Name: Laser à thulium à ondes continues pour le chauffage des cellules cultivées pour enquêter sur les effets thermiques cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez le chauffage de cellules RPE avec un laser thulium à ondes continues de 1,94 µm pour étudier les réponses biologiques aux expositions thermiques contrôlées in vitro.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche du ministère fédéral de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF) (subvention N ° 13GW0043C) et d&#39;un Bureau européen de recherche et de développement aérospatiaux (EOARD, numéro de dossier FA9550-15-1-0443)

1. Culture Cellulaire RPE <ol><li> Isolation des cellules RPE des yeux porcins <ol><li> Obtenir des yeux de porc nouvellement énucléés de l'abattoir local. Gardez-les frais (4 ° C) et dans un environnement sombre. </li><li> Retirer les tissus extracellulaires avec des ciseaux et tremper les yeux dans une solution antiseptique pendant 5 min. </li><li> Placez les yeux dans une solution salée tamponnée au phosphate stérilisée sans calcium et magnésium (PBS (-)) jusqu'à l'utilisation. </li><li> À l'aide d'un scalpel, pénétrer dans la sclérotique à environ 5 mm postérieure au limbo cornéen. Reposer toute la partie antérieure de l'œil en coupant avec des ciseaux tout au long du parallèle au limbo cornéen. </li><li> Retirer la partie antérieure de l'œil ( c.-à-d. La cornée et la lentille) et le vitré. Ajouter 1 ml de PBS (-) et retirer doucement la rétine neurale. REMARQUE: Cette «coupe-yeux», composée de la sclère, de la choroïde et du RPE, est maintenant prête. </li><li> Ajouter une trypsine préchauffée (37 ° C) 0,25% en PBS (-) à la coupe des yeux. Réglez le volume de manière à ce que près de 80% de la tache d'oeil soit remplie avec cette solution de trypsine. </li><li> Incuber l'oeil avec la solution de trypsine dans un incubateur à 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Retirez la tache de l'oeuf de l'incubateur et remplacez la solution de trypsine à 0,25% par une solution de PBS (-) avec 0,05% de trypsine + 0,2% de sel de tétrasulfate d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA · 4N). Incuber l'oculaire dans l'incubateur pendant 45 minutes. REMARQUE: après 45 min, les cellules RPE seront soit simplement attachées à la membrane de Bruch, soit déjà détachées et flottant dans la solution trypsine-EDTA. </li><li> Collectez les cellules RPE par pipetage doux. Recueillir les cellules et la solution dans un tube conique rempli de 10 ml de milieu de culture (DMEM haute glucose avec L-glutamine), y compris 10% de sérum de porc, antibiotique / antimycotique et pyruvate de sodium (1 mM). NOTE: Le sérum peut neutraliser l'effet de la trypsine. </li><li> Centrifugez leSuspension cellulaire à 400 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 10 ml de milieu frais. Centrifuger à nouveau dans les mêmes conditions pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter un nouveau milieu, de telle sorte que la concentration de la cellule aboutit à 5 x 10 5 cellules / mL (déterminé en comptant les cellules en utilisant un hémocytomètre). Mélangez bien avec du pipetage doux. </li><li> Distribuer la suspension cellulaire dans des boîtes de culture cellulaire. Utilisez 3 mL par plat de culture de 60 mm de diamètre. NOTE: Cette culture s'appelle passage zéro (P0). </li><li> Maintenir les cellules dans un incubateur à 5% de CO 2 à 37 ° C. Changez la moitié du milieu conditionné au milieu frais tous les deux jours. </li><li> Subculture (étape 1.2) si elle devient confluente. </li></ol></li><li> Sous-culture de la culture de cellules RPE <ol><li> Retirer le milieu de culture et rincer les cellules deux fois avec du PBS (-). </li><li> Incuber les cellules avec une solution PBS (-) avec 0,05% de trypsine + 0,2% EDTA iNa 5% incubateur de CO 2 à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Détachez les cellules RPE par pipetage doux et collectez la suspension cellulaire dans un tube conique rempli de 10 ml de milieu de culture, y compris 10% de sérum de porc. