Name: Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez un système de culture 3D pour étudier l'invasivité des cellules cancéreuses et la formation de tumeurs satellites en sandwichant du collagène dans du fibrine. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des traitements anticancéreux.

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Travail financé en partie par Cancer de la Prostate Canada (subvention # D2014-4 à SG et MCJ) et les Instituts de recherche en santé du Canada (subvention # MOP-111069 à SG). Nous tenons à remercier le Dr Richard Poulin pour son assistance éditoriale et Mme Chanel Dupont pour l’assistance technique.

NOTE: Aucune éthique considération car les cellules animales et les cancers humains ont été achetés ou aimablement fournis pour nous. 1. Faire de collagène Plugs (pseudo-tumeur primaire) <ol><li> Préparer une dispersion de collagène. Collagène de type I de tendons de queue de rat (RTT) peuvent être soit extraits et stérilisés comme indiqué précédemment 17, ou achetés. Disperser lyophilisé RTT collagène (3,25 à 3,50 mg / ml dans 0,02 N d&#39;acide acétique) en utilisant un mélangeur (réglage haute vitesse; cinq 2 min pistes) pour un mélange uniforme. </li><li> Harvest (trypsine-EDTA, généralement) et utiliser l&#39;exclusion du bleu trypan pour compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre. Ajuster la densité cellulaire désirée (5 x 10 4 cellules par alvéole). </li><li> Préparer toutes les solutions (NaOH, sérum fœtal bovin, DMEM 5x, NaHCO 3) séparément (Tableau 1) dans des conditions stériles et de garder sur la glace réfrigérée. Remarque: L&#39;ordre d&#39;addition des différentes solutions est important pour éviter les chocs osmotiques ou acides dans les cellules. </li><li> Effectuer une dispersion cellulaire (1,25 x 10 6 cellules) dans la solution finale en collagène (5 ml) aussi rapidement que possible. Mélangez bien (par pipetage de haut en bas), tout en évitant les bulles d&#39;air, puis de distribuer rapidement 200 ul de la solution prête à l&#39;emploi dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. frapper doucement la plaque multi-puits sur la surface de la zone de travail de la hotte de culture cellulaire pour éliminer les bulles d&#39;air et de répandre la solution uniformément à l&#39;intérieur des puits. </li><li> Après avoir rempli tous les puits (cette étape prend environ 15-20 minutes par plaque de 96 puits), le stocker dans l&#39;incubateur. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C de 2 heures pour la nuit. Collagène gélification (ie, fibrillogenèse) se produit dans les 30 minutes. Ajouter au milieu de culture (100 ul / puits) à la culture pour effectuer une incubation d&#39;une nuit. </li></ol> 2. Première couche de fibrine Gel <ol><li> Préparation de la solution de fibrinogène. NOTE: Le même lot de gel de fibrine devrait idéalement être utilisé pour resul plus reproductiblets, la formation d&#39;un gel de fibrine comme peut varier entre les différents lots de fibrinogène lyophilisé commercial. <ol><li> Toujours utiliser une solution de fibrinogène fraîchement préparé. Amener le fibrinogène lyophilisé à température ambiante avant d&#39;ouvrir le flacon afin d&#39;éviter la formation de cristaux d&#39;hydrates. </li><li> Progressivement dissoudre le fibrinogène dans préchauffé (37 ° C) une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec Ca 2+ / Mg 2+ à une concentration de travail de 3 mg / ml (envisager de préparer un excès de 15% du volume final minimum requis : par exemple, 17,25 mg dans 5,75 ml d&#39;une solution 5 ml). <ol><li> Ajouter goutte à goutte HBSS préchauffé dans un premier temps pour solubiliser fragments de fibrinogène. Décomposer des fragments plus grands avec une spatule dans le bécher. Agiter le bêcher de temps à autre pour faciliter le mélange. Ne pas utiliser une plaque d&#39;agitateur pendant la procédure. Dissoudre la poudre restante de la suspension par pipetage vers le haut et vers le bas. </li></ol></li><li> Gardez la solution de fibrinogène tiède tandis steriLIZING la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 um. Remarque: Si le HBSS est pas assez chaud ou le fibrinogène pas entièrement dissous, la solution peut obstruer le filtre. Le cas échéant, remplacer le filtre une ou deux fois, ce qui peut diminuer la concentration de fibrinogène, et la rigidité ainsi caillot de fibrine. </li><li> Suspendre les cellules d&#39;intérêt (par exemple, les cellules endothéliales) en solution prête à l&#39; utilisation du fibrinogène tout en ajustant son volume final, comme une procédure alternative. </li></ol></li><li> Préparation des Solutions thrombine. <ol><li> Préparer une solution mère dans ddH 2 O (50 NIH unités / ml), puis le stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um. </li><li> Utiliser un rapport / de la thrombine du fibrinogène ≥1: 0,0075 (v / v) afin de générer le gel de fibrine. </li></ol></li><li> Génération du gel de fibrine. <ol><li> Gardez le fibrinogène et la thrombine stérile des solutions mères sur la glace au cours de toutes les étapes suivantes. Les gels de fibrine peuvent se former dans des plaques à 24 puits. </li><li> e Promptement overlaye surface de chaque puits avec la solution de fibrinogène (200 pl / puits), tout en évitant la formation de bulles d&#39;air. Processus 6 puits à la fois. </li><li> Une fois la solution de fibrinogène recouvre complètement la surface des puits, incliner la plaque à un angle de 45 ° et ajouter 1,5 pi de solution de thrombine dans le premier puits en laissant tomber la thrombine dans le centre du puits, puis agiter doucement la plaque horizontalement pour 1-2 sec. <ol><li> Laisser la plaque dans une position stable sous la hotte à flux laminaire (5-10 min) jusqu&#39;à ce que le processus de gélification / coagulation est terminée (NB: le procédé de polymérisation ne doit pas être perturbée, par exemple, en transportant la plaque dans l&#39;incubateur). </li></ol></li><li> Une fois les six premiers puits ont polymérisé, répéter la même séquence (ie les 3 étapes précédentes) pour les six puits à venir jusqu&#39;à ce que tous les puits ont été traités. </li></ol></li></ol> 3. Deuxième couche de fibrine Gel et intercalée Collagène plug <ol><li> OptionA: (Utilisation du plug Collagène immédiatement). <ol><li> Assurez-vous que la première couche de gel de fibrine a polymérisé dans tous les puits en inclinant délicatement la plaque. Placer la plaque à 96 puits contenant du côté des fiches de gel de collagène par côté avec la plaque de 24 puits (contenant les gels de fibrine) pour faciliter le transfert des bouchons de collagène. </li><li> Ajouter une goutte de HBSS dans chaque puits de la plaque contenant les bouchons de collagène. </li><li> Retirez chaque bouchon de collagène du puits avec une aiguille fine montée sur une seringue (utilisé comme une poignée) ou en utilisant un micro-cuillère (voir la vidéo). Transférer chaque bouchon de collagène sur la première couche de gel de fibrine en utilisant un ou deux micro-cuillères, tout en veillant à ce que le bouchon de collagène est bien centré dans le puits et que la stérilité est bien entretenu. </li><li> Recouvrir le gel de fibrine formé au préalable avec la seconde couche de solution de fibrinogène (300 ul / puits) et introduire la thrombine comme décrit au point 2.3, en gardant un minimum. 1: rapport de 0,0075 et une séquence de six puits à une époque &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Option B (revêtement Plug collagène avec une couche mince de facteur de croissance réduit la membrane basale (GFRBM)). <ol><li> Toutes les solutions et les instruments préparés Refroidir au préalable et de les garder à 4 ° C ou sur de la glace (par exemple, des pipettes, des conseils, des tubes à essai) lors de la manipulation depuis aliquotes congelées de GFRBM sont très sensibles aux taux d&#39;échauffement excessif lors de la décongélation (suivre les instructions du fabricant) . </li><li> Après le retrait des puits de la plaque, faire tremper chaque bouchon de collagène pendant 2 min dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml sur de la glace contenant 100 pi d&#39;une solution de GRFBM pur. </li><li> Transférer chaque bouchon enduit sur la première couche de fibrine, tout en assurant qu&#39;il est bien centré, comme décrit précédemment. Incuber les plaques contenant enfichables à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre à la GRFBM pour former un gel. Ajouter la deuxième couche de fibrine comme dans l&#39;étape 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. Conditions de culture cellulaire moyen <ol><li> Remplir chaque puits avec du milieu de culture (400 ul). Les milieux de culture et les suppléments seront choisis en fonction de la lignée cellulaire et les conditions expérimentales. </li><li> Ajouter l&#39;aprotinine, un antifibrinolytique, un milieu de culture à une concentration finale de 100 unités inhibitrices de la kallikréine (KIU) / ml. NOTE: Conserver les plaques dans un incubateur de culture cellulaire dans les conditions utilisées pour la lignée cellulaire testée. </li><li> Reconstituer cultures avec un milieu frais tous les jours ou selon le programme expérimental, et ajoutez aprotinine. Avant d&#39;ajouter du milieu frais, inclinez légèrement la plaque (à un angle de 30-35 °) et incliner la pipette contre le côté du puits tout en aspirant soigneusement le milieu conditionné sous observation constante. </li></ol>

