Name: Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez la co-culture du microbiome intestinal avec des villosités humaines dans un dispositif microfluidique gut-on-a-chip. Cette méthode simule les mouvements péristaltiques pour étudier les interactions hôte-microbe et les maladies gastro-intestinales.

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Nous remercions Sri Kosuri (Institut Wyss de l’Université Harvard) d’avoir fourni la souche E. coli marquée GFP. Ce travail a été soutenu par la Defense Advanced Research Projects Agency en vertu de l’accord de coopération numéro W911NF-12-2-0036, la Food and Drug Administration sous contrat #HHSF223201310079C et le Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l’Université Harvard. Les points de vue et les conclusions contenus dans ce document sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant les politiques officielles, expresses ou implicites, du Bureau de recherche de l’Armée, du Laboratoire de recherche de l’Armée, de la Food and Drug Administration ou du gouvernement des États-Unis. Le gouvernement des États-Unis est autorisé à reproduire et à distribuer des réimpressions à des fins gouvernementales, nonobstant toute mention de droit d’auteur figurant sur les présentes.

1. microfabrication d&#39;un dispositif Gut-on-a-chip Remarque: La puce boyau sur un dispositif microfluidique produit par, un polymère de silicone transparent perméable aux gaz (polydiméthylsiloxane PDMS), comportant deux micro-canaux parallèles (1 mm de largeur x 150 um de hauteur x 1 cm de longueur) séparés par une souplesse poreux (10 m de diamètre des pores, 25 um d&#39;espacement des pores de pores) PDMS membrane 5,9. Fabriquez l&#39;intestin-on-a-chip (figure 1A, gauche) suivant les étapes prévues. <ol><li> Microfabrication procédure du Gut-5,9 sur-une-puce. <ol><li> Préparer PDMS non durcies, dégazés en mélangeant le prépolymère PDMS et l&#39;agent de durcissement (15: 1 en poids / poids) et la placer dans le dessiccateur à vide pendant 30 min. </li><li> Verser 30 g et 3 g de non durcies, PDMS dégazés sur chaque moule en silicone qui a SU-8 micropatterns base de la tige et les microcanaux inférieurs de la puce gut-sur, respectivement. Puis durcir à 60 ° C dans un four sec pour au lest 4 h. </li><li> Démouler les PDMS couches supérieure et inférieure de chaque moule de silicium en coupant autour du bord à l&#39;aide d&#39;un scalpel chirurgical. Percez 6 trous (deux entrées, deux sorties et deux chambres à vide) en utilisant un perforateur de biopsie (2,0 mm de diamètre du trou). </li><li> Préparer la membrane poreuse en versant 10 g de PDMS non durcis et dégazé sur une plaquette de silicium silané contenant de soumettre des tableaux avec des piliers circulaires (10 um de diamètre, 25 um de hauteur) recouvrant avec une surface plane, silanisé couche de support PDMS (15: 1, w / w; 1 cm d&#39;épaisseur). Placez 3 kg de poids presseur sur la configuration et durcir le polymère à 60 ° C pendant 12 heures ou plus. </li><li> Démouler la mise en place d&#39;une membrane poreuse PDMS collée sur le support de la dalle PDMS la plaquette de silicium soigneusement en soulevant un coin de la dalle de la plaquette et se décolle jusqu&#39;à ce que la membrane poreuse PDMS est complètement détachée de la plaquette. </li><li> Exposer le côté de canal d&#39;une couche supérieure (PDMS, 15: 1, p / p) et du côté de la membrane poreuse au plasma généré par une couronne treater terminal mobile pendant 1 min et 3 s, respectivement. </li><li> Placer les surfaces traitées par plasma de la membrane poreuse PDMS et d&#39;une couche supérieure de microcanaux dans un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d&#39;air. </li><li> Incuber l&#39;ensemble de l&#39;installation à 80 ° CO / N pour la liaison irréversible des deux couches PDMS. </li><li> Décoller la couche PDMS de support de l&#39;ensemble d&#39;une couche supérieure d&#39;une membrane poreuse par précaution en soulevant le coin de la couche de support, et décoller jusqu&#39;à ce que la couche de support est complètement détaché de la couche supérieure avec la membrane. </li><li> Détachez les parties de cette membrane située au-dessus des chambres à vide (les deux Chambers situés de chaque côté du canal principal) à l&#39;aide d&#39;une pointe fine pince à épiler pour faire des chambres à vide creux. </li><li> Exposer le côté avec la membrane fixée sur la partie supérieure et le côté avec les canaux gravés sur la pièce inférieure au plasma dans un même