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 400 xg pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirez le surnageant et ajoutez un nouveau milieu de culture, ce qui rend la concentration de cellules 5 x 10 5 cellules / mL (déterminée en comptant le nombre de cellules avec un hémocytomètre). Distribuer les cellules dans de nouvelles boîtes de culture de 60 mm de diamètre, comme décrit à l'étape 1.1.13. NOTE: La culture cellulaire est maintenant le passage 1 (P1). </li><li> Une fois la confluence atteinte, subcotentez la culture P1 à P2, en utilisant la même procédure décrite aux étapes 1.2.1-1.2.5. À partir de la culture P2, semer les cellules sur des boîtes de culture plus petites (diamètre intérieur de 30 mm) au lieu de plats de culture de 60 mm de diamètre. </li><li> Pour les expériences, utilisez des cultures P2 ou P3. </li></ol></li></ol> 2. ThulIrradiation au laser ium <ol><li> Construction de la station d'irradiation <ol><li> Connectez un appareil à laser thulium (1,94 μm, gamme de puissance: 0 à 20 W) à une fibre de diamètre de noyau de 0,22-NA, 365 μm. </li><li> Fixez mécaniquement la pointe de la fibre au bras métallique qui est fixé horizontalement au poteau métallique vertical de la station d'irradiation. Placez le poteau vertical de sorte que la pointe de la fibre laser soit située au-dessus de la plaque chauffante sur laquelle le plat de culture cellulaire doit être placé pendant l'irradiation. </li><li> Posez un papier blanc sur la plaque chauffante et activez le faisceau de visée (λ = 635 nm, max = 1 mW, diamètre au niveau du papier ≈ 30 mm). Marquez la circonférence du faisceau de visée sur le papier blanc de manière à ce que la position où le plat de culture soit placé pendant l'irradiation soit connue. REMARQUE: Le plan z de la pointe de la fibre peut être modifiable. Sans aucune optique d'imagerie supplémentaire, le diamètre du spot laser sur le plan de culture cellulaire, placé à 12 cm sous la pointe de la fibre, iS environ 30 mm, ce qui est presque équivalent au diamètre intérieur du plat de culture cellulaire. Un schéma de la configuration est illustré à la figure 1 . </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg"> Figure 1: Image schématique de la station d'irradiation au laser Thulium. Un plat de culture est placé sur la plaque chauffante. Les cellules sont placées à 12 cm sous la pointe de la fibre laser de thulium, de sorte que la taille du faisceau est presque identique au diamètre intérieur du plat de culture (environ 30 mm). La procédure d'irradiation au laser est contrôlée par une routine contrôlée dans le temps de la plate-forme de conception de systèmes sur mesure. Le réglage de puissance doit être déterminé avant le démarrage du programme d'irradiation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <olstart> Rayonnement laser de la culture cellulaire <ol><li> 1 heure avant l'irradiation, remplacez complètement le milieu de culture par 1,2 ml de milieu frais. REMARQUE: Il s'agit d'une ÉTAPE CRITIQUE et doit être strictement suivie. </li><li> Placez la station d'irradiation ( c'est-à-dire la plaque chauffante et le poteau pour fixer la fibre laser) sur un banc propre. </li><li> Retirez le plat de culture cellulaire de l'incubateur et placez-le sur la position marquée sur la plaque chauffante (étape 2.1.3). </li><li> Portez des lunettes de protection. Allumez le laser Thulium. Réglez la puissance souhaitée sur le périphérique laser (réglable de 0 à 20 W). Activez l'émission. </li><li> Démarrez une plate-forme de conception de système qui contrôle le rayonnement laser et le protocole de temporisation (fichier supplémentaire). </li><li> Immédiatement après avoir placé le plat de culture sur la plaque chauffante, cliquez sur le "temps de préchauffage" pour démarrer la minuterie pendant 140 s ("temps de préchauffage 1"); Cela maintiendra la température du milieu de culture à 37 ° C avant l'irradiation. REMARQUE: après 140 s, un bip sonore s'allume et la minuterie suivante ("temps de préchauffage 2") commencera à compter automatiquement 8 s. Au cours de ces 8 s, l'examinateur peut ouvrir le plat de culture. Après 148 s de préchauffage, une irradiation au laser de 10 s sur la culture cellulaire se déroulera automatiquement. En cas d'urgence, équiper le périphérique laser avec un bouton force-quit pour arrêter immédiatement le laser. Il s'agit d'une ÉTAPE CRITIQUE et doit être strictement suivie. Un point particulier de précaution concerne l'ouverture du couvercle avant l'irradiation, au début du temps de préchauffage de 8 s. L'ouverture du couvercle peut refroidir très rapidement la surface moyenne. </li><li> Après l'irradiation, placez immédiatement le couvercle sur le plat de culture, laissez le plat de culture sur la plaque chauffante pendant 7 s supplémentaires et remettez-la dans l'incubateur à 5% de CO 2 à 37 ° C. </li></ol><li> Mesure de la répartition de la