Name: Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour lingénierie tissulaire du foie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Apprenez à fabriquer des échafaudages inversés de cristaux colloïdaux en PEG pour l'ingénierie tissulaire hépatique. Cette méthode 3D permet aux cellules du foie de maintenir leurs fonctions plus longtemps, améliorant ainsi les tests de médicaments.

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Les auteurs tiennent à remercier le soutien d&#39;une recherche nationale Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) et le Programme de recherche concurrentiel (NRF-CRP10-2012-07).

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

Échafauds d&#39;ingénierie tissulaire évoluent rapidement pour fournir tous les indices physiques et biochimiques nécessaires pour régénérer, maintenir ou réparer les tissus pour l&#39;application de remplacement d&#39;organes, d&#39; étudier la maladie, le développement de médicaments, et beaucoup d&#39; autres 57. Dans le foie ingénierie tissulaire, les hépatocytes humains primaires perdent rapidement leurs fonctions métaboliques, une fois isolés du corps, créant ainsi un grand besoin d&#39;échafaudages d&#...

Le foie est un organe hautement vascularisé avec une multitude de fonctions, y compris la désintoxication du sang, le métabolisme des xénobiotiques et la production de protéines sériques. Le tissu hépatique a trois dimensions (3D), la microstructure complexe, comprenant plusieurs types cellulaires, les canalicules biliaires, sinusoïdes, et des zones de composition différente biomatrice et différentes concentrations en oxygène. Compte tenu de cette structure complexe, il a été difficile de créer un modèle correct du foie in vitro 1. Cependant, il y a une demande croissante de fonctionnement des modèles in vitro d&#39; hébergement hépatocytes humains comme plates - formes pour les tests de toxicité médicamenteuse 2 et l&#39; étude des maladies associées au foie 3. Plates - formes d&#39;ingénierie tissulaire du foie actuel ont simplifié la complexité du foie en isolant l&#39; une, ou en se concentrant sur ​​un petit nombre, des paramètres du foie, à savoir la co-culture de cellules 4, la composition biochimique du zonal microenvironnements 5, la dynamique d&#39;écoulement 6,7 et la configuration de la biomatrice 8. La configuration de la biomatrice peut être décomposée en des paramètres tels que les matériaux d&#39;échafaudage, la composition de la matrice extracellulaire (ECM), la raideur des protéines de la matrice, ainsi que la conception et la structure de l&#39;échafaudage. Il y a eu une augmentation dans les études d&#39;ingénierie tissulaire en utilisant des hydrogels synthétiques, en particulier le poly (éthylène glycol) (PEG) hydrogels 9, compte tenu de la capacité d&#39;accorder des propriétés, la bioactivité et de vitesse de dégradation mécanique de l&#39;hydrogel. En ce qui concerne la recherche liée au foie, l&#39;hydrogel biocompatible a été appliquée pour l&#39; étude de l&#39; infection par le virus de la maladie du foie 3. En tant que plate - forme de conception de hépatocytes, de nombreuses études ont utilisé hépatocytes cultures sandwich 10,11 et l&#39; encapsulation des cellules dans un hydrogel 12,13 pour fournir l&#39;environnement 3D et cellule-ECM et l&#39; interaction cellule-cellule qui sont essentiels pour imiter en microenvironnement vivo. However, ces plates - formes ne possèdent pas un degré élevé de contrôle et de l&#39; organisation spatiale, conduisant à des propriétés non uniformes à travers l&#39;échafaudage 14. Le colloïdal de cristal inversée (ICC) 14 échafaudage est un échafaudage 3D hautement organisée pour la culture cellulaire qui a été introduit dans les années 2000. La structure unique de L&#39;échafaudage peut être attribué au procédé de fabrication simple à l&#39;aide d&#39;un cristal colloïdal, un réseau ordonné de particules colloïdales de diamètre variable. En bref, pour résumer le processus, les particules sont bien rangés et recuites utilisant la chaleur pour former un réseau. La lixiviation de ce réseau, par un solvant organique, on obtient un hydrogel polymérisé dans des cavités sphériques hexagones emballés 15 avec une surface spécifique élevée. Cet échafaudage hautement ordonnée a été préalablement réalisé avec les deux matériaux synthétiques et naturels, y compris , mais sans s&#39;y limiter , le poly (acrylamide) 16-21, le poly (lactique-co-acide glycolique) 15,22-30, Le poly (éthylène glycol) 31,32, le poly (2-hydroxyéthylméthacrylate) 21,33-35, 36-39 et le chitosan. CPI échafauds constituées de matériaux non-salissures ont tendance à favoriser sphéroïdes cellulaires dans les cavités 14,23,40. Plusieurs types de cellules ont été représentés avec succès à proliférer, se différencier et de fonction dans cette configuration, y compris les 41 