Name: In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la transition endothéliale-mésenchymateuse cornéenne in vitro et in vivo à l'aide de cultures de cellules endothéliales bovines et d'un modèle de cryolésion chez le rat. Cette méthode aide les chercheurs à étudier la régénération cornéenne et à identifier des cibles thérapeutiques.

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Nous remercions le personnel du deuxième laboratoire de base, Département de la recherche médicale, Hôpital universitaire national de Taïwan pour leur soutien technique.

Toutes les procédures suivies dans cette étude accordée à l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l&#39;utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle du National Taiwan University Hospital. 1. Isolement, Culture Préparation primaire, et immunocoloration de Bovine CECs <ol><li> Acquérir les yeux frais de bovins à partir d&#39;un abattoir local. </li><li> Désinfecter les yeux d&#39;une solution aqueuse à 10% p / v povidone-iode pendant 3 min. les laver avec une solution saline (PBS), une solution tamponnée au phosphate. </li><li> Récolter le bouton cornéen avec un scalpel et les ciseaux dans des conditions stériles. la membrane de Peel Descemet avec une pince sous un microscope à dissection (à noter que dans cette étude, les yeux bovins ont été énucléés par un abattoir local et, par conséquent, la première procédure d&#39;étude était la désinfection des yeux preenucleated dans le laboratoire). </li><li> Incuber la membrane de Descemet dans 1 ml d&#39;essayerPSIN à 37 ° C pendant 30 min. Ramassez les CECs bovine par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu supplémenté épithéliale hormonale (SHEM) contenant des volumes égaux de tampon HEPES milieu Eagle modifié par Dulbecco et du milieu F12 de Ham, supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin, 0,5% de diméthylsulfoxyde, 2 ng / ml de l&#39;épiderme humain facteur de croissance, 5 mg / ml d&#39;insuline, 5 mg / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénium, 1 nmole / l de la toxine du choléra, 50 mg / ml de gentamicine et 1,25 mg / ml d&#39;amphotéricine B. </li><li> Ensemencer les cellules (environ 1 x 10 5 cellules par oeil) dans un plat de 6 cm. Culture eux dans la SHEM. Incuber le plat à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l&#39; air. Changer le milieu de culture tous les 3 jours. </li><li> Lorsque les cellules atteignent la confluence, lavez-les dans du PBS et incuber dans 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. Collectionnez-les par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de la SHEM. <ol&gt; <li> Compter les cellules dans un hémocytomètre. Ensemencer les cellules sur des lames de couverture à une densité de 1 x 10 4 par puits dans une plaque de 24 puits, et la culture des cellules de la SHEM. Pour étudier l&#39;effet EnMT-suppression de marimastat, incuber les cellules dans SHEM avec 10 uM de marimastat ajouté dans le milieu de culture, et de changer le milieu de culture tous les 3 jours. </li></ol></li><li> Fixer les cellules à un point de temps indiqué avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min. Poulie à 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps primaires contre actifs bêta-caténine (ABC), escargot, et slug nuit à 4 ° C. La dilution des anticorps primaires utilisés est de 1: 200. Les anticorps sont dilués dans du diluant d&#39;anticorps composée de 10 mM de PBS, 1% p / v de sérum-albumine bovine et 0,09% en poids / azoture de sodium c. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et on incube lem avec l&#39;anticorps conjugué Alexa Fluor secondaire (1: 100 dans le diluant d&#39;anticorps) à la température ambiante pendant 1 h. </li><li> Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole, laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et de les monter avec une solution anti-décoloration de montage. </li><li> Obtenir des images d&#39;immunofluorescence aux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 405 et 488 nm en utilisant un microscope confocal à balayage laser, avec un grossissement de 20x objectif. </li></ol> 2. Modèle de rat