température à laNiveau cellulaire (étalonnage de la température) <ol><li> Faire de petits trous (environ 300 μm de diamètre) près du fond sur quatre côtés (tous les 90 °) d'un plat de culture de 30 mm de diamètre (sans cellules); Utilisez la pointe d'une aiguille (20G) chauffée avec un brûleur Bunsen. Sceller les trous avec un ruban d'isolation électrique de l'extérieur et faire un petit trou avec une aiguille fine de sorte que seul un thermocouple fin (200 μm de diamètre) puisse être inséré dans ce trou dans des conditions étanches. </li><li> À l'extérieur du fond de la cuvette de culture, dessiner 2 diamètres perpendiculaires et régler le point de croisement ( c'est-à-dire le centre du côté inférieur) en tant que coordonnées zéro (0). Marquez tous les 3 mm radialement à l'extérieur du plat ( c.-à-d. 0, 3, 6, 9, 12 et 15 mm) dans chaque direction le long des lignes ( Figure 2 , points bleus); Le nombre de points devrait être de 21 au total. </li><li> Remplir le plat de culture cellulaire avec 1,2 ml de nouveau milieu de culture. Placez la culture dIsh sur une plaque chauffante à 37 ° C, insérer un thermocouple fin (200 μm de diamètre) dans le trou latéral, et placer son extrémité sensible sur une position marquée à mesurer. </li><li> Portez des lunettes de protection. Activez le laser Thulium et réglez manuellement la puissance (entre 0 et 20 W, par incréments de 0,1 W) du dispositif laser. REMARQUE: Pour l'étalonnage de la température, les mesures avec la puissance par incréments de 3 W devraient être suffisantes. </li><li> Activez la plate-forme de conception du système et cliquez sur le bouton "Démarrer Temp. Acquisition" (fichier supplémentaire) pour commencer la mesure de la température. </li><li> Effectuez la même procédure qu'à l'étape 2.2.6. REMARQUE: Le programme de contrôle mesure la température du thermocouple inséré toutes les 100 ms et montre la progression de la température pendant l'irradiation dans l'interface graphique. </li><li> Effectuez ces procédures pour tous les 21 points de mesure et à différents paramètres d'alimentation. Répétez l'opération entière trois fois pour tous les points et pour toutes les configurations de puissanceGs pour obtenir des données fiables. </li><li> Exporter les données de température en tant que données csv, qui peuvent éventuellement être converties en une feuille de calcul. Moyenne de la température maximale à la fin de l'irradiation pour les mesures en triple en tous points. Moyenne des valeurs des points sur le même cercle (4 points au total, sauf le point central). </li><li> Tracez la température maximale moyenne obtenue sur un graphique, ce qui fait que la distance entre le centre du plat (mm) est l'axe des abscisses et l'augmentation de la température (ΔT, ° C) en tant qu'huscule y. Utilisez la fonction d'ajustement d'un logiciel mathématique pour adapter un modèle gaussien aux données brutes. Créez une distribution Gaussian de la température d'ajustement. </li></ol></li><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg"> Figure 2: Les points pour l'étalonnage de la température dans un plat de culture cellulaire. Les données de température ont été mesurées au centre et à 5Points radiaux sur 4 angles différents (points bleus). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 3. Évaluations biologiques des réponses cellulaires après différentes irradiations thermiques <ol><li> Évaluation de la viabilité cellulaire ( c.-à-d. , Vivante, apoptotique et morte) suivant différents paramètres de puissance et la détermination du seuil de mort cellulaire <ol><li> Aux points de temps indiqués ( c.-à-d., 3, 24 et 48 h après l'irradiation), lavez les cellules avec PBS (-) et utilisez un kit disponible dans le commerce pour évaluer la viabilité cellulaire ( c'est-à-dire vital, apoptotique, mort) selon le fabricant protocole. </li><li> Préparer une solution de coloration en ajoutant 5 μL d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -annexine V, 5 μL d'homodimère III d'éthidium et 5 μL de Hoechst 33342 à 100 μL de 1x tampon de liaison (tous sont kitComposants). Préparez une solution de coloration suffisante pour couvrir les cellules. Incuber les cellules pendant 15 min. </li><li> Laver la culture cellulaire avec le tampon de liaison deux fois, remplacer le tampon de liaison par PBS (-) et régler la culture sur le stade d'un microscope à fluorescence. </li><li> Mettez le chemin de lumière vers la lentille oculaire, sélectionnez le filtre 4 ', 6-Diamidin-2-phénylindol (DAPI), allumez le voyant d'éclairage et trouvez le plan focalisé avec l'objectif 4x. </li><li> Modifiez le chemin de l'éclairage vers l'appareil photo, trouvez l'image sur l'écran de l'ordinateur dans le logiciel d'imagerie du microscope et ajustez la mise au point. </li><li> Utilisez la fonction de point ( c.