Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

L’objectif global de ce protocole est de démontrer la croissance des villosités des cellules intestinales humaines sous des mouvements et un écoulement semblables à ceux du péristaltisme dans un dispositif microfluidique d’intestin sur puce, ainsi que de montrer comment co-cultiver ces cellules avec du microbiome intestinal vivant. Ainsi, cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la gastro-entérologie, de la microbiologie clinique et des sciences pharmaceutiques pour identifier le mécanisme de la maladie et valider l’efficacité et la toxicité des nouveaux composés médicamenteux. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent établir in vitro l’écosystème post-microbiome viable et fonctionnel de l’intestin vivant humain à l’aide d’un système microphysiologique.

Les implications de cette technique peuvent s’étendre à des maladies telles que la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, car la co-culture stable des cellules hôtes avec le microbiome peut imiter les complexités de ces maladies. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions complexes entre le microbiome intestinal et le système immunitaire dans l’intestin, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes organiques où il existe des interactions entre les microbes de l’hôte, tels que la peau, votre tractus génital ou la cavité buccale. Pour commencer, préparez le dispositif microfluidique d’intestin sur puce comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Le dispositif se compose d’un polymère de silicium transparent perméable aux gaz contenant deux microcanaux parallèles, séparés par une membrane PDMS flexible et poreuse. De chaque côté des canaux se trouvent des chambres à vide, qui peuvent être utilisées pour appliquer une contrainte mécanique cyclique. Stérilisez l’appareil à l’aide d’une seringue d’un millilitre pour faire couler 70 % d’éthanol à travers les canaux.

Ensuite, séchez l’appareil dans un four sec à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, exposez le microsystème intestin-sur-puce, ainsi que son tube connecté, à la lumière UV et à l’ozone simultanément pendant 40 minutes. Refroidissez l’appareil tout en restant sous la lumière UV d’une enceinte de biosécurité pendant 15 minutes.

Ensuite, chargez 100 microlitres d’une solution de codage de matrice extracellulaire dans une seringue d’un millilitre et distribuez-la dans le microcanal supérieur de l’appareil. Répétez ce processus pour enrober également le microcanal inférieur. Placez l’ensemble dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 pendant une heure.

Pendant l’incubation, le dégazage pré-réchauffe l’ensemble du milieu de culture en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 micron dans un système de filtration de 50 millilitres pendant une minute. Tapotez doucement sur le milieu filtré pendant une minute pour éliminer les bulles ou les gaz dissous dans le milieu. Ensuite, transférez le milieu complet dégazé dans deux seringues jetables de trois millilitres et incubez les seringues pendant une heure.

Ensuite, connectez les seringues aux microcanaux supérieurs et inférieurs de l’intestin sur puce et lavez la solution de codage en faisant couler tout le milieu dans les microcanaux supérieur et inférieur avec une légère impulsion. Ensuite, à l’aide d’une pompe à seringue, faites couler le milieu de culture de cellules complètes dégazées dans le microcanal supérieur de l’appareil, tout en incubant la puce pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Récoltez une fiole T75 entièrement confluente contenant des cellules épithéliales intestinales Caco-2 en rinçant d’abord les cellules avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium.

Ensuite, aspirez le PBS et répétez le rinçage deux fois de plus. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez le ballon pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Une fois détaché, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture de cellules complètes préchauffé et pipetez la suspension cellulaire de haut en bas trois à cinq fois avant de la transférer dans un tube à centrifuger.

Faites tourner la suspension cellulaire. Ensuite, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension à 150 000 cellules par centimètre carré dans un milieu complet préchauffé. Prélevez 500 microlitres de suspension cellulaire dans une seringue jetable d’un millilitre, équipée d’une aiguille de calibre 25 et de 5/8 de pouce.

Ensuite, distribuez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans le microcanal supérieur à travers le tube de sortie. Ensuite, fixez toutes les entrées et sorties qui sont connectées aux microcanaux supérieur et inférieur à l’aide de pinces à liant. Incuber l’ensemble pendant une heure pour permettre aux cellules épithéliales intestinales d’adhérer à la surface de la membrane poreuse.

