Laser à thulium à ondes continues pour le chauffage des cellules cultivées pour enquêter sur les effets thermiques cellulaires

L’objectif global de cette procédure est d’étudier in vitro les réponses biologiques cellulaires dépendantes de la dose thermique en chauffant des cellules cultivées avec un contrôle précis de la température et du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines étudiant les réponses cellulaires ou tissulaires à l’hyperthermie, comme l’étude du traitement au laser rétinien. Le principal avantage de cette technique est un échauffement rapide des cellules et un contrôle précis de la durée de chauffage permettant une exposition thermique hautement reproductible lors des expériences.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des réponses des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes cultivées à l’irradiation laser thermique, elle peut également être appliquée à d’autres modèles tels que les cellules cancéreuses. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en chauffant des cellules contenant de la mélanine avec de la lumière laser visible. Cependant, cela a entraîné des profils de température variables en raison des variations de pigmentation.

Pour commencer la procédure, placez une plaque chauffante dans un support de laboratoire en métal réglable sur un banc propre. Réglez la plaque chauffante à 39 degrés Celsius. Fixez une fibre NA de 0,22 avec un diamètre de noyau de 365 micromètres au bras horizontal du support.

Positionnez le bras métallique sur la plaque chauffante et ajustez le support de manière à ce que la pointe de la fibre soit à 12 centimètres au-dessus de la plaque chauffante. Connectez un laser Thulium de 1,94 micromètre et 20 watts à un faisceau de visée de 365 nanomètres et d’un milliwatt à la pointe de la fibre. Placez une boîte de culture de 30 millimètres de diamètre sur la plaque chauffante.

Tracez soigneusement la circonférence du plat sur la surface de la plaque chauffante, puis retirez le plat. Allumez le faisceau de visée et ajustez le support jusqu’à ce que le centre du point de faisceau sur la plaque chauffante corresponde au cercle tracé. Désactivez ensuite le faisceau de visée.

Pour commencer la procédure d’étalonnage de la température, chauffez la pointe d’une aiguille de calibre 20 avec un bec Bunsen. Avec la pointe de l’aiguille chauffée, percez le plat de culture de 30 millimètres de diamètre près du fond en quatre points espacés de 90 degrés pour faire des trous d’environ 300 micromètres de diamètre. Placez du ruban isolant sur les trous.

À l’aide d’une aiguille fine, percez un trou d’environ 200 micromètres de diamètre à travers le ruban adhésif recouvrant chaque trou. Sur la face inférieure de la boîte de culture, tracez une ligne entre chaque paire de trous à 180 degrés l’un de l’autre. En commençant à l’intersection des lignes, marquez tous les trois millimètres radialement le long de chaque ligne pour désigner les 21 points de mesure.

Placez ensuite exactement 1,2 millilitres de milieu de culture frais préchauffé à 37 degrés Celsius dans le plat. Couvrez le plat et placez le plat dans le cercle tracé sur la plaque chauffante. Connectez un thermocouple d’un diamètre de 200 micromètres à l’ordinateur de contrôle laser et ouvrez le protocole d’étalonnage de la température.

Insérez le thermocouple dans l’un des trous de la parabole de sorte que la pointe se trouve au fond de la parabole à l’un des emplacements de la marque. Il est très important de vérifier si l’extrémité du thermocouple touche le fond du plat à la précision mesurée car la température peut varier en fonction de la profondeur. Attendez que le milieu de culture se stabilise à 37 degrés Celsius.

Allumez ensuite le laser au thulium et réglez la puissance du laser sur le niveau de départ souhaité. Vérifiez que les durées de préchauffage sont réglées sur 140 et huit secondes, puis démarrez la séquence d’irradiation de préchauffage. Après 140 secondes comme indiqué par un bip sonore, retirez immédiatement le couvercle de la boîte de culture.

Attendez que le préchauffage se termine et que l’irradiation de 10 secondes se produise. Ensuite, couvrez immédiatement le plat. Mesurez la température aux 21 marques de cette manière.

Effectuez cette procédure trois fois à des intervalles de puissance de trois watts couvrant la plage de puissance du laser. Une fois terminé, éteignez le laser au thulium. Exportez et analysez les données de température.