-à-d., La fonction pour enregistrer plusieurs images dans le plat, puis créez une image unique et large) du logiciel spécifique au microscope pour obtenir l'image de fluorescence du plat de culture de cellules entière. Utilisez 3 ensembles de filtres différents - DAPI, FITC et tétraméthylrhodamine (TRITC) - pour l'image Hoechst 33342-cellules positives (tous les noyaux cellulaires), FITC-annexin V-positiCellules ve (cellules apoptotiques) et éthidium homodimère III (mortes), respectivement. </li><li> Mesurez le rayon (mm) de la région morte (ethidium homodimer III-positive) et le rayon externe / interne de la région de forme de bande apoptotique (annexine V-positive) dans les cultures de cellules colorées. Appliquer ces rayons à la fonction gaussienne ajustée de la distribution de température pour le réglage de puissance correspondant. Calculez la température exacte à la jante de la région morte ou apoptotique pour clarifier les températures seuils pour la mort cellulaire et le changement apoptotique. </li></ol></li></ol></olstart>

<ol><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+pure+yellow+%28577-nm%29+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+%28561-577-nm%29+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+retina+therapy+%28SRT%29+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li>
<li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).</li>
<li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li>
<li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li>
<li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li>
<li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li>
<li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Optics%22%5BJournal%5D)">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li>
<li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

En discutant des réponses cellulaires biologiques liées à la température, non seulement la température, mais aussi la durée de la température augmentée, est importante, car la plupart des processus biochimiques dépendent du temps. En particulier dans le domaine de l&#39;hyperthermie induite par laser dans l&#39;ophtalmologie, en raison de la courte période, de millisecondes à secondes, il est difficile d&#39;étudier les effets thermiques cellulaires avec un contrôle précis de la température. Par conséquent, une installa...

Comprendre les réponses biologiques cellulaires dépendantes de la température est d&#39;une grande importance pour les traitements hyperthermia réussis. La photocoagulation au laser rétinienne avec un laser thermique, utilisé en ophtalmologie, est l&#39;un des traitements laser les plus établis en médecine. La lumière visible, principalement de la longueur d&#39;onde verte à jaune, est utilisée dans le traitement au laser de la rétine. La lumière est fortement absorbée par la mélanine dans les cellules épithéliales du pigment rétinien (RPE), qui forment la monocouche cellulaire la plus externe de la rétine. Les médecins et les chercheurs s&#39;intéressent récemment à une irradiation thermique très douce (photocoagulation sous-visible) comme nouvelle stratégie thérapeutique pour différents types de troubles rétiniens 1 , 2 . À la suite de cette tendance, notre intérêt est de subalternément chauffer les cellules RPE sous un contrôle précis de la température, une technique appelée traitement photothermique à température contrôlée (TC-PTT). Option récenteLa technologie acoustique de notre institut a permis la mesure en temps réel des augmentations de température dans les sites irradiés de la rétine. Cela permet de contrôler l&#39;augmentation de la température pendant l&#39;irradiation 3 . Cependant, étant donné que l&#39;hyperthermie sous-létale sur la rétine, causée par le chauffage de cellules RPE sous-létalement, n&#39;a pas été considérée auparavant en raison de l&#39;impossibilité de mesurer et de contrôler la température, les réponses cellulaires dépendant de la température des cellules RPE suite à une irradiation laser thermique Ont été étudiés très peu à ce jour. En outre, non seulement la différence de température n&#39;a pas été discutée en