Name: Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez la co-culture du microbiome intestinal avec des villosités humaines dans un dispositif microfluidique gut-on-a-chip. Cette méthode simule les mouvements péristaltiques pour étudier les interactions hôte-microbe et les maladies gastro-intestinales.

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Nous remercions Sri Kosuri (Institut Wyss de l’Université Harvard) d’avoir fourni la souche E. coli marquée GFP. Ce travail a été soutenu par la Defense Advanced Research Projects Agency en vertu de l’accord de coopération numéro W911NF-12-2-0036, la Food and Drug Administration sous contrat #HHSF223201310079C et le Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l’Université Harvard. Les points de vue et les conclusions contenus dans ce document sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant les politiques officielles, expresses ou implicites, du Bureau de recherche de l’Armée, du Laboratoire de recherche de l’Armée, de la Food and Drug Administration ou du gouvernement des États-Unis. Le gouvernement des États-Unis est autorisé à reproduire et à distribuer des réimpressions à des fins gouvernementales, nonobstant toute mention de droit d’auteur figurant sur les présentes.

1. microfabrication d&#39;un dispositif Gut-on-a-chip Remarque: La puce boyau sur un dispositif microfluidique produit par, un polymère de silicone transparent perméable aux gaz (polydiméthylsiloxane PDMS), comportant deux micro-canaux parallèles (1 mm de largeur x 150 um de hauteur x 1 cm de longueur) séparés par une souplesse poreux (10 m de diamètre des pores, 25 um d&#39;espacement des pores de pores) PDMS membrane 5,9. Fabriquez l&#39;intestin-on-a-chip (figure 1A, gauche) suivant les étapes prévues. <ol><li> Microfabrication procédure du Gut-5,9 sur-une-puce. <ol><li> Préparer PDMS non durcies, dégazés en mélangeant le prépolymère PDMS et l&#39;agent de durcissement (15: 1 en poids / poids) et la placer dans le dessiccateur à vide pendant 30 min. </li><li> Verser 30 g et 3 g de non durcies, PDMS dégazés sur chaque moule en silicone qui a SU-8 micropatterns base de la tige et les microcanaux inférieurs de la puce gut-sur, respectivement. Puis durcir à 60 ° C dans un four sec pour au lest 4 h. </li><li> Démouler les PDMS couches supérieure et inférieure de chaque moule de silicium en coupant autour du bord à l&#39;aide d&#39;un scalpel chirurgical. Percez 6 trous (deux entrées, deux sorties et deux chambres à vide) en utilisant un perforateur de biopsie (2,0 mm de diamètre du trou). </li><li> Préparer la membrane poreuse en versant 10 g de PDMS non durcis et dégazé sur une plaquette de silicium silané contenant de soumettre des tableaux avec des piliers circulaires (10 um de diamètre, 25 um de hauteur) recouvrant avec une surface plane, silanisé couche de support PDMS (15: 1, w / w; 1 cm d&#39;épaisseur). Placez 3 kg de poids presseur sur la configuration et durcir le polymère à 60 ° C pendant 12 heures ou plus. </li><li> Démouler la mise en place d&#39;une membrane poreuse PDMS collée sur le support de la dalle PDMS la plaquette de silicium soigneusement en soulevant un coin de la dalle de la plaquette et se décolle jusqu&#39;à ce que la membrane poreuse PDMS est complètement détachée de la plaquette. </li><li> Exposer le côté de canal d&#39;une couche supérieure (PDMS, 15: 1, p / p) et du côté de la membrane poreuse au plasma généré par une couronne treater terminal mobile pendant 1 min et 3 s, respectivement. </li><li> Placer les surfaces traitées par plasma de la membrane poreuse PDMS et d&#39;une couche supérieure de microcanaux dans un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d&#39;air. </li><li> Incuber l&#39;ensemble de l&#39;installation à 80 ° CO / N pour la liaison irréversible des deux couches PDMS. </li><li> Décoller la couche PDMS de support de l&#39;ensemble d&#39;une couche supérieure d&#39;une membrane poreuse par précaution en soulevant le coin de la couche de support, et décoller jusqu&#39;à ce que la couche de support est complètement détaché de la couche supérieure avec