chondrocytes, les cellules stromales de la moelle osseuse 42, et les cellules souches 43,44. En ce qui concerne les hépatocytes, des études ont été menées avec des échafaudages de la CPI en Na 2 SiO 3 et de poly (acrylamide), mais pas de PEG. Avec des stratégies simples de bioconjugaison (c. -à- couplage amine par EDC / NHS), échafauds à base de PEG ECM protéines conjuguées peuvent être fabriquées, qui peuvent se révéler des sites de liaison plus de cellules pour être un plus in vivo comme l&#39; environnement et d&#39; améliorer la fonction hépatique. Dans ce manuscrit et la vidéo associée, nous détaillons la fabrication de l&#39;échafaudage de la CPIen utilisant le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA) et un réseau d&#39;hydrogel de polystyrène microsphère, optimisé pour une hépatocarcinome (Huh-7.5) la culture. Nous démontrons les différences entre les nues échafauds ICC PEGDA généralement non collantes et le PEGDA ICC échafaudage de collagène revêtu en termes d&#39;échafaudage topologie et la performance des cellules. La viabilité cellulaire et la fonction sont mesurés qualitativement et quantitativement pour évaluer Huh-7,5 comportement cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Tube PCR de 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>Colle</td></tr><tr><td>Gorilla Glue</td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Dépend du fournisseur. Il a été acheté dans un magasin local.</td><td></td></tr><tr><td>Diapositives en verre</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensions : 24&fois ; 60 mm2</td></tr><tr><td>sphères en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diamètre = 140 &micro ; m; 3x104 particules par millilitre et distribution granulométrique de 1,4 %</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>absolu pour l’analyse EMSURE ; Diluer à 70 % avec de l’eau Milli-Q</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Four d’équipement</td></tr><tr><td></td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>200 &micro ; l pointe de pipette</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à bascule</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa ; l’acrylation des monomères PEG et la purification du précipité résultant produisent un macromère PEGDA avec Mw = 4,6&nbsp ; Centrifugeuse kDa</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>équipement</td></tr><tr><td>Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hydroxy-4'-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Film de paraffine</td><td>Parafilm M&nbsp ;</td><td>#PM996</td><td>Maintenu à 9" avec une intensité de 10,84 po mW/cm2</td></tr><tr><td>Projecteur UV Bluewave 200</td><td>Blaze Technology&nbsp ;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>De rat. 1x, sans CaCl2 & MgCl2 ; pH = 7,2</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16 % p/v aq. 10 x 10&nbsp ; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 lyophilisateur</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires anti-souris contre le collagène de type I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris conjugué à Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Plaque, culture tissulaire 24 puits, fond plat (Nunclon)&nbsp ;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 2,5 g/L Glucose avec L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîtes de culture non traitées Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Équipement ; 37 &deg ; C, 5 % d’humidité</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubateurs</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité pour cellules de mammifères</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Assay</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Réactif à sel monosodique (MSR)</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques Infinite 200 PRO&nbsp ;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin Human ELISA kit</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires anti-souris (contre le CYP3A4, l’albumine)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850 ; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 marqué Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC eau</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrophotomètre 2000c</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcription inverse Supermix&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select Master Mix pour CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Amorces (à choisir)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système en temps réel CFX96, Thermocycleur tactile C-1000</td> Bio <td>Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication de inverted colloïdal cristal poly (éthylène glycol) Échafaudages: une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l&#39;ingénierie tissulaire du foie

