Haut-débit Gene Tagging dans

L'objectif général de cette méthode est de marquer des protéines chez Trypansoma brucei de manière haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des kinétoplastides concernant la localisation et la fonction potentielle de grands ensembles de protéines. Le principal avantage de cette technique est que de nombreux protéines peuvent être marquées rapidement et facilement en parallèle.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la localisation, les interactions de vastes cohortes de protéines peuvent également être étudiées à l'aide d'autres marqueurs. Par exemple, le marqueur BirA pour une expérience de cartographie de proximité par bio-ID. La procédure sera démontrée par Ross Madden, un assistant de recherche de notre laboratoire.

Avant de commencer cette procédure, précongelez un bloc refroidisseur pour plaque PCR 96 puits dans l’enceinte à moins 80 degrés Celsius. Préparez le mélange maître A en combinant les éléments suivants dans un tube de 10 millilitres : 2, 100 microlitres d’eau distillée désionisée, 105 microlitres de DMSO de qualité PCR, 105 microlitres de dNTPs à 10 millimolaire et 105 microlitres de matrice pPOT.

Verser le mélange maître A dans un réservoir de réactif et aliquoter 23 microlitres du mélange maître A dans chaque puits d'une plaque PCR de 96 puits. À l'aide d'une pipette multipipette 12 canaux de P20, ajouter deux microlitres de primers groupés à 100 micromolaire dans chaque puits chargé. Sceller la plaque avec un film.

Placez-le sur le refroidisseur PCR préalablement refroidi et laissez-le geler pendant au moins 20 minutes à moins 80 degrés Celsius. La congélation du mélange maître PCR A est essentielle pour garantir une réaction de démarrage à chaud efficace, même lorsqu'une polymérase spécifique pour le démarrage à chaud est utilisée. Cela permet une amplification reproductible et à haut rendement.

Pendant que la plaque PCR est dans le congélateur, préparez le mélange maître B. Mélangez les composants suivants dans un tube de 10 millilitres : 2 048 microlitres d'eau distillée désionisée, 525 microlitres de tampon 10X et 52,5 microlitres de polymérase, pour un volume total de 2 626 microlitres par plaque. Retirez la plaque PCR et le refroidisseur PCR du congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Avec la plaque encore sur le bloc réfrigérant pour PCR, ajouter rapidement 25 microlitres du mélange maître B par-dessus le mélange maître A congelé dans chaque puits, pour un volume réactionnel total de 50 microlitres. Cette étape est critique dans le temps et doit être terminée avant que le mélange maître A ne commence à dégeler. Sceller la plaque avec un film adhésif.

Configurer le thermocycleur comme suit : 94 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis 30 cycles de 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, 65 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant deux minutes, suivis d'une période finale d'extension à 72 degrés Celsius pendant sept minutes. Une fois que le bloc a atteint 94 degrés Celsius, charger la plaque de PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme d'amplification.

Commencez cette procédure en préparant un grand gel d'agarose à 1 % dans un tampon de migration Tris-acétate EDTA ou TAE, avec quatre rangées de puits. Chargez un échelle d'ADN de 1 kb dans le premier et le 28e puits de chaque rangée. L'étape suivante consiste à transférer deux microlitres de produit PCR directement, sans tampon de charge d'ADN, dans chaque piste du gel, selon le schéma indiqué ici.

Par exemple, les produits de PCR des lignes A et B de la plaque de PCR sont chargés respectivement dans les sillons impairs et pairs de la première rangée du gel. En travaillant rapidement afin de réduire le risque de contamination des amplicons, chargez les produits de PCR de la ligne A de la plaque de PCR dans les sillons impairs de la première rangée du gel. Ensuite, chargez les produits de PCR de la ligne B de la plaque de PCR dans les sillons pairs de la première rangée du gel.

Chargez les produits de PCR des rangées C et D de la plaque de PCR en utilisant ce même schéma, en plaçant la rangée C dans les sillons impairs et la rangée D dans les sillons pairs de la deuxième rangée du gel. Poursuivez ce schéma de chargement jusqu'à ce que chaque puits de la plaque de PCR soit chargé sur le gel. Placez le gel dans la cuve électrophorétique et remplissez la cuve avec du tampon de migration TAE jusqu'à ce que le gel soit recouvert.

Faites migrer à 100 volts pendant 30 minutes. Visualisez à l’aide d’un transilluminateur UV. On voit ici un gel d’agarose représentatif de validation PCR en plaque de 96 puits, où 95 des 96 PCR ont été concluantes.

La PCR infructueuse était H11. Cette procédure utilise la lignée cellulaire SMOXP9 de Trypansoma brucei, forme procyclique. Faire croître les cellules jusqu'à la densité appropriée comme décrit dans le texte du protocole et récolter le nombre requis de cellules par centrifugation à 800 fois G pendant 10 minutes.