la membrane. </li><li> Détachez les parties de cette membrane située au-dessus des chambres à vide (les deux Chambers situés de chaque côté du canal principal) à l&#39;aide d&#39;une pointe fine pince à épiler pour faire des chambres à vide creux. </li><li> Exposer le côté avec la membrane fixée sur la partie supérieure et le côté avec les canaux gravés sur la pièce inférieure au plasma dans un même manière que décrit in 1.1.6 étape pendant 1 min. </li><li> Aligner la couche de microcanaux supérieure d&#39;une membrane poreuse et la couche inférieure avec un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d&#39;air sous un stéréoscope. </li><li> Cure l&#39;ensemble de l&#39;installation dans un four sec à 80 ° CO / N pour produire un dispositif microfluidique complet échelle gut-on-a-chip contenant deux chambres à vide creux à côté du canal cellulaire microfluidique. </li></ol></li><li> Connecter le tuyau à l&#39;entrée et à la sortie de chaque port relié à la tige ou les microcanaux inférieurs dans un gut-on-a-chip via une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end. </li><li> Connecter le tuyau aux trous liés aux chambres à vide en utilisant une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end. </li><li> Stériliser les micro-canaux et de tubes en faisant circuler de 70% (v / v) d&#39;éthanol en utilisant une seringue de 1 ml stérilisées à usage unique. </li><li> Sécher les microcanaux et les tubes dans un 60 ° C four sec O / N. </li></ol> 2. Croissance du micromoteurEred Intestinal Villi dans le dispositif Gut-on-a-chip <ol><li> Seed cellules épithéliales intestinales (par exemple Caco-2BBE) sur un Microdevice Gut-5,9 sur-une-puce. <ol><li> Stériliser l&#39;appareil avec 70% (v / v) d&#39;éthanol (voir étape 1.4), en utilisant une seringue stérile de 1 ml à usage unique suivie d&#39;un séchage dans un four à 60 ° C sec O / N (voir étape 1.5) avant l&#39;activation de la surface. </li><li> Exposer la configuration complète d&#39;un microsystème gut-on-a-chip ( à savoir, un corps de l&#39;intestin-on-a-chip relié à un tube) à la lumière UV (253,7 nm) et à l&#39; ozone simultanément pendant 40 min. </li><li> Refroidir l&#39;appareil à température ambiante pendant 15 min sous la lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique (BSC). </li><li> Introduire 100 pi de la couche d&#39;ECM Solution- un mélange de 50 pg / type ml de collagène et un mélange de la matrice extracellulaire 300 pg / ml dilués dans le sans sérum du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) - dans les deux micro-canaux supérieur et inférieur en utilisant un jetable stérile, seringue de 1 ml. </li><li> incubatE l&#39;ensemble de l&#39; installation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 h. </li><li> Dégazer 50 ml de pré-chauffé (37 ° C) au milieu de culture complet (DMEM, 20% v / v de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, aliquotées dans un 3 ml seringue jetable) en utilisant un système de filtration de 50 ml (0,45 um de taille des pores) dans la BSC pendant 1 min. <ol><li> Passez le milieu de pré-chauffé à travers le système de filtration et appuyez doucement sur le milieu filtré pour 1 min pour éliminer les bulles ou gaz dissous dans le milieu. </li></ol></li><li> Placer l&#39;aliquote de milieu complet dégazé dans une seringue jetable de 3 ml et incuber dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure. </li><li> Branchez deux 3 seringues jetables ml contenant dégazé, milieu de culture complet préchauffée à microcanaux supérieure et inférieure. </li><li> Débit du milieu de culture cellulaire complète dégazé dans le microcanal supérieur en utilisant une pompe seringue à la volumétriquetaux de 30 ul / h débit (équivalent à la contrainte de cisaillement à 0,02 dyne / cm 2) dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> Formation de Microengineered Caco-2 Villi dans la puce Gut-on. <ol><li> Utiliser des cellules Caco-2BBE avec le nombre de passage compris entre 50 et 65. </li><li> Cultiver les cellules Caco-2 dans un flacon T75 contenant du milieu de culture complet dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 4-5 jours pour obtenir des cellules confluentes complètement. </li><li> Ajouter 10 ml de Ca 2+ et Mg 2+ -free PBS complètement confluentes cellules Caco-2 cultivées dans un flacon T75, laver les cellules, puis Aspirer PBS. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules dissociées avec 10 ml de milieu de culture cellulaire complet préchauffée (avec du FBS), par pipetage de haut en bas trois à cinq fois. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire par centrifugation à 500 xg pendant 5 min, puis retirez le surnageant. </li><li> Resuspendre à nouveau avec 1 ml préchauffé milieu complet pour ajuster la densité cellulaire à ~ 1,5 x 10 5 cellules / cm2 dans le dispositif. Utiliser hémocytomètre pour estimer la densité cellulaire. </li><li> 100 pi de perfuser les remises en suspension des cellules Caco-2 dans le microcanal supérieur (lumière latérale) en plaçant une seringue jetable de 1 ml fixée à une aiguille 8 25 G5 / sur la sortie d&#39;un tube relié à la partie supérieure microcanal. </li><li> Serrer toutes les entrées et sorties des tubes reliés aux micro-canaux supérieur et inférieur à l&#39;aide de clips de liaison. </li><li> Incuber l&#39;ensemble de l&#39; installation dans un 37 ° C, humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre dissociées cellules Caco-2 à adhérer à la surface de la membrane poreuse. </li><li> Enlever les colliers de serrage et de reprendre l&#39;écoulement du milieu de culture uniquement au microcanal supérieure à 30 ul / h en utilisant une pompe à seringue jusqu&#39;à ce que les cellules forment une monocouche intacte pendant 24-36 h. Utilisez les contras de phaset ou le contraste interférentiel différentiel (DIC) au microscope pour confirmer les jonctions cellule-cellule dans une monocouche cellulaire. </li><li> Lorsque les cellules forment une monocouche, perfuser le milieu de culture dans les deux supérieures (lumen) et inférieure (capillaires) microcanaux au même taux de 30 ul / h débit. </li><li> Application des déformations mécaniques imitant péristaltisme-like motions 5,9. <ol><li> Allumez la pompe à vide équipé du matériel de traction. </li><li> Relier les chambres à vide sur le régulateur de vide par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube avec un raccord en acier inoxydable. </li><li> Réglez le mouvement d&#39;étirement de 10% souche cellulaire moyenne à une fréquence de 0,15 Hz avec le mode de fonction sinus cyclique sur le logiciel de contrôle sous vide, puis cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. </li></ol></li><li> Maintenir le flux constant de milieu de culture (30 ul / h) dans les deux microcanaux supérieure et inférieure à la confluentes Caco-2 monocouche sous déformations mécaniques (10%, 0,15 Hz) pour ~ 100 h. Remarque: cellules Caco-2 Sponsubir tanément villosités morphogenèse avec des projections 3D ondulées étendues vers la lumière du microcanal épithéliale 5,8-10. </li></ol></li><li> Pour émuler les fonctions au niveau des organes de l&#39;intestin humain vivant avec une interface de tissu lumen-capillaire dans l&#39;intestin-on-a-chip 10, suivez les étapes décrites. <ol><li> Cultivez microengineered Caco-2 villosités en répétant les étapes 2,1 à 2,2. </li><li> L&#39;écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) pour les microcanaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h. </li><li> Introduire 100 pi de cellules dissociées normales microvasculaires capillaires endothéliales humaines (les HMVECs, la densité cellulaire finale, ~ 5,0 x 10 5 cellules / cm 2) dans le microcanal inférieure par la méthode décrite dans les étapes identiques de 2.2.3 à 2.2.9. </li><li> Placez un morceau de PDMS rectangulaire durci (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, largeur x longueur x hauteur; 15: 1, w/ w élastomère: agent de durcissement) sur le dessus de l&#39;appareil gut-on-a-chip, puis retournez la configuration de l&#39; ensemble du dispositif à l&#39; envers (ie, le microcanal supérieur fait face à la baisse, et le microcanal inférieur fait face à la hausse). </li><li> Incuber