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Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Comme une note technique important, il est essentiel qu&#39;aucun écart est présent à l&#39;interface entre la centrale et les gels périphériques. Dans le cas contraire, il pourrait réduire la capacité des cellules à migrer / envahissent le gel de fibrine. Un espace entre le collagène et les gels de fibrine peuvent se former pendant les 24 premières heures de la culture si la thrombine n&#39;a pas été dilué de manière appropriée. Il est également possible que la lignée cellulaire testée pourrait entraîner le gel de coll...

L&#39; étude des caractéristiques fondamentales et biomédicales de l&#39; invasion des cellules cancéreuses / migration et l&#39; établissement de métastases ultérieures est l&#39;objet d&#39;un 1,2 de recherche intense. Métastase est le stade ultime du cancer et de sa prise en charge clinique reste insaisissable. Une meilleure compréhension des métastases aux niveaux cellulaires et moléculaires permettra le développement de thérapies plus efficaces 3. Plusieurs propriétés des cellules métastatiques peuvent être explorées 4 in vitro , y compris leur stemness et le potentiel d&#39;acquérir un état ​​de transition (par exemple, la transition épithélio-mésenchymateuse) à migrer et à envahir et à l&#39;intérieur de la tumeur primaire 5. Toutefois, l&#39;évaluation in vitro de processus / de métastases d&#39;invasion a été un défi , car il exclut pratiquement la contribution du sang / circulation lymphatique. cultures organotypiques qui intègrent des fragments de tumeur dans des gels de collagène ont Previously été utilisé pour surveiller l&#39;agressivité du cancer. Bien que la complexité des tumeurs est conservée (par exemple, la présence de cellules non cancéreuses), des fragments de tumeur sont exposées à une diffusion moyenne limitée à une variation d&#39;échantillonnage et à une prolifération de cellules stromales 6. Une méthode alternative consiste dans les cellules cancéreuses en croissance au sein des composants de la matrice extracellulaire (ECM), qui imite la (3D) de l&#39;environnement de la cellule à trois dimensions. La prolifération des lignées de cellules de cancer du sein dans un gel de collagène et / ou une matrice de membrane basale dérivé est parmi les exemples les mieux caractérisés de la culture de cellules 3D. En utilisant des milieux de culture cellulaire 3D spécifiques, l&#39;ensemble désorganisé observée pour les cellules cancéreuses du sein cultivées dans des conditions standard peut être inversé pour la formation spontanée d&#39;acini mammaires et des structures tubulaires 7-10. En outre, la formation de sphéroïdes de tumeur multicellulaires dérivées de cellules cancéreuses d&#39;adénocarcinome rassemblés en utilisant différentes techniques (par exemple, la pendaison gouttes, sphéroïdes flottante, agar embedment) constitue désormais la cellule 3D culture test le plus couramment utilisé 11-13. Cependant, cet essai est limité par l&#39;ensemble limité de lignées cellulaires cancéreuses qui peuvent former des sphéroïdes et par la courte période disponible pour étudier les cellules dans ces conditions. Dans cette technique visualisée, nous ici introduire un dosage de culture cellulaire 3D sophistiqué où les cellules cancéreuses d&#39;intérêt sont incorporés dans un gel de collagène pour permettre la formation in vitro d&#39;une tumeur pseudo-primaire qui peut être alternativement revêtue d&#39;une membrane - matrice dérivée de sous - sol. Une fois formée, la tumeur pseudo-primaire est alors prise en sandwich dans une matrice acellulaire (gel de fibrine dans le cas présent), ce qui permet aux cellules cancéreuses de traverser l&#39;interface entre les deux compartiments de la matrice (voir figure 1). Fait intéressant, des structures ressemblant à des tumeurs secondaires issues de la tumeur pseudo-primaire ainsi que des cellules cancéreuses agressives apparaissent dans leun gel de fibrine. Un tel système de culture 3D offre la flexibilité nécessaire pour enquêter sur , par exemple, les médicaments anticancéreux, expression génique et cellule-cellule et / ou les interactions cellule-ECM 14-16. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Figure 1:.. Vue d&#39; ensemble de la méthode résumé schématique de la méthode pour générer le système de culture cellulaire 3D comme un modèle pour les études sur le cancer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Collagène lyophilisé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>à partir du tendon de queue de rat (dispersion soluble) ou fait maison (voir Rajan et al., ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrinogène (lyophilisé)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>F8630</td><td>Type I-S, 65 à 85 % de protéines avec &ge ; 75 % de protéines sont coagulables</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td> Gibbstown, NJ ; Unités NIH/mg de poids sec&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Précédemment de BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp ;</td><td>&nbsp ; solution à 5 - 10T UI/ml (unité inhibitrice de la trypsine)&nbsp ;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Micro-cuillères</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>96 puits, fond rond</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagle’s Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, origine canadienne.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée&nbsp ;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