détail, mais aussi la différence dans le comportement cellulaire des cellules survivantes après une irradiation sub-létale et mortelle. Par conséquent, pour recueillir des preuves scientifiques sur les traitements basés sur TC-PTT, nous cherchons à élucider les réponses biologiques des cellules RPE dépendantes de la température et leurs mécanismes en utilisant des configurations expérimentales in vitro . Pour tIl est nécessaire d&#39;établir une installation de chauffage cellulaire répondant aux conditions suivantes: 1) une possibilité pour une augmentation rapide de la température, 2) un temps et une température précisément contrôlés, et 3) un nombre relativement élevé de cellules examinées pour des expériences biologiques . En ce qui concerne la méthode de chauffage, un laser clinique, tel qu&#39;un laser Nd.YAG à fréquence double (532 nm), n&#39;est malheureusement pas adapté au chauffage de la culture cellulaire. Ceci est dû au nombre fortement réduit de mélanosomes dans les cellules RPE cultivées. L&#39;absorption de la lumière laser peut être inhomogène, et la température augmente au niveau cellulaire est variable entre les expériences, même lorsqu&#39;elles sont irradiées avec une même puissance de rayonnement. Plusieurs études précédentes ont rapporté l&#39;utilisation de papier noir sous le fond du plat pendant l&#39;irradiation 4 ou l&#39;utilisation de mélanosomes supplémentaires qui sont phagocytisés par les cellules de culture avant les expériences 5 , 6 . Un grand nombre deLes études biologiques in vitro pour évaluer les réponses cellulaires induites par l&#39;hyperthermie ont été effectuées à l&#39;aide d&#39;une plaque chauffante, d&#39;un bain-marie ou d&#39;un incubateur de CO 2 avec un réglage de température 7 . Ces méthodes nécessitent une longue période de chauffage car cela prend du temps ( c&#39;est-à-dire plusieurs minutes) pour atteindre la température souhaitée. En outre, en utilisant ces méthodes, il est difficile d&#39;obtenir un historique thermique détaillé ( c&#39;est-à-dire une température multipliée par le temps) au niveau cellulaire. En outre, la température entre les cellules à différentes positions dans un plat de culture peut différer en raison de la diffusion variable de la température. Dans la plupart des cas, cette information de température temporelle et spatiale pendant l&#39;hyperthermie n&#39;a pas été prise en considération pour les analyses biologiques, même si la réponse biologique des cellules peut être affectée de manière critique par la température et la durée de la température augmentée. Pour surmonter ces problèmes, un contiLe laser à thulium à ondes nuous a été utilisé ici pour chauffer les cellules. Le rayonnement laser Thulium (λ = 1,94 μm) est fortement absorbé par l&#39;eau 8 et les cellules au fond du plat de culture sont stimulées thermiquement uniquement par diffusion thermique. La fibre laser avec un diamètre de 365 μm est réglée à environ 12 cm au-dessus du plat de culture, sans aucune optique entre les deux. Le diamètre du faisceau laser diverge de sorte qu&#39;il soit presque équivalent au diamètre intérieur du plat de culture (30 mm) à la surface du milieu de culture. Avec une quantité constante de milieu de culture, il est possible d&#39;irradier les cellules avec l&#39;augmentation de température De haute répétabilité. Les réglages de puissance variables permettent une irradiation jusqu&#39;à 20 W, et la température moyenne au niveau cellulaire peut être augmentée jusqu&#39;à ΔT ≈ 26 ° C en 10 s. En modifiant les conditions d&#39;irradiation, il est également possible de modifier le profil du faisceau laser pour faire varier la distribution de la températureDans un plat culturel. Par exemple, il est possible d&#39;étudier avec une répartition de la température Gaussienne, comme dans l&#39;étude actuelle, ou avec une répartition homogène de la température. Ce dernier peut être avantageux pour étudier les effets des réponses cellulaires dépendantes de la température plus spécifiquement pour les augmentations de la température sous-létales, mais pas pour le stress de la mort cellulaire ou les réponses de guérison des plaies. Au total, l&#39;irradiation au laser Thulium peut permettre d&#39;étudier différents types de facteurs biologiques, tels que l&#39;expression génétique / protéique, la cinétique de la mort cellulaire, la prolifération cellulaire et le développement de la fonctionnalité cellulaire, après différentes expositions thermiques.