l&#39;installation dans un 37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre HMVECs dissociées à adhérer à la surface de la membrane poreuse dans le microcanal inférieure. </li><li> Prenez toute une installation à partir du CO 2 incubateur, et retourner la configuration à nouveau. </li><li> Écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h, avec des mouvements d&#39;étirement mécanique ( 10%, 0,15 Hz) pendant au moins trois jours pour former des jonctions cellule-cellule endothéliale d&#39;une monocouche. </li></ol></li></ol> 3. Hôte-gut Co-culture microbiome dans un Microdevice Gut-on-a-chip <ol><li> Effectuer pré-culture of les cellules bactériennes comme suit pour co-culture commensal gut microbiome sur les villosités intestinales microengineered. <ol><li> Remettre en suspension le mélange en poudre bactérienne probiotique lyophilisé dans 10 ml de mélange (1: 1, v / v) de lactobacilles autoclavée MRS Broth et clostridium moyenne. </li><li> Ajuster la densité cellulaire finale d&#39;environ 0,2 unités de densité optique (à 600 nm) en y ajoutant quantité appropriée de milieu, puis aliquote de 3 ml de suspension de cellules microbiennes dans un tube stérile jetable de 10 ml. </li><li> Placer les tubes contenant les cellules microbiennes remises en suspension dans le réservoir anaérobie. Ajouter deux paquets de sachets anaérobie produisant du gaz dans le récipient. Fermez le couvercle du récipient bien et incuber la configuration du récipient sans agitation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> Ensemencement des microbiome et co-culture avec des cellules épithéliales intestinales 5,10. <ol><li> Préparer des seringues jetables de 3 ml contenant antibioti dégazéc exempt de milieu de culture cellulaire ( par exemple, du DMEM avec 20% de FBS). Voir 2.1.6 pour la procédure de dégazage du milieu de culture. </li><li> Prenez toute une configuration de l&#39;appareil gut-on-a-chip contenant villosités microengineered du CO 2 incubateur, puis passer à l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Retirer les seringues raccordées à un tube relié à microcanaux supérieure et inférieure. Connecter les seringues préparées 3.2.1 à l&#39;appareil, ramener à l&#39;incubateur à CO 2, alors circuler ce milieu de culture sans antibiotique pendant 12 heures avant l&#39;ensemencement du microbiome. </li><li> Isoler les cellules bactériennes probiotiques pré-cultivées mélange (voir étapes 3.1) à 10.000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant en utilisant le vide, puis remise en suspension dans un milieu DMEM sans antibiotique (densité cellulaire finale, ~ 1,0 x 10 7 UFC / ml). </li><li> Perfuser la suspension cellulaire sur le côté de la lumière du microcanal contenant les villosités intestinales &quot;axéniques&quot; en utilisant une seringue jetable de 1 ml fixée à une 25G5 aiguille / 8. Permettre l&#39;adhérence des cellules microbiennes à la surface apicale des villosités intestinales pendant environ 1,5 heure sans écoulement par serrage à l&#39;ensemble de l&#39;extrémité de la tubulure. </li><li> Perfuser le milieu de culture sans antibiotique préchauffée dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 40 ul / h, avec des déformations cycliques cadencés (10%, 0,15 Hz). </li><li> Pour la co-culture de la protéine de fluorescence verte (GFP) marqué à E. coli (E. coli GFP; non-pathogène DH5-Alpha E. coli hôtes) 10,11 cellules avec villosités microengineered, pré-cultiver GFP E. cellules coli dans un milieu LB autoclave à 37 ° C sous agitation condition (200 rpm) pendant 12 heures. Répétez la procédure à partir de 3.2.5 à 3.2.6 pour mener à bien la co-culture de la GFP E. cellules coli avec villosités microengineered. </li></ol></li><li> Les cellules de l&#39; image 5,8-10 <ol><li> Effectuer DIC, épifluorescence ou balayage laser microscopie confocale pour l&#39; enregistrement microbienne et épithéliales morphologie 5,8,10. <ol><li> Pour l&#39;imagerie DIC, prendre une configuration de microsystème gut-on-a-chip du CO 2 incubateur, placez le réglage de l&#39; appareil sur la scène d&#39;un microscope, puis enregistrer la morphologie cellulaire. </li><li> Pour l&#39;imagerie de fluorescence de villosités épithélium, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules dans 100 ul / h pendant 10 min. <ol><li> Fixer villosités avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 15 minutes. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> Perméabiliser les villosités avec 0,3% (v / v) de Triton X-100 dilué dans du PBS contenant 2% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 10 min. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> des cellules de bloc avec 2% (p / v) de BSA dans une solution PBS pendant 1 heure. Ensuite, l&#39;écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min. </li><li> Ajouter 300 nM de 4 &#39;, dichlorhydrate 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution diluée dans du PBS pour la coloration nucléaire sous la protection de la lumière. </li><li> Ajouter 25 unités / ml de phalloïdine fluorescente(Phalloïdine-CF647 conjugué) dissous dans du PBS pour la coloration F-actine sous la protection de la lumière. </li><li> Enregistrement des images des cellules colorées par fluorescence à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage laser. Note: Un objectif 25X a été appliqué avec zoom optique approprié au cours de la microscopie confocale. La figure 3B, le grossissement d&#39; environ 525X a été utilisé. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>Tremaroli, V., Backhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+the+gut+microbiota+and+host+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.</a> Nature. 489, 242-249 (2012).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiota+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiota in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).</li>
<li>Garrett, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicable+ulcerative+colitis+induced+by+T-bet+deficiency+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system.</a> Cell. 131, 33-45 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).</li>
<li>Huh, D., Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).</li>
<li>Miller, W. G., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+GFP+cloning+cassette+designed+for+prokaryotic+transcriptional+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions.</a> Gene. 191, 149-153 (1997).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15, 745-752 (2015).</li>
<li>Lentle, R. G., Janssen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+digesta+and+their+influence+on+flow+and+mixing+in+the+mammalian+intestine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review.</a> J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).</li>
<li>Granato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-associated+lipoteichoic+acid+acts+as+an+adhesion+factor+for+attachment+of+Lactobacillus+johnsonii+La1+to+human+enterocyte-like+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells.</a> Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+oral+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The human oral microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Hay, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+bacterial+colonisation+of+the+genital+tract+and+subsequent+preterm+delivery+and+late+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage.</a> Br Med J. 308, 295-298 (1994).</li>
</ol>

Donald E. Ingber est l’un des fondateurs d’Emulate Inc., détient des actions de l’entreprise et préside son conseil consultatif scientifique. Les autres auteurs n’ont pas de divulgation financière.

Comprendre les interactions hôte-microbiome est essentiel pour faire avancer la médecine; Cependant, les modèles de culture de cellules traditionnelles réalisées dans une boîte en plastique ou une plaque de puits statique ne prennent pas en charge la co-culture stable de cellules intestinales humaines avec des microbes de l&#39; intestin vivant pendant plus de 1-2 jours parce que les cellules microbiennes envahissent la plupart des cellules de mammifères in vitro. La population microbienne overgrowing consomme ...