three-dimensional culture assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et tumor satellite formation

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

culture de cellules animales dans des monocouches est largement utilisé pour étudier divers processus physiologiques et moléculaires. Cependant, cette approche pour étudier les cellules en croissance génère souvent des artefacts indésirables. Par conséquent, la culture de cellules dans un (3D) de l&#39; environnement en trois dimensions, souvent en utilisant des composants de la matrice extracellulaire, est apparue comme une alternative intéressante en raison de sa similitude avec le natif dans un tissu ou un organe in vivo. Nous avons développé un système de culture cellulaire 3D à l&#39; aide de deux compartiments, à savoir : (i) un compartiment central contenant des cellules cancéreuses noyées dans une faisant office de gel de collagène comme une tumeur macrospherical pseudo-primaire et (ii) un compartiment acellulaire périphérique constituée d&#39;un gel de fibrine, soit un composant de la matrice extracellulaire différent de celui utilisé dans le centre, dans lequel les cellules cancéreuses peuvent migrer (invasion avant) et / ou de former des tumeurs microsphériques qui représentent les tumeurs secondaires ou satellites. La formation de tumeurs par satellite dans le compartiment périphérique estremarquablement en corrélation avec l&#39;agressivité connue ou d&#39;origine métastatique des cellules tumorales d&#39;origine, ce qui rend ce système de culture 3D unique. Cette méthode de culture des cellules peut être considérée pour évaluer le cancer invasif et de la motilité des cellules, les interactions cellule-matrice extracellulaire et une méthode pour évaluer les propriétés des médicaments anti-cancéreux.

Comme mentionné précédemment, une caractéristique intéressante de ce test de culture de cellules 3D est que les cellules cancéreuses ne peuvent pas migrer uniquement du bouchon de collagène dans le gel de fibrine adjacente, mais aussi d&#39; établir des tumeurs secondaires (structures , par exemple, le satellite tumeurs similaires). Ceci peut être observé directement avec un microscope à contraste de phase inversée à des grossissements faibles et élevées à travers l&#39;épaisseu...