<table><tbody><tr><td><Réactifs>forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Glycémie moyenne à élevée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>Ajouter (2)-(4) avant utilisation. Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation.</td></tr><tr><td>Solution antibiotique antimycosique (100 &fois ;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>Contenant 10 000 unités de pénicilline, 10 mg de streptomycine et 25 &mu ; g d’amphotéricine B dans 1mL. Ajouter 5,5 mL dans une bouteille moyenne de 500 mL (1) avant utilisation.</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>Ajouter 5,5 mL dans un flacon moyen de 500 mL (1) avant utilisation (concentration finale : 1 mM)</td></tr><tr><td>Sérum porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td><td>Ajouter 50 mL dans une bouteille moyenne de 500 mL (1) avant utilisation (finale : 10 %)</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td></td></tr> Human <tr><td>VEGF Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D System</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect Kit de dosage du glutathion total</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection de cellules apoptotiques/nécrotiques/saines</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser au thulium</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Prototype</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm diamètre du noyau</td><td>fibre COMPOSANTS LASER Allemagne</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques ( spectrofluorimètre)</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td>homogénéisateur de cellules</td><td>QIAGEN</td><td>TissueLyser LT</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti</td><td></td></tr><tr><td></td><td>logiciel mathématique The Mathworks. Inc</td><td>MATLAB Release 2015b</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme de conception de systèmes</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

laser à thulium à ondes continues pour le chauffage des cellules cultivées pour enquêter sur les effets thermiques cellulaires

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Une méthode originale pour chauffer des cellules cultivées à l&#39;aide d&#39;un laser à thulium à ondes continues de 1,94 μm pour une évaluation biologique est présentée ici. Le rayonnement laser Thulium est fortement absorbé par l&#39;eau, et les cellules au fond du plat de culture sont chauffées par diffusion thermique. Une fibre laser avec un diamètre de 365 μm est réglée à environ 12 cm au-dessus du plat de culture, sans aucune optique, de sorte que le diamètre du faisceau laser soit presque équivalent au diamètre intérieur du plat de culture (30 mm). En conservant une quantité constante de milieu de culture dans chaque expérience, il est possible d&#39;irradier les cellules avec une augmentation de température hautement reproductible. Pour étalonner l&#39;augmentation de la température et sa distribution dans un plat de culture cellulaire pour chaque réglage de puissance, la température a été mesurée pendant 10 s d&#39;irradiation à différentes positions et au niveau cellulaire. La distribution de la température a été représentée à l&#39;aide d&#39;un logiciel graphique mathématiqueProgramme, et son modèle à travers le plat de la culture était sous forme gaussienne. Après l&#39;irradiation au laser, différentes expériences biologiques pourraient être effectuées pour évaluer les réponses cellulaires dépendantes de la température. Dans ce manuscrit, la coloration de la viabilité ( c&#39;est-à-dire la distinction des cellules vivantes, apoptotiques et mortes) est introduite pour déterminer les températures de seuil pour l&#39;apoptose cellulaire et la mort après différents moments. Les avantages de cette méthode sont la précision de la température et du temps de chauffage, ainsi que son efficacité élevée dans les cellules de chauffage dans un plat de culture de cellules entières. En outre, il permet d&#39;étudier avec une grande variété de températures et de durées de temps, qui peuvent être bien contrôlés par un système d&#39;exploitation informatisé.

Distribution de la température après différents réglages d'alimentation Tous les développements de la température pour chaque irradiation unique ont été surveillés dans l'étalonnage de la température. À partir de ces données, la température maximale au point mesuré a été obtenue et définie comme T max (° C). Comme le montre la figure 3A , le programme a été exécuté au moment où le plat de ...

Une configuration expérimentale originale pour le chauffage des cellules dans un plat de culture utilisant un rayonnement laser à onde continue de 1,94 μm est présentée ici. En utilisant cette méthode, les réponses biologiques des cellules épithéliales du pigment rétinien (RPE) après différentes expositions thermiques peuvent être étudiées.