Commencez à préparer l'électroporation pendant que les cellules sont centrifugées. Connectez le manipulateur de plaques à l'électroporateur. Sur l'appareil d'électroporation, réglez la tension à 1 500 volts, la durée de l'impulsion à 100 microsecondes, le nombre d'impulsions à 12 et l'intervalle entre les impulsions à 500 millisecondes.

Sur le manipulateur de plaques, régler le nombre d'impulsions à un. À l'aide d'une pipette multicanal de 12 canaux P200, transférer les réactions de PCR de la plaque de PCR vers une plaque jetable d'électroporation à 96 puits. Laver les cellules dans 10 millilitres de cytomix modifié et centrifuger à nouveau à 800 × g pendant 10 minutes.

Ressuspendre les cellules dans 23 millilitres de cytomix modifié pour obtenir une concentration finale de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif. Prélever 200 microlitres de la solution cellulaire et les introduire dans chaque puits de la plaque d'électroporation, puis mélanger avec le produit PCR par pipetage.

Utilisez un tissu pour éliminer toute goutte présente sur le dessus de la plaque afin d'éviter les courts-circuits. Appliquez un film scellé sur la partie supérieure de la plaque d'électroporation, en le positionnant de manière à laisser les trous destinés aux électrodes découverts en haut et en bas de chaque colonne. Évitez de couvrir les points surélevés utilisés pour guider le film.

Placer la plaque d'électroporation dans le support de plaque et fermer le couvercle. Appuyer sur impulsion sur l'appareil d'électroporation. Après l'électroporation, les cellules doivent être transférées rapidement vers quatre plaques de culture tissulaire de 24 puits contenant chacun un millilitre de milieu SDM-79 par puits pour la récupération.

Utilisez une pipette multipipette 12 canaux P200 en laissant un embout sur deux manquant, de sorte que les six embouts restants s'alignent avec les six rangées d'une plaque de culture tissulaire 24 puits. Après le transfert des cellules de la plaque 96 puits vers la plaque 24 puits, lavez les puits de la plaque 96 puits avec le milieu provenant des puits correspondants de la plaque 24 puits. Ensuite, transférez le lavage vers les puits de la plaque 24 puits.

Transférez les cellules électroporées de la plaque d'électroporation 96 puits vers les plaques de culture tissulaire 24 puits selon le schéma prédéfini indiqué ici. Par exemple, les cellules provenant des puits impairs de la rangée A de la plaque 96 puits sont transférées vers la rangée A de la plaque A, tandis que les cellules provenant des puits pairs de la rangée A de la plaque 96 puits sont transférées vers la rangée A de la plaque C. Après chaque transfert des cellules de la plaque 96 puits vers la plaque 24 puits, lavez les puits de la plaque 96 puits avec le milieu provenant de la rangée correspondante de la plaque 24 puits. Ensuite, transférez le lavage à nouveau dans la plaque 24 puits.

Le transfert des cellules dans les plaques 24 puits est déroutant, mais vous devez pouvoir associer les lignées cellulaires obtenues à l'identifiant génétique correct. Il est essentiel d'effectuer cette étape rapidement afin de maintenir les cellules en bon état de santé. Une fois que toutes les cellules électroporées ont été transférées dans les quatre plaques 24 puits, placez ces plaques dans une boîte en plastique propre munie d'un couvercle hermétique. Placez ensuite la boîte dans une étuve à 28 degrés Celsius.

Entre six et huit heures plus tard, ajouter dans chaque puits un millilitre de SDM-79 contenant 10 % de FCS et un antibiotique sélectif. Incuber à 28 degrés Celsius pendant neuf à dix jours, jusqu'à ce que des lignées cellulaires transgéniques deviennent visibles. Après une transfection dans une plaque de 96 puits destinée à marquer 96 protéines différentes à l'extrémité terminale, les cellules sont transférées dans des plaques de culture tissulaire de 24 puits pour récupération et sélection.

Chaque puits est ensuite évalué afin de déterminer s'il contient des cellules saines résistantes au médicament. Un puits sain contient principalement des cellules très actives qui apparaissent brillantes en microscopie de contraste de phase. Dans ce schéma exemple, le vert représente un puits présentant une transfection réussie, et le gris représente un puits ne contenant que des cellules mortes.

88 sur 96, soit 92 % des puits, contiennent des parasites transfectés avec succès après 15 jours de sélection. Une fois maîtrisée, l'opération prendra environ une heure, du comptage des cellules à leur mise en culture après électroporation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter les médicaments sélectifs six à huit heures après la transfection.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étiqueter de grands groupes de protéines dans Trypansoma brucei.