L&#39;intestin humain héberge un réseau incroyablement diversifié d&#39;espèces microbiennes (&lt;1.000 espèces) et un très grand nombre de cellules microbiennes (10 fois plus que les cellules hôtes humaines) et des gènes (100 fois plus que le génome humain) 1. Ces microbiomes humains jouent un rôle clé dans le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques, la régulation des réponses immunitaires, et le maintien de l&#39; homéostasie intestinale 2. Sans surprise, compte tenu de ces diverses fonctions, l&#39;intestin microbiome commensal modulant largement la santé et de la maladie 3. Ainsi, la compréhension du rôle des interactions gut microbiome et hôte-microbe sont d&#39; une grande importance pour promouvoir gastro - intestinal (GI) la santé et explorer de nouvelles thérapies pour les troubles intestinaux 4. Cependant, existant dans les modèles in vitro de l&#39; intestin (par exemple, les cultures statiques) limitent la co-culture de l&#39; hôte microbiome à une courte période de temps (&lt;1 jour) parce que les cellules microbiennes et supplantent compromettent la barrière intestinalefonction 5. Modèles animaux de substitution (par exemple, 6 ou génétiquement exempt de germes de souris 7) sont également pas couramment utilisées pour étudier l&#39; hôte-gut microbiome diaphonie parce que la colonisation et l&#39; entretien stable de microbiome intestin humain sont difficiles. Pour relever ces défis, nous avons récemment développé un humain biomimétique &quot;Gut-on-a-Chip&quot; système microphysiological (figure 1A, gauche) pour émuler les interactions microbiome hôte intestin qui se produisent dans l&#39;intestin humain vivant 5,8. Microdispositif intestin sur une puce comporte deux canaux microfluidiques parallèles séparés par une poreuse, une matrice extracellulaire souple (ECM) de membrane revêtu de bordée par épithéliales intestinales humaines Caco-2 cellules, mimant l&#39;interface tissu intestinal lumière capillaire (figure 1A , à droite) 9. déformations rythmiques cycliques entraînée sous vide induisent des déformations mécaniques physiologiques qui imitent les changements normalement induced par péristaltisme (figure 1A, à droite). Fait intéressant, lorsque cellules Caco-2 sont cultivées dans le tube digestif-on-a-chip pendant plus de 100 heures, ils forment spontanément en trois dimensions (3D) villosités intestinales avec des jonctions serrées, les bordures en brosse apicale, les cellules proliférantes limitées à cryptes de base, la production de mucus, augmentation de l&#39; activité médicamenteuse de métabolisation (par exemple, le cytochrome P450 3A4, CYP 3A4), et le glucose amélioré recapture 8. Dans ce microenvironnement &#39;exempt de germes », il était possible de co-culture de la GG Lactobacillus rhamnosus probiotique ou une formation thérapeutique d&#39;un mélange bactérien probiotique avec des cellules épithéliales hôte jusqu&#39;à deux semaines 5,10. Dans cette étude, nous décrivons le protocole détaillé pour effectuer hôte-gut microbiome co-culture dans le dispositif gut-on-a-chip pour une période prolongée. En outre, nous discutons des questions critiques et les défis potentiels à prendre en considération pour une large application de cet hôte-microbiome co-culture protocole.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 25 mM de glucose et 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Réchauffez-le à 37 &deg ; C dans un bain-marie.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS bouillon</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Exécuter l’autoclave à 121 &deg ; C pendant 15 min.</td></tr><tr><td>Poly(diméthylsiloxane)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/p), PDMS : agent de guérison</td></tr><tr><td>Caco-2BBE ligne de carcinome colorectal humain</td><td>Harvard Digestive Disease Center</td><td></td><td>Adénocarcinome colorectal humain&nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS inactivé à la chaleur</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20 % (v/v) dans DMEM</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine-glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Dilution 1/100 dans le</td></tr><tr><td>dichlorhydrate de DMEM 4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole</td><td>Sondes moléculaires</td><td>D1306</td><td>Coloration des noyaux</td></tr><tr><td>Conjugué Phalloidine-CF647 (25 unités/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>Coloration de l’actine F</td></tr><tr><td>Système de tension Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Mouvement de stretcing semblable à celui du péristaltisme (déformation cellulaire de 10 %, fréquence de 0,15 Hz)</td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging,</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage</td> DIC <td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, Fluorescence</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Activation superficielle du</td></tr><tr><td>collagène de type I de</td> la puce intestinale.