Laser à thulium à ondes continues pour le chauffage des cellules cultivées pour enquêter sur les effets thermiques cellulaires

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier in vitro les réponses biologiques cellulaires dépendantes de la dose thermique en chauffant des cellules cultivées avec un contrôle précis de la température et du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines étudiant les réponses cellulaires ou tissulaires à l’hyperthermie, comme l’étude du traitement au laser rétinien. Le principal avantage de cette technique est un échauffement rapide des cellules et un contrôle précis de la durée de chauffage permettant une exposition thermique hautement reproductible lors des expériences.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des réponses des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes cultivées à l’irradiation laser thermique, elle peut également être appliquée à d’autres modèles tels que les cellules cancéreuses. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en chauffant des cellules contenant de la mélanine avec de la lumière laser visible. Cependant, cela a entraîné des profils de température variables en raison des variations de pigmentation.Pour commencer la procédure, placez une plaque chauffante dans un support de laboratoire en métal réglable sur un banc propre. Réglez la plaque chauffante à 39 degrés Celsius. Fixez une fibre NA de 0,22 avec un diamètre de noyau de 365 micromètres au bras horizontal du support.Positionnez le bras métallique sur la plaque chauffante et ajustez le support de manière à ce que la pointe de la fibre soit à 12 centimètres au-dessus de la plaque chauffante. Connectez un laser Thulium de 1,94 micromètre et 20 watts à un faisceau de visée de 365 nanomètres et d’un milliwatt à la pointe de la fibre. Placez une boîte de culture de 30 millimètres de diamètre sur la plaque chauffante.Tracez soigneusement la circonférence du plat sur la surface de la plaque chauffante, puis retirez le plat. Allumez le faisceau de visée et ajustez le support jusqu’à ce que le centre du point de faisceau sur la plaque chauffante corresponde au cercle tracé. Désactivez ensuite le faisceau de visée.Pour commencer la procédure d’étalonnage de la température, chauffez la pointe d’une aiguille de calibre 20 avec un bec Bunsen. Avec la pointe de l’aiguille chauffée, percez le plat de culture de 30 millimètres de diamètre près du fond en quatre points espacés de 90 degrés pour faire des trous d’environ 300 micromètres de diamètre. Placez du ruban isolant sur les trous.À l’aide d’une aiguille fine, percez un trou d’environ 200 micromètres de diamètre à travers le ruban adhésif recouvrant chaque trou. Sur la face inférieure de la boîte de culture, tracez une ligne entre chaque paire de trous à 180 degrés l’un de l’autre. En commençant à l’intersection des lignes, marquez tous les trois millimètres radialement le long de chaque ligne pour désigner les 21 points de mesure.Placez ensuite exactement 1,2 millilitres de milieu de culture frais préchauffé à 37 degrés Celsius dans le plat. Couvrez le plat et placez le plat dans le cercle tracé sur la plaque chauffante. Connectez un thermocouple d’un diamètre de 200 micromètres à l’ordinateur de contrôle laser et ouvrez le protocole d’étalonnage de la température.Insérez le thermocouple dans l’un des trous de la parabole de sorte que la pointe se trouve au fond de la parabole à l’un des emplacements de la marque. Il est très important de vérifier si l’extrémité du thermocouple touche le fond du plat à la précision mesurée car la température peut varier en fonction de la profondeur. Attendez que le milieu de culture se stabilise à 37 degrés Celsius.Allumez ensuite le laser au thulium et réglez la puissance du laser sur le niveau de départ souhaité. Vérifiez que les durées de préchauffage sont réglées sur 140 et huit secondes, puis démarrez la séquence d’irradiation de préchauffage. Après 140 secondes comme indiqué par un bip sonore, retirez immédiatement le couvercle de la boîte de culture.Attendez que le préchauffage se termine et que l’irradiation de 10 secondes se produise. Ensuite, couvrez immédiatement le plat. Mesurez la température aux 21 marques de cette manière.Effectuez cette procédure trois fois à des intervalles de puissance de trois watts couvrant la plage de puissance du laser. Une fois terminé, éteignez le laser au thulium. Exportez et analysez les données de température.Avant l’expérience, la culture a permis de louer des cellules épithéliales pigmentaires dans des boîtes de culture de 30 diamètres. Maintenez les cultures cellulaires