Ensuite, retirez les pinces et connectez le tube du canal supérieur à une seringue remplie de milieu de culture qui a été placée sur un pousse-seringue. Reprendre le flux du milieu de culture vers le microcanal supérieur à 30 microlitres par heure jusqu’à ce que les cellules soient d’une monocouche intacte. Une fois que les cellules forment une monocouche, connectez le canal inférieur à la deuxième seringue et perfuser le milieu de culture dans la lumière supérieure et les microcanaux capillaires inférieurs à la même vitesse de 30 microlitres par heure.

Pour créer un mouvement semblable à celui d’un péristaltisme dans la puce, allumez d’abord la pompe à vide. Connectez les chambres à vide de l’appareil au régulateur de vide via un tube avec un connecteur en acier inoxydable. Ensuite, réglez le contrôleur de manière à ce qu’il fournisse un mouvement d’étirement de signe cyclique correspondant à 10 % de la déformation cellulaire moyenne à une fréquence de 0,15 Hertz, puis cliquez sur Démarrer.

Maintenez l’écoulement du milieu de culture vers les microcanaux supérieurs et inférieurs en présence de déformations mécaniques pendant au moins 80 heures pour induire la croissance des villosités. Préparez un mélange 50/50 de bouillon de lactobacilles MRS autoclavé et de milieu clostridien renforcé. Ensuite, mettez en suspension un mélange bactérien probiotique lyophilisé dans 10 millilitres du mélange.

Mesurez la densité optique du mélange à 600 nanomètres et ajustez la densité finale des cellules à environ 0,2 unité de densité optique. Aliquote trois millilitres de la suspension de cellules microbiennes ajustées dans des tubes stériles jetables de 10 millilitres. Placez les aliquotes dans un récipient anaérobie et ajoutez deux paquets de sachets générateurs de gaz anaérobies dans le récipient.

Fermez hermétiquement le couvercle du récipient et incubez la configuration du récipient sans secouer dans un incubateur pendant la nuit. Ensuite, préparez un milieu de culture cellulaire dégazé sans antibiotique et chargez-le dans des seringues jetables de trois millilitres. Transférez le dispositif d’intestin sur puce contenant des villosités micro-modifiées dans l’enceinte de biosécurité.

Retirez les seringues qui sont connectées aux microcanaux supérieur et inférieur du dispositif et remplacez-les par des seringues contenant le milieu de culture cellulaire dégazé et exempt d’antibiotiques. Une fois terminé, remettez l’appareil dans l’incubateur à CO2. Ensuite, versez le milieu de culture sans antibiotique dans l’appareil pendant 12 heures avant d’asseoir le microbiome.

Ensuite, faites tourner le mélange de cellules bactériennes probiotiques pré-cultivées. Aspirez le surnageant, puis remettez les bactéries en suspension dans le DMEM sans antibiotique. Chargez environ 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille de calibre 25 et de 5/8 de pouce.

Infusez les bactéries dans la lumière du microcanal contenant les villosités intestinales auparavant exemptes de germes. Laissez les cellules microbiennes adhérer à la surface apicale des villosités intestinales pendant une heure et demie sans écoulement en clampant la tubulure. Ensuite, perfuser le milieu de culture préchauffé sans antibiotiques dans les microcanaux supérieurs et inférieurs à 40 microlitres par heure avec des déformations rythmiques cycliques.

Ce protocole de co-culture permet la colonisation stable de plusieurs espèces de bactéries probiotiques dans l’espace intervilleux. Les microcolonies bactériennes viables peuvent être maintenues jusqu’à deux semaines en co-culture. Voici une co-culture différente composée à la fois d’E. coli marqué à la GFP et de villosités intestinales.

Le grossissement puissant montre clairement l’emplacement des microcolonies bactériennes au bout de 72 heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’injecter doucement et lentement le milieu de culture dans les canaux microfluidiques pour éviter d’endommager la monocouche de cellules épithéliales dans les premiers stades de la culture. Sur la base de cette méthode, une méthode de co-culture avec les cellules immunitaires humaines peut également donner des indices sur la façon dont le microbiome peut dialoguer avec le système immunitaire et influencer l’homéostasie de la santé intestinale optimale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reconstituer le micro-environnement de l’intestin humain et de démontrer cette co-culture entre le microbiome et les villosités intestinales humaines in vitro. Travailler avec des bactéries pathogènes et des cellules humaines est extrêmement dangereux, alors n’oubliez pas de travailler à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.