Imagerie de calcium dans Drosophila Activation à Egg

L’objectif global de cette procédure est de visualiser le calcium lors de l’activation de l’œuf chez Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la source, la dynamique et les rôles en aval du calcium lors de l’activation de l’œuf. Les principaux avantages de cette technique sont de permettre une résolution spatiale plus élevée, la manipulation physique de l’ovule mature avant l’activation et le test du rôle de l’activation de l’ovule sans fécondation.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à isoler les ovules matures sans les endommager et à appliquer un tampon d’activation à l’ovule mature sans perdre l’échantillon. Pour commencer cette procédure, réglez le grossissement du microscope de dissection sur 4X. Sur la première lamelle, séparez les deux ovaires en déchirant l’oviducte à l’aide d’une pince fermée et d’une sonde de dissection, en prenant soin de ne pas percer les chambres de l’ovule.

Ensuite, insérez une sonde de dissection standard au centre de l’ovaire, à côté de la pince fermée. Faites glisser doucement la sonde de dissection à travers l’ovaire, vers le pôle postérieur, où se trouvent les ovules matures. Une fois que les ovules matures sont visibles sur la lamelle à l’extérieur de l’ovaire, manœuvrez trois à cinq d’entre eux en ligne au centre.

Ensuite, retirez le reste du tissu ovarien en le faisant glisser loin des ovules alignés. Ensuite, retirez l’excès d’huile en le tamponnant avec le coin d’une lingette médicale. Tracez un réticule sur la lamelle avec un marqueur pour localiser l’échantillon au microscope.

Après cela, laissez reposer les chambres d’œufs préparées sur la lamelle pendant cinq à 10 minutes pour permettre aux œufs de se déposer dans l’huile. Apportez à l’installation d’imagerie les lamelles préparées, le tampon d’activation à température ambiante et les pipettes en verre. Sélectionnez un objectif adapté à l’imagerie de l’ovule mature entier.

Ensuite, montez la première lamelle préparée sur la platine du microscope. Ensuite, sélectionnez un champ de vision d’une chambre d’œufs matures pour l’activation. Réglez les paramètres d’imagerie pour l’excitation et l’émission GFP standard.

Après cela, mettez en place une vue en champ clair afin de visualiser et d’orienter l’œuf mature et l’huile déplacée. Maintenant, sélectionnez le plan Z le plus bas où les ovules matures sont visibles. Et réglez une pile Z complète à prendre pour 40 micromètres à deux micromètres par pas.

Ensuite, réglez la série chronologique pour capturer les images pendant 30 minutes. Dans cette procédure, démarrez la capture d’image et acquérez une à deux piles Z complètes pour montrer l’ovule mature avant l’activation. Ensuite, prélevez environ 300 microlitres de tampon d’activation dans une pipette en verre.

Positionnez l’extrémité de la pipette en verre contenant le tampon d’activation à un angle de 45 degrés au-dessus de la lamelle et déplacez lentement la pipette dans la trajectoire du faisceau, jusqu’à ce qu’elle se trouve directement au-dessus de l’œuf mature imagé. Ajoutez une à deux gouttes de tampon d’activation en moins de cinq secondes, pour déplacer l’huile. L’ajout d’une à deux gouttes de tampon d’activation doit se faire à l’angle correct, doucement et rapidement.

Lors de l’ajout d’un tampon d’activation lors de l’acquisition de l’image, vérifiez le canal en fond clair pour vous assurer que l’huile a été déplacée. Une fois que le pétrole est déplacé avec succès, laissez la série chronologique s’exécuter jusqu’à ce qu’elle soit terminée. Pour créer une projection des données acquises, sélectionnez une tranche Z de début et une tranche Z d’arrêt pour l’ensemble de la section.

Ensuite, sélectionnez un type de projection, par exemple, l’intensité maximale. Ensuite, cochez la case Toutes les plages horaires pour appliquer les paramètres sélectionnés à l’ensemble de la série. Pour régler la luminosité et le contraste de l’image, sélectionnez Image, puis Ajuster, puis Luminosité/Contraste.

Pour exporter la série chronologique sous forme de film, sélectionnez Fichier, puis Enregistrer sous, puis AVI. Ensuite, sélectionnez la fréquence d’images. Voici la série chronologique d’un œuf de drosophile mature ex vivo exprimant un indicateur de calcium génétiquement codé suite à l’ajout d’un tampon d’activation.

L’augmentation du calcium cytoplasmique prend naissance au pôle postérieur, puis se propage à une vitesse moyenne d’environ 1,5 micromètre par seconde. L’initiation de l’onde est généralement observée dans les trois minutes suivant l’ajout du tampon d’activation. Après l’activation, les niveaux de calcium intracellulaire de l’ovule mature se rétablissent.

Chez la drosophile, la co-visualisation de l’onde calcique et du cytosquelette d’actine peut être réalisée à l’aide de ce test d’activation ex vivo. L’actine semble changer avec le temps, comme l’indiquent les pointes de flèches blanches. L’absence de détection du signal calcique au centre de l’ovule mature est due au mouvement de l’échantillon lors de la capture d’image.

Une fois maîtrisée, toute cette technique peut être réalisée en moins d’une heure, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de prendre votre temps lors de la manœuvre des chambres à œufs et lors de la configuration des paramètres d’acquisition. Cette procédure peut être adaptée à la visualisation d’autres protéines, organites ou indicateurs de calcium marqués par fluorescence lors de l’activation de l’œuf.

Cela peut aider à répondre aux questions concernant la source du calcium et les effets en aval.