Les cellules cancéreuses sont intégrées dans un gel de collagène, puis prises en sandwich dans un gel de fibrine acellulaire pour générer un système de culture 3D dans lequel le caractère invasif et la formation de tumeurs satellites peuvent être surveillés.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Le but général de cette procédure est d'encapsuler des cellules cancéreuses intégrées dans du collagène au sein d'un gel de fibrine afin de générer un système de culture 3D permettant de surveiller l'invasivité tumorale satellite et sa formation. Notre système d'imagerie 3D peut offrir de nouvelles perspectives pour l'étude de diverses cellules et de nombreux variants clés lors de l'apoptose ou de la migration des cellules cancéreuses, ou encore pour évaluer l'efficacité des traitements contre la perte de cellules cancéreuses. Une caractéristique intéressante de ce modèle de culture cellulaire 3D réside dans la possibilité de modifier la concentration de la matrice extracellulaire ou d'utiliser une autre matrice extracellulaire pour l'assemblage du système 3D.La procédure sera démontrée par Marie-France Côté, assistante de recherche dans mon laboratoire, et Audrey Turcotte, étudiante diplômée sous ma supervision. Commencez par mélanger du collagène de type I de tendon de queue de rat lyophilisé pendant cinq cycles de deux minutes à vitesse élevée afin de disperser uniformément le collagène.Pendant l'incorporation du collagène, récoltez les cellules tumorales d'intérêt à l'aide de la solution enzymatique de détachement appropriée. Procédez ensuite à l'exclusion au bleu de trypan lors du dénombrement. Diluez les cellules dissociées à une concentration de 50 000 cellules par bouchon dans du DMEM.Lorsque le collagène est prêt, ajoutez rapidement 1 250 000 cellules à la solution de collagène à l’aide d’une pipette afin de disperser les cellules de manière homogène. Dispensez immédiatement 200 microlitres de la suspension monocellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Tapez doucement la plaque sur la surface de travail après chaque ajout pour éliminer les bulles d’air éventuelles et répartir uniformément la solution dans les puits.Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures, en ajoutant 100 microlitres de milieu de culture dans chaque puits après les deux premières heures si les cellules doivent être cultivées toute la nuit. Pour préparer la première couche de gel de fibrine, porter le fibrinogène lyophilisé à température ambiante avant d'ouvrir le flacon afin d'éviter la formation de cristaux d'hydrate. Ensuite, transférer le fibrinogène dans un bécher en verre et ajouter goutte à goutte du HBSS à 37 degrés Celsius sur la poudre pour solubiliser les fragments de fibrinogène.Ensuite, utilisez une spatule pour décomposer les morceaux de protéines plus gros, en agitant de temps à autre le bécher selon les besoins afin de faciliter le mélange. Passez la suspension plusieurs fois en pipette pour dissoudre la protéine restante, puis filtrez stérilement la solution à travers un filtre de 22 microns. Recouvrez ensuite immédiatement la surface de chaque puits d'une plaque de 24 puits avec 200 microlitres de fibrinogène, en prenant soin d'éviter les bulles d'air.Une fois que tous les puits ont été entièrement revêtus, inclinez la plaque à un angle de 45 degrés, puis déposez 1,5 microlitre de solution de thrombine au centre d'un puits et faites tourner doucement la plaque horizontalement pendant une à deux secondes. Après avoir traité cinq autres puits avec la thrombine de la même manière, placez la plaque dans une position horizontale stable sous une hotte à flux laminaire pendant cinq à dix minutes, jusqu'à ce que les solutions forment un gel. Pour le placement immédiat du bouchon de collagène, inclinez soigneusement la plaque afin de vérifier que les gels de fibrine sont complètement polymérisés.Ensuite, placez la plaque de 96 puits contenant les bouchons de gel de collagène à côté de la plaque de 24 puits contenant les gels de fibrine, et ajoutez une goutte de HBSS dans chaque puits de bouchon de collagène. Puis, à l’aide d’une micro-spatule, transférez un seul bouchon de collagène au centre de chacune des premières couches de gel de fibrine dans la plaque de 24 puits. Une fois tous les bouchons transférés, ajoutez 300 microlitres de solution de fibrinogène dans chaque puits, puis ajoutez 2,25 microlitres de thrombine comme vient de l’être démontré.Pour recouvrir les bouchons de collagène d'une fine couche de membrane basale appauvrie en facteurs de croissance avant leur placement, transférez chaque bouchon dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre placé sur de la glace contenant 100 microlitres de membrane basale pure appauvrie en facteurs de croissance. Après deux minutes d'imbibition, transférez un seul bouchon de collagène recouvert au centre de chaque couche de fibrine et incubez les bouchons à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de solidifier la membrane basale appauvrie en facteurs de croissance. Ajoutez ensuite la seconde couche de fibrine comme vient de l'être démontré.Lorsque les gels sont complètement polymérisés, remplir chaque puits avec 400 microlitres du milieu de culture approprié et des suppléments. Ensuite, ajouter un agent antifibrinolytique dans les puits. Puis incuber les cultures 3D dans les conditions appropriées pour la lignée cellulaire tumorale testée.Les jours appropriés pour l'alimentation des cellules, incliner la plaque à un angle de 30 à 35 degrés et appuyer une pipette contre la paroi de chaque puits pour aspirer le milieu sans perturber les gels. Ensuite, ajouter 400 microlitres de milieu de culture cellulaire frais et d'agent antifibrinolytique à chaque culture de gel. Cet essai de culture cellulaire en 3D permet une visualisation directe de la migration des cellules cancéreuses depuis le bouchon de collagène vers le gel de fibrine adjacent, afin de former des tumeurs secondaires, ce qui permet de comparer le comportement de cellules métastatiques connues à celui de cellules non métastatiques ou faiblement métastatiques.Par exemple, dans cette expérience, de nombreuses tumeurs satellites se sont réparties aléatoirement dans le gel de fibrine contenant la lignée cellulaire métastatique B16 F10, tandis qu'aucune tumeur satellite n'a été observée pour la lignée cellulaire B16 F0 faiblement métastatique. En revanche, ces cellules de carcinome du gland mammaire murin, peu métastatiques mais très invasives localement, forment un front de migration qui s'étend radialement dans le gel de fibrine. Après 14 jours de culture, les cellules de carcinome du gland mammaire se détachent du front migrant pour former des structures en forme d'étoile, très semblables aux structures du gland mammaire.Les agents chimiothérapeutiques peuvent être testés sur les cellules cancéreuses incluses, comme dans cette expérience représentative où une fragmentation croissante de l'ADN a été observée simultanément avec une augmentation des cas d'apoptose des cellules cancéreuses induite par l'agent chimiothérapeutique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures ou répartie sur deux jours, selon la durée initiale d'incubation du bouchon de collagène.Pendant que j'effectue cette procédure, il est important d'empêcher la formation de fissures à l'interface entre les gels central et périphérique, car elles peuvent réduire la capacité des cellules cancéreuses à envahir le gel de fibrine. À la suite de cette procédure, des analyses métallographiques ou protéomiques peuvent être réalisées sur les colonies satellites, les bouchons de collagène ou les cellules cancéreuses afin d'identifier l'expression différentielle des gènes et protéines d'intérêt. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biologie du cancer pour explorer la migration, l'apoptose, l'expression de gènes suppresseurs de métastases, ainsi que la fin de l'angiogenèse dans une variété de lignées cellulaires cancéreuses.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment incorporer des cellules cancéreuses dans un gel de collagène et les insérer entre deux couches d'un gel de fibrine afin de surveiller leur invasivité et la formation de tumeurs satellites.