cornéenne endothéliale cryolésion et injection intracamérulaire <ol><li> Anesthésier 12 semaines vieux rats mâles Sprague-Dawley par une injection intramusculaire de xylazine à 2% (5,6 mg / kg) et de la tilétamine, plus zolazepam (18 mg / kg). Pincez doucement la peau des animaux pour confirmer l&#39;anesthésie appropriée en l&#39;absence de contractions de la peau. </li><li> Instiller une goutte de 0,5% de chlorhydrate de proparacaine à l&#39;oeil droit de chaque rat pour réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement. Insufflertétracycline pommade à l&#39;œil gauche pour prévenir la sécheresse de la cornée. </li><li> Refroidir une sonde en acier inoxydable (diamètre = 3 mm) dans de l&#39;azote liquide. Appliquer la sonde en acier inoxydable à la cornée centrale de l&#39;oeil droit pendant 30 sec. Fréquemment instiller PBS à l&#39;oeil droit lors de la procédure pour prévenir la sécheresse de la cornée. </li><li> Instiller 0,1% atropine et 0,3% de sulfate de gentamicine immédiatement après cryolésion et une fois par jour pour soulager la douleur oculaire résultant de ciliaire spasme et pour prévenir l&#39;infection. <ol><li> Après la procédure, garder les rats chaud à l&#39;aide d&#39;une lampe de chaleur, et d&#39;observer leur récupération toutes les 15 min après l&#39;anesthésie jusqu&#39;à ce qu&#39;ils reprennent le contrôle du moteur. En outre, appliquer la pommade tétracycline à l&#39;oeil droit pour prévenir la sécheresse de la cornée au cours de la période de récupération. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;cryolésion cornéenne pendant 3 jours consécutifs. </li><li> Pour délivrer le marimastat ou bFGF dans la chambre antérieure de l&#39;œil de rat, anesthésier les rats comme décrit précédemment. Instiller une gouttede 0,5% de chlorhydrate de proparacaine dans l&#39;œil droit de réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement. </li><li> Irriguer la surface oculaire avec du PBS stérile. Effectuer la chambre antérieure paracentèse sous un microscope opératoire en insérant une aiguille 30 G attachée à une seringue de 1 ml à la cornée claire paralimbiques dans un plan au-dessus et parallèle à l&#39;iris. </li><li> Tourner l&#39;aiguille biseau vers le haut, et légèrement appuyer sur la plaie cornéenne pour drainer une certaine humeur aqueuse et réduire la pression intra-oculaire. Injecter 0,02 ml du médicament intracamérulaire. comprimer doucement le tube de l&#39;aiguille avec une pointe de coton pendant le retrait de l&#39;aiguille. </li><li> Photographie de l&#39;œil externe à un point de temps indiqué sous le microscope opératoire. </li></ol> 3. La récolte du Rat Bouton cornéenne et immunocoloration <ol><li> Pour euthanasier les rats, les placer dans une chambre de l&#39; euthanasie et laisser infuser 100% de CO 2 à un taux de 10-30% du volume de la chambre par minute de remplissage. Maintenir le CO 2 pour une perfusionminute supplémentaire suite à l&#39;absence de la respiration et la couleur des yeux fané. </li><li> Pénétrer l&#39;œil de rat au limbe avec une lame tranchante. Couper les cornées avec des ciseaux cornéens le long du limbe. Aplatir les cornées sur une diapositive. Faire des incisions radiales supplémentaires si les cornées se recroquevillent. </li><li> Fixer les cornées avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min, et de bloquer 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min. </li><li> Incuber les cornées avec des anticorps primaires contre ABC pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution de 1: 200 dans le diluant d&#39;anticorps. Laver les cornées fois avec du PBS pendant 15 min, et de les laisser incuber avec l&#39;anticorps secondaire (1: 100 dans le diluant d&#39;anticorps) à la température ambiante pendant 1 h. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole, et laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min. </li><li> Monter les cornées en anti-fading solution de montage. Obnir les images d&#39;immunofluorescence aux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 405 et 561 nm avec un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 20x objectif. </li></ol>