manière que décrit in 1.1.6 étape pendant 1 min. </li><li> Aligner la couche de microcanaux supérieure d&#39;une membrane poreuse et la couche inférieure avec un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d&#39;air sous un stéréoscope. </li><li> Cure l&#39;ensemble de l&#39;installation dans un four sec à 80 ° CO / N pour produire un dispositif microfluidique complet échelle gut-on-a-chip contenant deux chambres à vide creux à côté du canal cellulaire microfluidique. </li></ol></li><li> Connecter le tuyau à l&#39;entrée et à la sortie de chaque port relié à la tige ou les microcanaux inférieurs dans un gut-on-a-chip via une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end. </li><li> Connecter le tuyau aux trous liés aux chambres à vide en utilisant une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end. </li><li> Stériliser les micro-canaux et de tubes en faisant circuler de 70% (v / v) d&#39;éthanol en utilisant une seringue de 1 ml stérilisées à usage unique. </li><li> Sécher les microcanaux et les tubes dans un 60 ° C four sec O / N. </li></ol> 2. Croissance du micromoteurEred Intestinal Villi dans le dispositif Gut-on-a-chip <ol><li> Seed cellules épithéliales intestinales (par exemple Caco-2BBE) sur un Microdevice Gut-5,9 sur-une-puce. <ol><li> Stériliser l&#39;appareil avec 70% (v / v) d&#39;éthanol (voir étape 1.4), en utilisant une seringue stérile de 1 ml à usage unique suivie d&#39;un séchage dans un four à 60 ° C sec O / N (voir étape 1.5) avant l&#39;activation de la surface. </li><li> Exposer la configuration complète d&#39;un microsystème gut-on-a-chip ( à savoir, un corps de l&#39;intestin-on-a-chip relié à un tube) à la lumière UV (253,7 nm) et à l&#39; ozone simultanément pendant 40 min. </li><li> Refroidir l&#39;appareil à température ambiante pendant 15 min sous la lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique (BSC). </li><li> Introduire 100 pi de la couche d&#39;ECM Solution- un mélange de 50 pg / type ml de collagène et un mélange de la matrice extracellulaire 300 pg / ml dilués dans le sans sérum du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) - dans les deux micro-canaux supérieur et inférieur en utilisant un jetable stérile, seringue de 1 ml. </li><li> incubatE l&#39;ensemble de l&#39; installation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 h. </li><li> Dégazer 50 ml de pré-chauffé (37 ° C) au milieu de culture complet (DMEM, 20% v / v de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, aliquotées dans un 3 ml seringue jetable) en utilisant un système de filtration de 50 ml (0,45 um de taille des pores) dans la BSC pendant 1 min. <ol><li> Passez le milieu de pré-chauffé à travers le système de filtration et appuyez doucement sur le milieu filtré pour 1 min pour éliminer les bulles ou gaz dissous dans le milieu. </li></ol></li><li> Placer l&#39;aliquote de milieu complet dégazé dans une seringue jetable de 3 ml et incuber dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure. </li><li> Branchez deux 3 seringues jetables ml contenant dégazé, milieu de culture complet préchauffée à microcanaux supérieure et inférieure. </li><li> Débit du milieu de culture cellulaire complète dégazé dans le microcanal supérieur en utilisant une pompe seringue à la volumétriquetaux de 30 ul / h débit (équivalent à la contrainte de cisaillement à 0,02 dyne / cm 2) dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> Formation de Microengineered Caco-2 Villi dans la puce Gut-on. <ol><li> Utiliser des cellules Caco-2BBE avec le nombre de passage compris entre 50 et 65. </li><li> Cultiver les cellules Caco-2 dans un flacon T75 contenant du milieu de culture complet dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 4-5 jours pour obtenir des cellules confluentes complètement. </li><li> Ajouter 10 ml de Ca 2+ et Mg 2+ -free PBS complètement confluentes cellules Caco-2 cultivées dans un flacon T75, laver les cellules, puis Aspirer PBS. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules dissociées avec 10 ml de milieu de culture cellulaire complet préchauffée (avec du FBS), par pipetage de haut en bas trois à cinq fois. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire par centrifugation à 500 xg pendant 5 min, puis retirez le surnageant. </li><li> Resuspendre à nouveau avec 1 ml préchauffé milieu complet pour ajuster la densité cellulaire à ~ 1,5 x 10 5 cellules / cm2 dans le dispositif. Utiliser hémocytomètre pour estimer la densité cellulaire. </li><li> 100 pi de perfuser les remises en suspension des cellules Caco-2 dans le microcanal supérieur (lumière latérale) en plaçant une seringue jetable de 1 ml fixée à une aiguille 8 25 G5 / sur la sortie d&#39;un tube relié à la partie supérieure microcanal. </li><li> Serrer toutes les entrées et sorties des tubes reliés aux micro-canaux supérieur et inférieur à l&#39;aide de clips de liaison. </li><li> Incuber l&#39;ensemble de l&#39; installation dans un 37 ° C, humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre dissociées cellules Caco-2 à adhérer à la surface de la membrane poreuse. </li><li> Enlever les colliers de serrage et de reprendre l&#39;écoulement du milieu de culture uniquement au microcanal supérieure à 30 ul / h en utilisant une pompe à seringue jusqu&#39;à ce que les cellules forment une monocouche intacte pendant 24-36 h. Utilisez les contras de phaset ou le contraste interférentiel différentiel (DIC) au microscope pour confirmer les jonctions cellule-cellule dans une monocouche cellulaire. </li><li> Lorsque les cellules forment une monocouche, perfuser le milieu de culture dans les deux supérieures (lumen) et inférieure (capillaires) microcanaux au même taux de 30 ul / h débit. </li><li> Application des déformations mécaniques imitant péristaltisme-like motions 5,9. <ol><li> Allumez la pompe à vide équipé du matériel de traction. </li><li> Relier les chambres à vide sur le régulateur de vide par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube avec un raccord en acier inoxydable. </li><li> Réglez le mouvement d&#39;étirement de 10% souche cellulaire moyenne à une fréquence de 0,15 Hz avec le mode de fonction sinus cyclique sur le logiciel de contrôle sous vide, puis cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. </li></ol></li><li> Maintenir le flux constant de milieu de culture (30 ul / h) dans les deux microcanaux supérieure et inférieure à la confluentes Caco-2 monocouche sous déformations mécaniques (10%, 0,15 Hz) pour ~ 100 h. Remarque: cellules Caco-2 Sponsubir tanément villosités morphogenèse avec des projections 3D ondulées étendues vers la lumière du microcanal épithéliale 5,8-10. </li></ol></li><li> Pour émuler les fonctions au niveau des organes de l&#39;intestin humain vivant avec une interface de tissu lumen-capillaire dans l&#39;intestin-on-a-chip 10, suivez les étapes décrites. <ol><li> Cultivez microengineered Caco-2 villosités en répétant les étapes 2,1 à 2,2. </li><li> L&#39;écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) pour les microcanaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h. </li><li> Introduire 100 pi de cellules dissociées normales microvasculaires capillaires endothéliales humaines (les HMVECs, la densité cellulaire finale, ~ 5,0 x 10 5 cellules / cm 2) dans le microcanal inférieure par la méthode décrite dans les étapes identiques de 2.2.3 à 2.2.9. </li><li> Placez un morceau de PDMS rectangulaire durci (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, largeur x longueur x hauteur; 15: 1, w/ w élastomère: agent de durcissement) sur le dessus de l&#39;appareil gut-on-a-chip, puis retournez la configuration de l&#39; ensemble du dispositif à l&#39; envers (ie, le microcanal supérieur fait face à la baisse, et le microcanal inférieur fait face à la hausse). </li><li> Incuber l&#39;installation dans un 37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre HMVECs dissociées à adhérer à la surface de la membrane poreuse dans le microcanal inférieure. </li><li> Prenez toute une installation à partir du CO 2 incubateur, et retourner la configuration à nouveau. </li><li> Écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h, avec des mouvements d&#39;étirement mécanique ( 10%, 0,15 Hz) pendant au moins trois jours pour former des jonctions cellule-cellule endothéliale d&#39;une monocouche. </li></ol></li></ol> 3. Hôte-gut Co-culture microbiome dans un Microdevice Gut-on-a-chip <ol><li> Effectuer pré-culture of les cellules bactériennes comme suit pour co-culture commensal gut microbiome sur les villosités intestinales microengineered. <ol><li> Remettre en suspension le mélange en poudre bactérienne probiotique lyophilisé dans 10 ml de mélange (1: 1, v / v) de lactobacilles autoclavée MRS Broth et clostridium moyenne. </li><li> Ajuster la densité cellulaire finale d&#39;environ 0,2 unités de densité optique (à 600 nm) en y ajoutant quantité appropriée de milieu, puis aliquote de 3 ml de suspension de cellules microbiennes dans un tube stérile jetable de 10 