Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l'ingénierie tissulaire du foie

L'objectif général de cette procédure est de fabriquer des échafaudages en cristal colloïdal inversé à base de PEG, comportant une matrice extracellulaire codée pour des applications en ingénierie tissulaire hépatique. L'ingénierie tissulaire hépatique constitue un domaine prometteur dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative. Nous créons des échafaudages tridimensionnels qui permettent aux cellules hépatiques de conserver leurs fonctions pendant une longue période.

Les implications de cette technique s'étendent au test de médicaments, car les cellules hépatiques cultivées avec ce système peuvent conserver leur fonction plus longtemps et présenter une meilleure réponse au médicament. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'ingénierie tissulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme ceux utilisant des cellules souches. La procédure sera démontrée par Hitomi, une étudiante diplômée de mon laboratoire.

Pour préparer les moules à microbilles, coupez d'abord les embouts de tubes microcentrifuges résistants à l'ébullition de 0,2 millilitre au niveau de 40 microlitres. Utilisez une colle imperméable pour fixer les extrémités supérieures des tubes coupés sur des lamelles de microscope en verre, puis appliquez de la colle autour des moules. Ensuite, remplacez l'eau dans un flacon de microsphères de polystyrène par de l'éthanol à 70 %.

Placer la solution de sphères dans un bain ultrasonique et soniquer le mélange à 30 watts pendant trois minutes afin de détacher les sphères agrégées. Une fois les microsphères préparées, prélever 100 microlitres d'éthanol à l'aide d'une pipette et les ajouter dans chacun des moules. Ensuite, couper quatre millimètres au sommet d'une pointe de pipette de 200 microlitres et l'utiliser pour transférer 25 microlitres de microsphères de polystyrène dans le moule, deux fois.

Placer les moules sur un agitateur rotatif et régler celui-ci à 120 tr/min. Laisser les échantillons sur l'agitateur toute la nuit. Le lendemain, placer les moules sous un microscope et vérifier que les sphères sont disposées de manière hexagonale.

Laisser l'éthanol s'évaporer à température ambiante pendant deux nuits. À ce stade, placer soigneusement le complexe moule-billes dans un four à 130 degrés Celsius pendant six heures afin de recuire les billes de polystyrène et former la négative de l'échafaudage 3D. Tout d'abord, synthétiser les macromères de diacrylate de polyéthylène glycol en utilisant des protocoles établis, comme décrit dans ces deux références.

Ensuite, préparez une solution à 50 % de PEGDA dans de l'eau déionisée et centrifugez le mélange jusqu'à dissolution complète. Pour les échafaudages conjugués à la matrice extracellulaire, ajoutez un supplément de 10 % d'huile de krill PEG NHS à la solution de PEGDA à 50 %. Préparez ensuite une solution mère à 20 % de l'initiateur photochimique dans de l'éthanol à 70 %.

Ajouter 50 microlitres de la solution d'initiateur photochimique par millilitre du mélange PEGDA. Ensuite, vortexer le mélange pendant une minute. Puis, retirer délicatement les moules des lames de verre, extraire les réseaux avec précaution à l’aide d’une spatule et les placer dans des tubes de centrifugation séparés de 1,5 millilitre.

Introduisez 300 microlitres de la solution de PEGDA dans chaque tube, puis centrifugez les tubes pour permettre à la solution de PEGDA de pénétrer dans le réseau de polystyrène. Ensuite, retirez le réseau du tube à l’aide de pinces et essuyez soigneusement l’excès de solution de PEGDA à la surface. Placez le réseau sur un film de paraffine recouvrant un verre, avec la surface plane et circulaire orientée vers le haut.

Ensuite, exposer l'échafaudage à une lumière ultraviolette de 365 nanomètres pendant cinq minutes à l'aide d'une lampe UV ponctuelle. Placer environ dix réseaux cristallins polymérisés au PEGDA dans un nouveau flacon et ajouter 20 millilitres de THF. Agiter les flacons sur un agitateur orbital à 300 tr/min pendant six heures.