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JoVE Journal

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Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Cette vidéo présente une méthodologie détaillée pour cultiver des cellules cancéreuses du sein dans une matrice protéique de membrane basale 3D, illustrant le potentiel de la culture 3D dans l’évaluation de l’invasion cellulaire dans l’environnement environnant.

Test de la membrane basale de culture 3D : culture de cellules cancéreuses sur une matrice protéique de membrane basale 3D pour étudier l’invasion cellulaire

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir une co-culture tridimensionnelle de sphéroïdes tumoraux et de lymphocytes T. Un moulage à l’agarose avec des micropuits contenant des sphéroïdes tumoraux est préparé, suivi de l’ajout de lymphocytes T. Après l’incubation, cette configuration permet d’étudier l’interaction des lymphocytes T avec les sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel contrôlé.

Un modèle de co-culture tridimensionnelle de lymphocytes T infiltrants dans des sphéroïdes tumoraux

Cet article présente une méthode pour étiqueter fluorescence collagène qui peut encore être utilisé à la fois fixe et imagerie en temps réel des cultures cellulaires en 3D. Nous fournissons également un protocole optimisé pour visualiser les protéines du cytosquelette endogènes des cellules cultivées dans des environnements 3D.

Révéler l&#39;organisation du cytosquelette des cellules invasives du cancer en 3D

Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l'architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d'autres tissus.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Cet article fournit des méthodologies détaillées pour l'utilisation de trois dimensions (3D) des essais pour quantifier l'invasion des cellules du cancer du sein. Plus précisément, nous discutons les procédures nécessaires pour mettre en place de tels essais, la quantification et l'analyse des données, ainsi que des méthodes pour examiner la perte de l'intégrité de la membrane qui se produit lorsque les cellules envahissent.

Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

Ici, nous présentons un protocole de co-culture en trois dimensions, qui est utile pour étudier les interactions multicellulaires et la modulation dépendante de la matrice extracellulaire du comportement des cellules cancéreuses. Dans ce modèle expérimental, les cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des fibroblastes humains associés au cancer.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Découvrez un système de culture 3D pour étudier l'invasivité des cellules cancéreuses et la formation de tumeurs satellites en sandwichant du collagène dans du fibrine. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des traitements anticancéreux.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

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