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

La possibilité de maintenir la fonction des hépatocytes in vitro, dans le but de tester la cytotoxicité des xénobiotiques, l&#39; étude de l&#39; infection virale et le développement de médicaments ciblant le foie, nécessite une plate - forme dans laquelle les cellules reçoivent des signaux biochimiques et mécaniques appropriées. systèmes d&#39;ingénierie tissulaire du foie récents ont utilisé trois dimensions (3D) échafauds composés de hydrogels synthétiques ou naturelles, compte tenu de leur rétention d&#39;eau élevée et leur capacité à fournir les stimuli mécaniques nécessaires par les cellules. Il y a eu un intérêt croissant dans le cristal colloïdal (CPI) échafaudage inversé, un développement récent, qui permet à l&#39;organisation spatiale élevée, homotypique et l&#39;interaction des cellules hétérotypique, ainsi que la matrice (ECM) interaction cellulaire extracellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la fabrication de l&#39;échafaudage ICC à l&#39;aide de poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA), et le procédé de lixiviation des particules. En bref, un treillis est composé de particules microsphériques, après quoi un pré-polymela solution r est ajoutée proprement polymérisé et les particules sont ensuite éliminés, ou lessivés, à l&#39; aide d&#39; un solvant organique (par exemple le tétrahydrofuranne). La dissolution des résultats du réseau dans un échafaudage très poreuse avec des tailles et des interconnectivités qui permettent aux médias d&#39;atteindre plus facilement les cellules interstitielles contrôlées. Cette structure unique permet une grande surface spécifique pour les cellules à adhérer à ainsi que la communication facile entre les pores, et la capacité de revêtir la CPI échafaudage PEGDA avec des protéines montre également un effet marqué sur la performance des cellules. Nous analysons la morphologie de l&#39;échafaudage ainsi que la cellule d&#39;hépatocarcinome (Huh-7.5) le comportement en termes de viabilité et de la fonction pour explorer l&#39;effet de la structure de la CPI et les revêtements ECM. Dans l&#39;ensemble, ce document fournit un protocole détaillé d&#39;un échafaudage émergent qui a de larges applications dans l&#39;ingénierie tissulaire, en particulier le foie ingénierie tissulaire.

Les résultats représentatifs pour la caractérisation structurale de l&#39;échafaudage de la CPI et la comparaison de l&#39;efficacité de chaque CPI échafaudage condition dans la culture des hépatocytes sont présentés et expliqués ci-dessous. Les conditions CPI d&#39;échafaudage utilisés dans ces résultats sont enduits de collagène de 0 pg / ml (nu), 20 pg / ml (collagène 20), 200 ug / ml (collagène 200), et 400 ug / ml (collagène 400) et le premier huh-7,5 cellulaire nombre de semis est ...

Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour la fabrication d’une plate-forme émergente de culture d’hépatocytes tridimensionnels, l’échafaudage à cristaux colloïdaux inversés et les techniques concomitantes pour évaluer le comportement des hépatocytes. Les pores contrôlables en taille contrôlée, l’interconnectivité et la capacité à conjuguer les protéines de la matrice extracellulaire à l’échafaudage du poly(éthylène glycol) (PEG) améliorent les performances des cellules Huh-7.5.

Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l&#39;ingénierie tissulaire du foie

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

L'objectif général de cette procédure est de fabriquer des échafaudages en cristal colloïdal inversé à base de PEG, comportant une matrice extracellulaire codée pour des applications en ingénierie tissulaire hépatique. L'ingénierie tissulaire hépatique constitue un domaine prometteur dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative. Nous créons des échafaudages tridimensionnels qui permettent aux cellules hépatiques de conserver leurs fonctions pendant une longue période.Les implications de cette technique s'étendent au test de médicaments, car les cellules hépatiques cultivées avec ce système peuvent conserver leur fonction plus longtemps et présenter une meilleure réponse au médicament. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'ingénierie tissulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme ceux utilisant des cellules souches. La procédure sera démontrée par Hitomi, une étudiante diplômée de mon laboratoire.Pour préparer les moules à microbilles, coupez d'abord les embouts de tubes microcentrifuges résistants à l'ébullition de 0,2 millilitre au niveau de 40 microlitres. Utilisez une colle imperméable pour fixer les

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