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à déclarer.

CECs sont connus pour leur propension à subir des EnMT pendant la prolifération cellulaire. Pour élaborer des stratégies pour supprimer le processus EnMT à des fins thérapeutiques, une compréhension approfondie du mécanisme EnMT est nécessaire. Nous avons décrit 2 modèles pour étudier EnMT, à savoir la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro et le rat endothélium cornéen modèle cryolésion. Nos résultats ont démontré le processus EnMT dans les deux modèles. En outre, l&#39;effet de suppression de ...

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle essentiel dans le maintien de la clarté cornéenne et donc de l’acuité visuelle en régulant l’état d’hydratation du stroma cornéen par un pompage actif1. En raison du potentiel prolifératif limité des CEC humaines, le nombre de cellules diminue avec l’âge, et la réparation des plaies endothéliales cornéennes après une blessure est généralement réalisée par l’élargissement et la migration cellulaires, plutôt que par la mitose cellulaire2. Lorsque le nombre de CEC diminue en dessous d’un seuil d’environ 500 cellules/mm2, l’état de déshydratation du stroma cornéen ne peut pas être maintenu, entraînant une kératopathie bulleuse et une déficience visuelle3,4.
Le potentiel prolifératif limité des CEC humaines a été attribué à plusieurs facteurs, notamment l’expression réduite du facteur de croissance épidermique et de son récepteur dans les cellules vieillissantes5, l’antiprolifératif TGFβ2 dans l’humeur aqueuse6 et l’inhibition de contact2,7. Bien que certains facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF), puissent augmenter la prolifération dans un endothélium cornéen humain en culture, l’efficacité de la culture reste limitée8,9. De plus, les CEC peuvent subir un changement phénotypique au cours de l’expansion ex vivo, ressemblant à la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)10-13. La transition endothéliale-mésenchymateuse (EnMT) est caractérisée par une déstabilisation de la jonction cellulaire, une perte de polarité apicale-basale, un réarrangement cytosquelettique, une expression de l’actine du muscle lisse alpha et une sécrétion de collagènede type I 14. Toutes ces caractéristiques peuvent abroger le fonctionnement normal des CEC, entravant l’utilisation des CEC cultivées ex vivo dans l’ingénierie tissulaire. De plus, l’EnMT a été associée à la pathogenèse de plusieurs maladies de l’endothélium cornéen, notamment la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs et la formation de la membrane rétrocornéenne15,16. Par conséquent, la compréhension du mécanisme de l’EnMT peut aider à manipuler le processus EnMT et faciliter la régénération des CEC pour permettre un fonctionnement compétent. 
Dans cette étude, nous avons décrit une méthode pour isoler les CEC bovins du bouton cornéen. Dans la culture primaire in vitro, le processus EnMT, y compris un changement phénotypique, la translocation nucléaire de la β-caténine et les régulateurs EMT escargot et limace, a été observé. Nous avons également décrit une méthode de démonstration de l’EnMT in vivo en utilisant un modèle de cryolésion de l’endothélium cornéen de rat. En utilisant ces 2 modèles, nous avons démontré que la marimastat, un inhibiteur de la métalloprotéinase matricielle (MMP) à large spectre, peut supprimer le processus EnMT. Les protocoles décrits facilitent l’analyse détaillée du mécanisme EnMT et l’élaboration de stratégies pour manipuler le processus EnMT en vue d’une application clinique ultérieure.

<table><tbody><tr><td>trypsine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' milieu Eagle modifié et milieu F12 de Ham</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>facteur de croissance épidermique humain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>insuline, transferrine, sélénium&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>toxine cholérique</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>amphotéricine B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique</td><td>Sciences 111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-bêta-caténine anti-actif</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-escargot</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-limace</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris IgG (H+L) secondaire anticorps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>pour la coloration de l’ABC des CEC bovins</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires IgG (H+L) anti-souris</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>pour la coloration de l’ABC de l’endothélium cornéen du rat</td></tr><tr><td>Anticorps IgG (H+L) secondaire anti-lapin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>pour la coloration de l’escargot et de la limace des CEC bovins</td></tr><tr><td>Diluant d’anticorps</td><td>Genemed Biotechnologies</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>support de montage</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal à balayage laser</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>xylazine&nbsp ;</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>tilétamine plus zolazépam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>médicament vétérinaire</td></tr><tr><td>chlorhydrate de proparacaïne solution ophtalmique</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>médicament vétérinaire</td></tr><tr><td>0,1 % atropine</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>médicament clinique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine à 0,3 %</td><td>Sinphar Groupe</td><td>N/A</td><td>médicament clinique&nbsp ;</td></tr><tr><td>facteur de croissance des fibroblastes de base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>médicament clinique&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

in vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle crucial dans le maintien de la clarté cornéenne grâce à un pompage actif. Une réduction du nombre de CEC peut entraîner un œdème cornéen et une diminution de l’acuité visuelle. Cependant, les CEC humaines sont sujettes à un potentiel prolifératif compromis. De plus, la stimulation de la croissance cellulaire est souvent compliquée par la transition endothéliale-mésenchymateuse progressive (EnMT). Par conséquent, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de l’EnMT pour faciliter la régénération des CEC ayant une fonction compétente. Dans cette étude, nous avons préparé une culture primaire de CEC bovines en épluchant les CEC avec la membrane de Descemet du bouton cornéen et démontré que les CEC bovines présentaient le processus EnMT, y compris le changement phénotypique, la translocation nucléaire de la β-caténine et les régulateurs EMT escargot et limace, dans la culture in vitro. De plus, nous avons utilisé un modèle de cryolésion de l’endothélium cornéen de rat pour démontrer le processus EnMT in vivo. Collectivement, la culture primaire in vitro de CEC bovines et de modèles in vivo de cryolésions de l’endothélium cornéen de rat offre des plateformes utiles pour étudier le mécanisme de l’EnMT.

Après l&#39;isolement du PEC bovine, les cellules ont été cultivées in vitro. La figure 1 présente les images de contraste de phase de la CEC bovine. La forme hexagonale des cellules à confluence indiqué que les cellules ne sont pas contaminés par la cornée fibroblaste stromale lors de l&#39; isolement cellulaire. La figure 2 représente la immunocoloration qui a été effectuée en utilisant des anticorps contre ABC, escargot, et slug à un point de...

