyse : Facilite des lectures quantitatives par cytométrie en flux et imagerie (par exemple, la troponine T cardiaque) grâce à un meilleur rapport signal/bruit dû à l'homogénéité de la population.
- Recherche translationnelle : Offre une source échelonnée de cardiomyocytes pour des tests fonctionnels précliniques, incluant la contractilité et l'électrophysiologie.
- Réutilisation en entreprise : Les plaques de micropuits peuvent être réutilisées dans différents projets et lignées cellulaires, favorisant une standardisation au niveau plateforme des protocoles de différenciation des cellules souches.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive des résultats de différenciation en réduisant le bruit biologique dû à la variation de la taille des agrégats.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et le débit grâce à une formation d'agrégats standardisée et évolutible.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions d'orientation (aller ou ne pas aller plus loin) dans les programmes précoces de cardiologie en réduisant les faux négatifs liés à une différenciation inefficace.
- Impact sur le portefeuille : Permet une allocation des ressources ajustée au risque, fondée sur des indicateurs fiables de rendement en cardiomyocytes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), en manipulation d'agrégats et en systèmes d'incubation hypoxiques.
- Dépend de l'accès à des plaques de micropuits aux dimensions définies et aux surfaces anti-adhésives.
- Implique des protocoles normalisés d'échange de milieu afin d'éviter la perturbation des agrégats lors des étapes de lavage.
- Requiert une validation sur plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes humaines afin de garantir la constance des relations entre taille et efficacité de différenciation.
- Limité par la nécessité d'équipements spécialisés (incubateurs hypoxiques, plaques anti-adhésives) et d'étapes optimisées de lavage des cytokines afin de prévenir une différenciation non ciblée.