ml. </li><li> Placer les tubes contenant les cellules microbiennes remises en suspension dans le réservoir anaérobie. Ajouter deux paquets de sachets anaérobie produisant du gaz dans le récipient. Fermez le couvercle du récipient bien et incuber la configuration du récipient sans agitation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> Ensemencement des microbiome et co-culture avec des cellules épithéliales intestinales 5,10. <ol><li> Préparer des seringues jetables de 3 ml contenant antibioti dégazéc exempt de milieu de culture cellulaire ( par exemple, du DMEM avec 20% de FBS). Voir 2.1.6 pour la procédure de dégazage du milieu de culture. </li><li> Prenez toute une configuration de l&#39;appareil gut-on-a-chip contenant villosités microengineered du CO 2 incubateur, puis passer à l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Retirer les seringues raccordées à un tube relié à microcanaux supérieure et inférieure. Connecter les seringues préparées 3.2.1 à l&#39;appareil, ramener à l&#39;incubateur à CO 2, alors circuler ce milieu de culture sans antibiotique pendant 12 heures avant l&#39;ensemencement du microbiome. </li><li> Isoler les cellules bactériennes probiotiques pré-cultivées mélange (voir étapes 3.1) à 10.000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant en utilisant le vide, puis remise en suspension dans un milieu DMEM sans antibiotique (densité cellulaire finale, ~ 1,0 x 10 7 UFC / ml). </li><li> Perfuser la suspension cellulaire sur le côté de la lumière du microcanal contenant les villosités intestinales &quot;axéniques&quot; en utilisant une seringue jetable de 1 ml fixée à une 25G5 aiguille / 8. Permettre l&#39;adhérence des cellules microbiennes à la surface apicale des villosités intestinales pendant environ 1,5 heure sans écoulement par serrage à l&#39;ensemble de l&#39;extrémité de la tubulure. </li><li> Perfuser le milieu de culture sans antibiotique préchauffée dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 40 ul / h, avec des déformations cycliques cadencés (10%, 0,15 Hz). </li><li> Pour la co-culture de la protéine de fluorescence verte (GFP) marqué à E. coli (E. coli GFP; non-pathogène DH5-Alpha E. coli hôtes) 10,11 cellules avec villosités microengineered, pré-cultiver GFP E. cellules coli dans un milieu LB autoclave à 37 ° C sous agitation condition (200 rpm) pendant 12 heures. Répétez la procédure à partir de 3.2.5 à 3.2.6 pour mener à bien la co-culture de la GFP E. cellules coli avec villosités microengineered. </li></ol></li><li> Les cellules de l&#39; image 5,8-10 <ol><li> Effectuer DIC, épifluorescence ou balayage laser microscopie confocale pour l&#39; enregistrement microbienne et épithéliales morphologie 5,8,10. <ol><li> Pour l&#39;imagerie DIC, prendre une configuration de microsystème gut-on-a-chip du CO 2 incubateur, placez le réglage de l&#39; appareil sur la scène d&#39;un microscope, puis enregistrer la morphologie cellulaire. </li><li> Pour l&#39;imagerie de fluorescence de villosités épithélium, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules dans 100 ul / h pendant 10 min. <ol><li> Fixer villosités avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 15 minutes. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> Perméabiliser les villosités avec 0,3% (v / v) de Triton X-100 dilué dans du PBS contenant 2% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 10 min. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> des cellules de bloc avec 2% (p / v) de BSA dans une solution PBS pendant 1 heure. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> Ajouter 300 nM de 4 &#39;, dichlorhydrate 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution diluée dans du PBS pour la coloration nucléaire sous la protection de la lumière. </li><li> Ajouter 25 unités / ml de phalloïdine fluorescente(Phalloïdine-CF647 conjugué) dissous dans du PBS pour la coloration F-actine sous la protection de la lumière. </li><li> Enregistrement des images des cellules colorées par fluorescence à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage laser. Note: Un objectif 25X a été appliqué avec zoom optique approprié au cours de la microscopie confocale. La figure 3B, le grossissement d&#39; environ 525X a été utilisé. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Donald E. Ingber est l’un des fondateurs d’Emulate Inc., détient des actions de l’entreprise et préside son conseil consultatif scientifique. Les autres auteurs n’ont pas de divulgation financière.