Retirez le flacon toutes les une à deux heures et remplacez le solvant contenant le polymère par du THF frais. Après le dernier rinçage, ajoutez de l'eau à la solution de THF utilisée pour vérifier si les sphères de PS se sont complètement dissoutes. Si la solution est blanche, effectuez des rinçages supplémentaires jusqu'à ce que la solution devienne transparente.

Pour stériliser les supports, préparez un tube de microcentrifugeuse de 50 millilitres contenant deux millilitres d'éthanol à 70 % par support et placez les supports dans le tube à l’aide d’une spatule. Laissez les supports tremper dans l’éthanol pendant une heure. Après une heure, versez soigneusement l’éthanol et remplacez-le par un volume équivalent de PBS stérile.

Ensuite, centrifuger les échafaudages pour éliminer toutes les bulles. Conserver les échafaudages centrifugés à quatre degrés Celsius et les sortir toutes les une à deux heures pour remplacer la solution par du PBS frais. Après plusieurs changements de PBS, retirer les échafaudages à recouvrir de collagène et les placer dans un tube contenant un millilitre de collagène de type un par échafaudage à recouvrir.

Ensuite, centrifuger le tube comme précédemment, puis agiter les supports à 400 tr/min sur un agitateur orbital pendant 30 minutes. Conserver les supports toute la nuit à quatre degrés Celsius. Cultiver les cellules d'hépatocarcinome dans des boîtes de culture cellulaire de 100 millimètres avec 10 millilitres de milieu de culture.

Changer le milieu tous les trois jours jusqu'à ce que la densité cellulaire atteigne 75 à 80 % de la surface de culture. Lorsque les cellules sont prêtes, placer soigneusement les échafaudages avec la surface plane vers le haut dans une plaque de 24 puits. Ensuite, rincer chaque échafaudage avec deux millilitres de PBS.

Aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance sur les échafaudages. Après 30 minutes, retirez le milieu et laissez sécher l'échafaudage pendant une heure. Ensuite, récoltez les cellules d'hépatocarcinome par la méthode de digestion à la trypsine.

Après avoir centrifugé les cellules, retirez le surnageant et resuspendez le culot de manière à obtenir un million de cellules par 25 microlitres. Pipetez lentement 25 microlitres de la suspension cellulaire directement au-dessus de chaque échafaudage. Ensuite, couvrez la plaque et placez-la au incubateur pendant la nuit.

Ensuite, transférez délicatement les échafaudages dans une nouvelle plaque de 24 puits et ajoutez deux millilitres de milieu dans chaque puits avant de replacer la plaque dans l'incubateur. Une image au microscope électronique à balayage de l'échafaudage est présentée ici. Il est constitué d'un arrangement hexagonal compact de pores dont le diamètre moyen varie entre 100 et 105 micromètres, formant des interconnexions avec les pores voisins dont le diamètre se situe principalement entre 35 et 40 micromètres.

Lorsqu'elles sont ensemencées avec des cellules d'hépatocarcinome, les cellules se développent et prolifèrent sur les supports prérecouverts de collagène de type I, mais ne s'étendent pas en nombre sur les supports nus. De plus, les cellules d'hépatocarcinome sur les supports revêtus de collagène ont montré une fonction cellulaire accrue de manière dépendante de la concentration. Au jour 14, les cellules d'hépatocarcinome cultivées sur les supports ICC revêtus à 400 microgrammes par millilitre ont sécrété plus de trois fois la quantité d'albumine par rapport à celles cultivées sur le support nu.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce que les sphères de polystyrène dans le réseau soient correctement disposées. Un mauvais agencement entraînera une faible interconnexion, ce qui peut nuire à l'activité cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des échafaudages en cristal colloïdal inversé à base de PEG ciliés avec un revêtement.

N'oubliez pas que le travail avec le tétrahydrofuranne peut être dangereux et que des précautions, telles que de travailler sous hotte chimique et de porter des gants et des lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.