Avant l’expérience, la culture a permis de louer des cellules épithéliales pigmentaires dans des boîtes de culture de 30 diamètres. Maintenez les cultures cellulaires à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % et vérifiez-les à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes. Une heure avant l’irradiation, remplacez le milieu de culture dans chaque plat par exactement 1,2 millilitre de milieu de culture frais.

Retournez les cultures dans l’incubateur. Vérifiez que la station d’irradiation est prête et que la plaque chauffante est réglée à 39 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’irradiation, démarrez le laser au thulium à la puissance souhaitée.

Ouvrez le protocole d’expérience et vérifiez que les durées de préchauffage sont réglées sur 140 et huit secondes. Placez une culture cellulaire EPR dans une boîte fermée à l’endroit marqué sur la plaque chauffante et démarrez immédiatement la séquence d’irradiation de préchauffage de 140 et huit secondes. Retirez le couvercle du plat après 140 secondes de préchauffage.

Attendez que le préchauffage se termine et que l’irradiation de 10 secondes se produise. Couvrez immédiatement le plat, attendez sept secondes, puis remettez le plat dans l’incubateur. Irradiez des échantillons supplémentaires à des niveaux de puissance laser croissants.

Lorsque vous avez terminé, éteignez le laser au thulium. Pour commencer l’évaluation de la viabilité cellulaire, lavez les cellules irradiées avec du PBS. Obtenir un kit capable de différencier les cellules apoptotiques et nécrotiques vivantes.

Ensuite, en basse lumière, combinez 500 microlitres de tampon de liaison avec 25 microlitres d’homodimère-3 d’éthidium, d’annexine FITC et de Hoechst 33342. Incuber les cellules dans cette solution de coloration à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, lavez deux fois les cellules avec un tampon de liaison 1X.

Remplacez le tampon de liaison par du PBS et placez la cellule sur la platine d’un microscope à fluorescence doté de filtres DAPI, FITC et TRITC. Réglez le chemin de la lumière du microscope sur l’objectif oculaire et sélectionnez le filtre DAPI. Allumez la lumière d’éclairage et trouvez le plan de mise au point avec un objectif 4X.

Réglez le trajet de la lumière sur la caméra du microscope. Utilisez le logiciel d’imagerie microscope pour centrer et faire la mise au point de l’image. Définissez les paramètres d’acquisition d’images à l’aide du filtre DAPI.

Répétez le processus de mise au point et la configuration de l’acquisition d’image avec les filtres FITC et TRITC. Ensuite, utilisez le logiciel d’imagerie pour acquérir plusieurs images avec trois jeux de filtres à travers la boîte et combinez-les en une seule image de l’ensemble de la boîte de culture. Utilisez un logiciel d’analyse pour déterminer les seuils de température pour l’apoptose et la mort cellulaire.

La relation proportionnelle entre l’augmentation maximale de la température au centre d’une boîte de culture cellulaire et la puissance du laser a été déterminée par la procédure d’étalonnage thermique décrite. La distribution maximale de la température à travers la boîte de culture cellulaire a ensuite été ajustée à une fonction gaussienne. Trois modèles de coloration ont été observés après l’irradiation.

Aucun changement de viabilité n’a été observé dans les cultures soumises à des températures égales ou inférieures à 43 degrés Celsius. L’apoptose a été observée pour la première fois trois heures après l’irradiation à 47 degrés Celsius. La mort cellulaire a été observée plus de trois heures après 51 degrés Celsius et plus.

Les températures seuils moyennes pour l’apoptose et la mort cellulaire ont ensuite été déterminées en appliquant la moyenne des rayons mesurés des zones mortes et apoptotiques à la fonction gaussienne décrivant la distribution de la température. Suite à cette procédure, les irradiations peuvent être effectuées dans de nombreuses conditions différentes, telles que des profils laser, des tailles de spot et des temps d’irradiation différents. Cela peut aider à comprendre et à enquêter sur les questions liées aux causes individuelles de la température chronométrée au niveau cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de chauffer la culture cellulaire avec un bon contrôle de la température et du temps. Cela peut dépendre des possibilités d’étudier les réponses biologiques à différentes conditions d’irradiation thermique. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être très dangereux pour vos yeux et votre peau.

Restez informé sur la formation à la sécurité de l’irradiation laser. Portez toujours des lunettes de sécurité, une blouse de laboratoire et des gants appropriés lors de cette procédure.