Comprendre les interactions hôte-microbiome est essentiel pour faire avancer la médecine; Cependant, les modèles de culture de cellules traditionnelles réalisées dans une boîte en plastique ou une plaque de puits statique ne prennent pas en charge la co-culture stable de cellules intestinales humaines avec des microbes de l&#39; intestin vivant pendant plus de 1-2 jours parce que les cellules microbiennes envahissent la plupart des cellules de mammifères in vitro. La population microbienne overgrowing consomme ...

L&#39;intestin humain héberge un réseau incroyablement diversifié d&#39;espèces microbiennes (&lt;1.000 espèces) et un très grand nombre de cellules microbiennes (10 fois plus que les cellules hôtes humaines) et des gènes (100 fois plus que le génome humain) 1. Ces microbiomes humains jouent un rôle clé dans le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques, la régulation des réponses immunitaires, et le maintien de l&#39; homéostasie intestinale 2. Sans surprise, compte tenu de ces diverses fonctions, l&#39;intestin microbiome commensal modulant largement la santé et de la maladie 3. Ainsi, la compréhension du rôle des interactions gut microbiome et hôte-microbe sont d&#39; une grande importance pour promouvoir gastro - intestinal (GI) la santé et explorer de nouvelles thérapies pour les troubles intestinaux 4. Cependant, existant dans les modèles in vitro de l&#39; intestin (par exemple, les cultures statiques) limitent la co-culture de l&#39; hôte microbiome à une courte période de temps (&lt;1 jour) parce que les cellules microbiennes et supplantent compromettent la barrière intestinalefonction 5. Modèles animaux de substitution (par exemple, 6 ou génétiquement exempt de germes de souris 7) sont également pas couramment utilisées pour étudier l&#39; hôte-gut microbiome diaphonie parce que la colonisation et l&#39; entretien stable de microbiome intestin humain sont difficiles. Pour relever ces défis, nous avons récemment développé un humain biomimétique &quot;Gut-on-a-Chip&quot; système microphysiological (figure 1A, gauche) pour émuler les interactions microbiome hôte intestin qui se produisent dans l&#39;intestin humain vivant 5,8. Microdispositif intestin sur une puce comporte deux canaux microfluidiques parallèles séparés par une poreuse, une matrice extracellulaire souple (ECM) de membrane revêtu de bordée par épithéliales intestinales humaines Caco-2 cellules, mimant l&#39;interface tissu intestinal lumière capillaire (figure 1A , à droite) 9. déformations rythmiques cycliques entraînée sous vide induisent des déformations mécaniques physiologiques qui imitent les changements normalement induced par péristaltisme (figure 1A, à droite). Fait intéressant, lorsque cellules Caco-2 sont cultivées dans le tube digestif-on-a-chip pendant plus de 100 heures, ils forment spontanément en trois dimensions (3D) villosités intestinales avec des jonctions serrées, les bordures en brosse apicale, les cellules proliférantes limitées à cryptes de base, la production de mucus, augmentation de l&#39; activité médicamenteuse de métabolisation (par exemple, le cytochrome P450 3A4, CYP 3A4), et le glucose amélioré recapture 8. Dans ce microenvironnement &#39;exempt de germes », il était possible de co-culture de la GG Lactobacillus rhamnosus probiotique ou une formation thérapeutique d&#39;un mélange bactérien probiotique avec des cellules épithéliales hôte jusqu&#39;à deux semaines 5,10. Dans cette étude, nous décrivons le protocole détaillé pour effectuer hôte-gut microbiome co-culture dans le dispositif gut-on-a-chip pour une période prolongée. En outre, nous discutons des questions critiques et les défis potentiels à prendre en considération pour une large application de cet hôte-microbiome co-culture protocole.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 25 mM de glucose et 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Réchauffez-le à 37 &deg ; C dans un bain-marie.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS bouillon</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Exécuter l’autoclave à 121 &deg ; C pendant 15 min.</td></tr><tr><td>Poly(diméthylsiloxane)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/p), PDMS : agent de guérison</td></tr><tr><td>Caco-2BBE ligne de carcinome colorectal humain</td><td>Harvard Digestive Disease Center</td><td></td><td>Adénocarcinome colorectal humain&nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS inactivé à la chaleur</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20 % (v/v) dans DMEM</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine-glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Dilution 1/100 dans le</td></tr><tr><td>dichlorhydrate de DMEM 4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole</td><td>Sondes moléculaires</td><td>D1306</td><td>Coloration des noyaux</td></tr><tr><td>Conjugué Phalloidine-CF647 (25 unités/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>Coloration de l’actine F</td></tr><tr><td>Système de tension Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Mouvement de stretcing semblable à celui du péristaltisme (déformation cellulaire de 10 %, fréquence de 0,15 Hz)</td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging,</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage</td> DIC <td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, Fluorescence</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Activation superficielle du</td></tr><tr><td>collagène de type I de</td> la puce intestinale.