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d&#39;endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l&#39; endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le mécanisme de la transition endothéliale-mésenchymateuse cornéenne in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions concernant la transition endothéliale-mésenchymateuse cornéenne dans le domaine de la régénération de l'endothélium cornéen. L'avantage de cette technique est qu'elle peut être appliquée à la fois aux modèles in vitro et in vivo.Et est facile à manipuler. Les implications de cette technique concernent le traitement des maladies liées à la transition mésenchymateuse des cellules endothéliales cornéennes. Par exemple, la formation de ces maladies, car les modèles peuvent être utilisés pour sélectionner des agents qui inhibent le processus de transition mésenchymateuse des cellules endothéliales cornéennes.La procédure sera réalisée par Jung-Shen Chang, technicien d'un laboratoire. Pour commencer cette procédure, désinfecter des yeux de bovin frais dans une solution de povidone-iodée à 10 % poids par volume pendant trois minutes. Ensuite, les rincer au PBS.Prélvez le bouton cornéen à l’aide d’un scalpel et de ciseaux, puis rincez-le au PBS. Sous un microscope stéréo, détachez la membrane de Descemet à l’aide de pinces. Incubez ensuite la membrane de Descemet dans un millilitre de trypsine à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis, récupérez les CEC bovins par centrifugation à 112 ×g pendant cinq minutes.Après centrifugation, reprendre les cellules dans un millilitre de milieu SHEM. Ensemencer les cellules dans une boîte de six centimètres et les cultiver dans le milieu SHEM. Par la suite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2 et changer le milieu de culture tous les trois jours.Lorsque les cellules atteignent la confluence, les laver au PBS. Ensuite, les incuber dans un millimètre de trypsine à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Les recueillir par centrifugation à 112 ×g pendant cinq minutes.Après cinq minutes, resuspendre le culot cellulaire dans un millimètre de SHEM. Ensuite, dénombrer les cellules à l’aide d’un hémacytomètre. Puis, ensemencer les cellules sur des lamelles dans une plaque de 24 puits et cultiver les cellules dans du SHEM.Pour étudier l'effet inhibiteur de la Maramastat sur l'ENMT, incuber les cellules dans du milieu SHEM contenant 10 micromolaire de Maramastat et renouveler le milieu de culture tous les trois jours. Ensuite, fixer les cellules à un moment indiqué avec 250 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante. Par la suite, les permeabiliser avec 250 microlitres de Triton X-100 à 0,5 % pendant cinq minutes.Et les bloquer avec 10 % de BSA pendant 30 minutes. Incuber ensuite les cellules avec des anticorps primaires dirigés contre ABC, snail et slug toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 minutes à chaque fois.Et les incuber avec l'anticorps secondaire conjugué à l’Alexa Fluor à température ambiante pendant une heure. Ensuite, contre-colorer le noyau cellulaire en recouvrant les cellules de DAPI à deux microgrammes par millilitre. Laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 minutes à chaque fois.Et montez-les avec une solution de montage anti-décoloration avant d'obtenir les images d'immunofluorescence. Après avoir anesthésié un rat mâle SD âgé de 12 semaines, pincez doucement la peau de l'animal pour confirmer une anesthésie adéquate en l'absence de réflexe de contraction cutanée. Ensuite, appliquez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % sur l'œil droit du rat afin de minimiser la douleur et le réflexe de clignement.Ensuite, appliquer une pommade à la tétracycline sur l'œil gauche afin de prévenir la sécheresse cornéenne. Puis, refroidir une sonde en acier inoxydable dans de l'azote liquide. Appliquer la sonde en acier inoxydable sur la cornée centrale de l'œil droit pendant 30 secondes.Instiller fréquemment du PBS dans l’œil droit pendant la procédure afin d’éviter le dessèchement cornéen, et appliquer 0,1 % d’atropine et 0,3 % de sulfate de gentamicine immédiatement après la cryolésion, une fois par jour, pour soulager la douleur oculaire résultant d’un spasme ciliaire et prévenir toute infection. Après la procédure, maintenir le rat au chaud à l’aide d’une lampe chauffante et observer sa récupération jusqu’à ce qu’il retrouve le contrôle moteur. Appliquer une pommade à la tétracycline sur l’œil droit pour éviter le dessèchement cornéen pendant la période de récupération, et répéter la procédure de cryolésion cornéenne pendant trois jours consécutifs.Pour administrer du Maramastat ou du FGF basique dans la chambre antérieure des yeux de rat, appliquer une goutte de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % sur l’œil droit du rat anesthésié afin de minimiser la douleur et le réflexe palpébral. Ensuite, rincer la surface oculaire avec du PBS stérile. Sous un microscope opératoire, réaliser une paracentèse de la chambre antérieure en insérant une aiguille de calibre 30 reliée à une seringue d’un millilitre dans la cornée claire paralimbale, selon un plan situé au-dessus et parallèle à l’iris. Puis, orienter la pente de l’aiguille vers le haut et appuyer légèrement sur la plaie cornéenne pour drainer une partie de l’humeur aqueuse et réduire la pression intraoculaire.Injecter 0,02 millilitre du médicament par voie intracamérulaire et comprimer doucement le trajet de l'aiguille avec un coton-tige pendant le retrait de l'aiguille. Cette figure présente les images en contraste de phase des CEC bovins et des cultures. La forme hexagonale des cellules au confluent indique que les cellules ne sont pas contaminées par des fibroblastes du stroma cornéen lors de l'isolement cellulaire.Au cours de la culture in vitro de CEC bovins, la translocation nucléaire de ABC, de snail et de slug a été détectée jusqu'au jour 14. Cette figure illustre l'effet du Maramastat, un inhibiteur large spectre des MMP, sur le processus d'ENMT des CEC bovins cultivés in vitro. Voici des photographies oculaires externes de rats après une lésion cryogénique, suivie d'une injection intracamérulaire.Les photographies montrent une diminution de l'œdème cornéen après l'injection de FGF basique. Alors que la Maramastat réduit davantage l'œdème cornéen par rapport au FGF basique seul. Cette figure présente une immunomarquage du bouton cornéen de rat à l'aide d'un anticorps dirigé contre ABC, après une lésion par congélation suivie d'une injection intracamérulaire.La translocation nucléaire de ABC est observée dans le groupe PBS et est significativement augmentée dans le groupe FGF basique, indiquant une activation de la voie de signalisation Wnt/Bêta-caténine et du processus ENMT. Après une injection intracamérulaire de FGF basique suivie de Maramastat, la coloration nucléaire de ABC est réduite, suggérant l'effet inhibiteur de Maramastat sur l'ENMT. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la transition endothéliale-mésenchymateuse cornéenne, in vitro et in vivo.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les cellules endothéliales cornéennes bovines et réaliser une cryolésion cornéenne ainsi qu'une injection intracamérulaire.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Découvrez la transition endothéliale-mésenchymateuse cornéenne in vitro et in vivo à l'aide de cultures de cellules endothéliales bovines et d'un modèle de cryolésion chez le rat. Cette méthode aide les chercheurs à étudier la régénération cornéenne et à identifier des cibles thérapeutiques.

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

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