à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % et vérifiez-les à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes. Une heure avant l’irradiation, remplacez le milieu de culture dans chaque plat par exactement 1,2 millilitre de milieu de culture frais.Retournez les cultures dans l’incubateur. Vérifiez que la station d’irradiation est prête et que la plaque chauffante est réglée à 39 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’irradiation, démarrez le laser au thulium à la puissance souhaitée.Ouvrez le protocole d’expérience et vérifiez que les durées de préchauffage sont réglées sur 140 et huit secondes. Placez une culture cellulaire EPR dans une boîte fermée à l’endroit marqué sur la plaque chauffante et démarrez immédiatement la séquence d’irradiation de préchauffage de 140 et huit secondes. Retirez le couvercle du plat après 140 secondes de préchauffage.Attendez que le préchauffage se termine et que l’irradiation de 10 secondes se produise. Couvrez immédiatement le plat, attendez sept secondes, puis remettez le plat dans l’incubateur. Irradiez des échantillons supplémentaires à des niveaux de puissance laser croissants.Lorsque vous avez terminé, éteignez le laser au thulium. Pour commencer l’évaluation de la viabilité cellulaire, lavez les cellules irradiées avec du PBS. Obtenir un kit capable de différencier les cellules apoptotiques et nécrotiques vivantes.Ensuite, en basse lumière, combinez 500 microlitres de tampon de liaison avec 25 microlitres d’homodimère-3 d’éthidium, d’annexine FITC et de Hoechst 33342. Incuber les cellules dans cette solution de coloration à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, lavez deux fois les cellules avec un tampon de liaison 1X.Remplacez le tampon de liaison par du PBS et placez la cellule sur la platine d’un microscope à fluorescence doté de filtres DAPI, FITC et TRITC. Réglez le chemin de la lumière du microscope sur l’objectif oculaire et sélectionnez le filtre DAPI. Allumez la lumière d’éclairage et trouvez le plan de mise au point avec un objectif 4X.Réglez le trajet de la lumière sur la caméra du microscope. Utilisez le logiciel d’imagerie microscope pour centrer et faire la mise au point de l’image. Définissez les paramètres d’acquisition d’images à l’aide du filtre DAPI.Répétez le processus de mise au point et la configuration de l’acquisition d’image avec les filtres FITC et TRITC. Ensuite, utilisez le logiciel d’imagerie pour acquérir plusieurs images avec trois jeux de filtres à travers la boîte et combinez-les en une seule image de l’ensemble de la boîte de culture. Utilisez un logiciel d’analyse pour déterminer les seuils de température pour l’apoptose et la mort cellulaire.La relation proportionnelle entre l’augmentation maximale de la température au centre d’une boîte de culture cellulaire et la puissance du laser a été déterminée par la procédure d’étalonnage thermique décrite. La distribution maximale de la température à travers la boîte de culture cellulaire a ensuite été ajustée à une fonction gaussienne. Trois modèles de coloration ont été observés après l’irradiation.Aucun changement de viabilité n’a été observé dans les cultures soumises à des températures égales ou inférieures à 43 degrés Celsius. L’apoptose a été observée pour la première fois trois heures après l’irradiation à 47 degrés Celsius. La mort cellulaire a été observée plus de trois heures après 51 degrés Celsius et plus.Les températures seuils moyennes pour l’apoptose et la mort cellulaire ont ensuite été déterminées en appliquant la moyenne des rayons mesurés des zones mortes et apoptotiques à la fonction gaussienne décrivant la distribution de la température. Suite à cette procédure, les irradiations peuvent être effectuées dans de nombreuses conditions différentes, telles que des profils laser, des tailles de spot et des temps d’irradiation différents. Cela peut aider à comprendre et à enquêter sur les questions liées aux causes individuelles de la température chronométrée au niveau cellulaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de chauffer la culture cellulaire avec un bon contrôle de la température et du temps. Cela peut dépendre des possibilités d’étudier les réponses biologiques à différentes conditions d’irradiation thermique. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être très dangereux pour vos yeux et votre peau.Restez informé sur la formation à la sécurité de l’irradiation laser. Portez toujours des lunettes de sécurité, une blouse de laboratoire et des gants appropriés lors de cette procédure.

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