<td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Composant de matrice extracellulaire pour la culture cellulaire dans la puce</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Composant de matrice extracellulaire pour la culture cellulaire dans la puce</td></tr><tr><td>Seringue jetable de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Matériel d’injection de cellules et de milieux</td></tr><tr><td>25 G Aiguille 5/8</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Matériel d’injection de cellules et de milieux</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Matériel d’injection dans la puce</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>Une formulation de 8 microbes intestinaux commensales différents</td></tr><tr><td>Milieu clostridien renforcé</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Milieu de culture de bactéries anaérobies</td></tr><tr><td>GasPak EZ Système de conteneur anaérobie avec indicateur</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Sachet générateur de gaz anaérobie&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscopie électronique</td> à <td>4 % de paraformaldéhyde</td> Science <td>157-4-100</td><td>Fixation des cellules pour la coloration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Perméabilisation des cellules</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Agent bloquant pour la coloration des cellules</td></tr><tr><td>Traitement corona</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>Générateur de plasma pour la fabrication de la puce</td></tr><tr><td>Steriflip&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Dégazage de l’ensemble du milieu de culture</td></tr><tr><td>Hémocytomètre jetable</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>Pour le comptage manuel des cellules</td></tr></tbody></table>

co-culture de la vie microbiome avec microengineered human intestinal villi dans un gut-on-a-chip microfluidique périphérique

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer à long terme de co-culture de plusieurs espèces microbiome intestinal humain avec villosités intestinales microengineered dans un dispositif humain gut-on-a-chip microphysiological. Nous récapitulons l&#39;interface tissu intestinal lumen-capillaires dans un dispositif microfluidique, où des déformations mécaniques physiologiques et des flux de cisaillement de fluide sont constamment appliquées pour imiter le péristaltisme. Dans le microcanal de la lumière, l&#39;épithélium intestinal Caco-2 sont cultivées des cellules humaines pour former un épithélium villosités &#39;exempt de germes »et régénérer villosités intestinales. les cellules microbiennes cultivées sont pré-inoculées dans le côté de la lumière pour établir un écosystème microbe hôte. Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités, l&#39;écoulement du fluide et des déformations mécaniques sont repris pour produire un microenvironnement état d&#39;équilibre dans lequel le milieu de culture frais est constamment fourni et les bactéries non liées (ainsi que les déchets bactériens) sont continuellement retirés. Après prolongée co-culture fjour de ROM vers semaines, plusieurs microcolonies sont trouvés être situés de façon aléatoire entre les villosités et les deux microbes et les cellules épithéliales restent viables et fonctionnelles pendant au moins une semaine de culture. Notre protocole de co-culture peut être adapté pour fournir une plate - forme polyvalente pour d&#39; autres écosystèmes d&#39;accueil-microbiome qui peuvent être trouvés dans divers organes humains, qui peuvent faciliter étude in vitro du rôle du microbiome humain dans l&#39; orchestration de la santé et de la maladie.

Pour émuler l&#39;intestin écosystème hôte microbiome humain in vitro, il est nécessaire de développer un protocole expérimental pour reconstituer la co-culture stable à long terme des bactéries intestinales et les cellules épithéliales intestinales humaines dans des conditions physiologiques telles que la mécanique péristaltisme-like et l&#39;écoulement du fluide. Ici, nous utilisons un microdispositif biomimétique gut-on-a-chip (Figure 1A)</strong...

Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la croissance des villosités des cellules intestinales humaines sous des mouvements et un écoulement similaires à la péristaltique dans un dispositif microfluidique de type « intestin-sur-puce », ainsi que de montrer comment co-cultiver ces cellules avec un microbiome intestinal vivant. Cette méthode peut donc aider à répondre aux questions clés dans les domaines de la gastro-entérologie, de la microbiologie clinique et des sciences pharmaceutiques, notamment en identifiant les mécanismes des maladies et en validant l'efficacité et la toxicité de nouveaux composés médicamenteux. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent établir in vitro un écosystème viable et fonctionnel du microbiome postérieur de l'intestin humain vivant, en utilisant un système microphysiologique.Les implications de cette technique peuvent s'étendre à des maladies telles que la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, puisque la co-culture stable des cellules de l'hôte avec le microbiome peut reproduire la complexité de ces affections. Bien que cette méthode permette de mieux comprendre les interactions complexes entre le microbiome intestinal et le système immunitaire dans l'intestin, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes organiques impliquant des interactions hôte-microbe, comme la peau, le tractus génital ou la cavité buccale. Pour commencer, préparez le dispositif microfluidique « intestin-sur-puce » comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.Le dispositif est constitué d'un polymère de silicium transparent perméable aux gaz, contenant deux microcanaux parallèles séparés par une membrane en PDMS poreuse et flexible. De chaque côté des canaux se trouvent des chambres sous vide, qui peuvent être utilisées pour appliquer une contrainte mécanique cyclique. Stérilisez le dispositif en faisant circuler de l'éthanol à 70 % à l'aide d'une seringue d'un millilitre à travers les canaux.Ensuite, séchez l'appareil dans une étuve sèche à 60 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le lendemain, exposez le microsystème de type « intestin-sur-puce », ainsi que ses tubulures connectées, simultanément à la lumière UV et à l'ozone pendant 40 minutes. Laissez refroidir l'appareil tout en le maintenant sous la lumière UV d'une hotte de sécurité pendant 15 minutes.Ensuite, chargez 100 microlitres d'une solution codant pour la matrice extracellulaire dans une seringue d'un millilitre, puis délivrez-la dans le microcanal supérieur du dispositif. Répétez ce processus afin de recouvrir également le microcanal inférieur. Placez l'ensemble dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant une heure.Pendant l'incubation, dégazer le milieu de culture complet préalablement réchauffé en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 micron dans un système de filtration de 50 millilitres pendant une minute. Tapoter doucement sur le milieu filtré pendant une minute afin d'éliminer toute bulle ou gaz dissous présent dans le milieu. Ensuite, transférer le milieu complet dégazé dans deux seringues jetables de trois millilitres, puis incuber les seringues pendant une heure.Ensuite, connectez les seringues aux microcanaux supérieur et inférieur du système « intestin-sur-puce », puis éliminez la solution de marquage en faisant circuler un milieu complet à travers les microcanaux supérieur et inférieur avec une impulsion douce. Puis, utilisez une pompe à seringue pour faire circuler le milieu de culture cellulaire complet dégazé dans le microcanal supérieur du dispositif, tout en incubant la puce toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. Récoltez les cellules épithéliales intestinales Caco-2 d’un flacon T75 entièrement confluant en rinçant d’abord les cellules avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium.Ensuite, aspirez le PBS et répétez le rinçage deux fois supplémentaires. Puis, ajoutez un millilitre de solution de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez le flacon pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire complet préalablement réchauffé, puis pipetez la suspension cellulaire de haut en bas trois à cinq fois avant de la transférer dans un tube de centrifugation.Faire centrifuger la suspension cellulaire. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules à raison de 150 000 cellules par centimètre carré dans un milieu complet préchauffé. Aspirer 500 microlitres de la suspension cellulaire dans une seringue jetable d'un millilitre, munie d'une aiguille de 25 gauge, 5/8 de pouce.Ensuite, distribuez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans le microcanal supérieur par le tube de sortie. Puis, serrez toutes les entrées et sorties reliées aux microcanaux supérieur et inférieur à l’aide de pinces à levier. Incubez l’ensemble pendant une heure afin de permettre aux cellules épithéliales intestinales d’adhérer à la surface de la membrane poreuse.Ensuite, retirez les pinces et reliez le tube du canal supérieur à une seringue remplie de milieu de culture, placée sur une pompe à seringue. Reprenez l'écoulement du milieu de culture vers le microcanal supérieur à raison de 30 microlitres par heure, jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche intacte. Une fois que les cellules ont formé une monocouche, reliez le canal inférieur à la deuxième seringue et perfusez le milieu de culture dans les microcanaux luminal supérieur et capillaire inférieur à un débit identique de 30 microlitres par heure.Pour créer un mouvement similaire à la péristaltis dans la puce, commencez par allumer la pompe à vide. Connectez les chambres à vide du dispositif au contrôleur de vide à l’aide de tubes munis d’un raccord en acier inoxydable. Ensuite, réglez le contrôleur pour qu’il applique un mouvement cyclique d’étirement correspondant à 10 % de la déformation cellulaire moyenne à une fréquence de 0,15 hertz, puis cliquez sur démarrer.Continuer à faire circuler le milieu de culture dans les microcanaux supérieur et inférieur en présence de déformations mécaniques pendant au moins 80 heures afin d'induire la croissance des villosités. Préparer un mélange 50/50 de bouillon MRS pour lactobacilles stérilisé et de milieu renforcé pour clostridia. Ensuite, resuspendre un mélange bactérien probiotique lyophilisé dans 10 millilitres du mélange.Mesurez la densité optique du mélange à 600 nanomètres et ajustez la densité cellulaire finale à environ 0,2 unité de densité optique. Répartissez trois millilitres de la suspension cellulaire microbienne ajustée dans des tubes stériles jetables de 10 millilitres. Placez les aliquots dans un contenant anaérobie et ajoutez deux sachets générateurs de gaz anaérobie dans le contenant.Fermer hermétiquement le couvercle du récipient et incuber l'ensemble sans agitation dans une étuve pendant la nuit. Ensuite, préparer un milieu de culture cellulaire sans antibiotique et dégazé, puis le charger dans des seringues jetables de trois millilitres. Transférer le dispositif « intestin-sur-puce » contenant les villosités micro-ingénieries dans l'enceinte de sécurité biologique.Retirer les seringues connectées aux microcanaux supérieur et inférieur du dispositif et les remplacer par des seringues contenant le milieu de culture cellulaire désaéré et sans antibiotique. Une fois terminé, replacer le dispositif dans l'incubateur à CO2. Ensuite, faire circuler le milieu de culture sans antibiotique dans le dispositif pendant 12 heures avant l'ensemencement du microbiome.Ensuite, centrifuger le mélange de cellules bactériennes probiotiques pré-cultivées. Aspirer le surnageant, puis resuspendre les bactéries dans du DMEM sans antibiotique. Charger environ 100 microlitres de cette suspension cellulaire dans une seringue d'un millilitre fixée à une aiguille de 25 gauge, 5/8 de pouce.Introduire les bactéries dans le côté luminal du microcanal contenant les villosités intestinales précédemment stériles. Laisser les cellules microbiennes adhérer à la surface apicale des villosités intestinales pendant une heure et demie sans écoulement, en pinçant le tube. Ensuite, perfuser le milieu de culture préalablement réchauffé et sans antibiotique dans les microcanaux supérieur et inférieur à raison de 40 microlitres par heure, avec des déformations rythmiques cycliques.Ce protocole de co-culture permet une colonisation stable de plusieurs espèces de bactéries probiotiques dans l'espace intervillositaire. Des micro-colonies bactériennes viables peuvent être maintenues jusqu'à deux semaines en co-culture. On observe ici une co-culture différente composée à la fois de E.coli marqués au GFP et de villosités intestinales.L'agrandissement à fort grossissement montre clairement l'emplacement des micro-colonies bactériennes au point temporel de 72 heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'injecter doucement et lentement le milieu de culture dans les canaux microfluidiques afin d'éviter d'endommager la monocouche de cellules épithéliales aux premiers stades de la culture. À partir de cette méthode, une méthode de co-culture avec les cellules immunitaires humaines peut également fournir des indices sur la manière dont le microbiome peut interagir avec le système immunitaire et influencer l'homéostasie et la santé optimale de l'intestin.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de reconstituer le micro-environnement de l'intestin humain et de démontrer la co-culture entre le microbiome et les villosités intestinales humaines in vitro. Travailler avec des bactéries pathogènes et des cellules humaines est extrêmement dangereux ; n'oubliez donc pas de travailler à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique.

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