Fluorescent modèle de souris orthotopique de cancer du pancréas

L’objectif global de cette procédure est de développer un modèle orthotopique murin de cancer du pancréas fluorescent qui peut être surveillé de manière non invasive chez un animal vivant. Ce modèle permet une étude non invasive des effets d’un médicament d’intérêt spécifique sur une tumeur primaire et ses métastases chez un animal vivant. Le principal avantage de cette technique est que les effets des traitements peuvent être facilement observés in situ.

Commencez par décongeler une aliquote de Matrigel à haute concentration selon les instructions du fabricant. Ensuite, lavez chaque flacon de cellules avec cinq millilitres de DPBS et récoltez les cultures avec de la trypsine. Après avoir ajouté le milieu RPMI, transférez les suspensions cellulaires résultantes dans des tubes de 15 millilitres et faites tourner les cellules.

À la fin de la centrifugation, transférez les cellules dans une armoire de biosécurité et remettez les granulés en suspension dans 10 millilitres de DPBS frais avec un pipetage doux. Après le comptage, centrifugez à nouveau les cellules et diluez les suspensions cellulaires à une concentration de trois fois 10 à six cellules par 50 microlitres de milieu glacé et sans sérum et de Matrigel, une membrane à matrice basale à haute concentration. Ensuite, faites tourbillonner doucement les échantillons et placez-les sur de la glace.

Pour implanter les cellules, appliquez d’abord une pommade sur les yeux d’une souris anesthésiée et placez l’animal sur un coussin chauffant recouvert d’un rideau stérile. Ensuite, désinfectez délicatement le flanc de l’animal avec trois gommages à l’iode, suivis de trois rinçages à 70 % d’éthanol. Après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement des orteils, chargez environ 200 microlitres des cellules préparées dans une seringue antituberculeuse prérefroidie d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 18.

Remplacez l’aiguille de calibre 18 par une aiguille de calibre 27 et remettez les cellules sur de la glace. Ensuite, localisez la zone générale de la rate dans le quadrant supérieur gauche de l’abdomen. À l’aide d’une pince, pincez la peau au-dessus de la rate et faites une incision d’environ un centimètre pour créer une poche.

Ensuite, pincez le muscle lisse au-dessus de la rate et coupez le tissu pour accéder à la cavité péritonéale. Ensuite, saisissez doucement l’extrémité caudale de la rate et retirez-la de la cavité corporelle. À l’aide d’un coton-tige humide et stérile, étalez le pancréas attaché à l’extrémité de la rate pour localiser la queue pancréatique.

Administrez 50 microlitres de cellules dans la queue pancréatique, puis faites pivoter lentement l’aiguille hors du pancréas. Une implantation réussie ressemblera à une bulle superficielle sans aucune fuite. Remettez les organes dans la cavité péritonéale et enfermez le tout avec le muscle et la peau.

Ensuite, utilisez une suture 6-0 pour fermer l’incision. Ensuite, injectez du kétoprofène aux animaux et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis. Au moment expérimental approprié, utilisez un système d’imagerie commercial pour petits animaux pour imager la croissance tumorale chez l’animal vivant sous anesthésie et sélectionner les filtres d’excitation et d’émission appropriés.

Ensuite, obtenez une première image en utilisant uniquement la lumière blanche. En gardant l’animal dans la même position, passez aux filtres GFP et acquérez une deuxième image. Pour analyser la croissance tumorale, superposez les images blanches et fluorescentes pour évaluer la zone fluorescente et l’intensité des cellules tumorales.

La détection d’un signal fluorescent vert entre deux et trois semaines après l’implantation fournit un repère visuel pour confirmer la présence d’une tumeur cancéreuse du pancréas en développement, car les animaux qui ne développent pas de tumeurs ne présentent pas de signal GFP. De plus, cette méthode permet une surveillance non invasive de la progression de la croissance tumorale, avec une augmentation du signal GFP observée au fil du temps à mesure que la taille de la tumeur augmente. La métastase de la tumeur à des organes spécifiques peut être confirmée lors du retrait des tissus d’intérêt pour une imagerie fluorescente ex vivo ultérieure.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit minutes et peut être utilisée pour étudier les effets de différents agents chimiothérapeutiques sur le cancer du pancréas et ses métastases. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder le Matrigel dans de la glace, sinon le gel sera difficile à injecter. De plus, il est important de ne pas oublier d’utiliser des techniques aseptiques et de surveiller tous les niveaux d’anesthésie à tout moment.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un modèle orthotopique du cancer du pancréas chez la souris. N’oubliez pas que travailler avec des lignées cellulaires cancéreuses humaines peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection et l’élimination appropriée des déchets biologiques doivent être prises à tout moment.