<td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Composant de matrice extracellulaire pour la culture cellulaire dans la puce</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Composant de matrice extracellulaire pour la culture cellulaire dans la puce</td></tr><tr><td>Seringue jetable de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Matériel d’injection de cellules et de milieux</td></tr><tr><td>25 G Aiguille 5/8</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Matériel d’injection de cellules et de milieux</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Matériel d’injection dans la puce</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>Une formulation de 8 microbes intestinaux commensales différents</td></tr><tr><td>Milieu clostridien renforcé</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Milieu de culture de bactéries anaérobies</td></tr><tr><td>GasPak EZ Système de conteneur anaérobie avec indicateur</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Sachet générateur de gaz anaérobie&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscopie électronique</td> à <td>4 % de paraformaldéhyde</td> Science <td>157-4-100</td><td>Fixation des cellules pour la coloration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Perméabilisation des cellules</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Agent bloquant pour la coloration des cellules</td></tr><tr><td>Traitement corona</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>Générateur de plasma pour la fabrication de la puce</td></tr><tr><td>Steriflip&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Dégazage de l’ensemble du milieu de culture</td></tr><tr><td>Hémocytomètre jetable</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>Pour le comptage manuel des cellules</td></tr></tbody></table>

co-culture de la vie microbiome avec microengineered human intestinal villi dans un gut-on-a-chip microfluidique périphérique

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer à long terme de co-culture de plusieurs espèces microbiome intestinal humain avec villosités intestinales microengineered dans un dispositif humain gut-on-a-chip microphysiological. Nous récapitulons l&#39;interface tissu intestinal lumen-capillaires dans un dispositif microfluidique, où des déformations mécaniques physiologiques et des flux de cisaillement de fluide sont constamment appliquées pour imiter le péristaltisme. Dans le microcanal de la lumière, l&#39;épithélium intestinal Caco-2 sont cultivées des cellules humaines pour former un épithélium villosités &#39;exempt de germes »et régénérer villosités intestinales. les cellules microbiennes cultivées sont pré-inoculées dans le côté de la lumière pour établir un écosystème microbe hôte. Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités, l&#39;écoulement du fluide et des déformations mécaniques sont repris pour produire un microenvironnement état d&#39;équilibre dans lequel le milieu de culture frais est constamment fourni et les bactéries non liées (ainsi que les déchets bactériens) sont continuellement retirés. Après prolongée co-culture fjour de ROM vers semaines, plusieurs microcolonies sont trouvés être situés de façon aléatoire entre les villosités et les deux microbes et les cellules épithéliales restent viables et fonctionnelles pendant au moins une semaine de culture. Notre protocole de co-culture peut être adapté pour fournir une plate - forme polyvalente pour d&#39; autres écosystèmes d&#39;accueil-microbiome qui peuvent être trouvés dans divers organes humains, qui peuvent faciliter étude in vitro du rôle du microbiome humain dans l&#39; orchestration de la santé et de la maladie.

Pour émuler l&#39;intestin écosystème hôte microbiome humain in vitro, il est nécessaire de développer un protocole expérimental pour reconstituer la co-culture stable à long terme des bactéries intestinales et les cellules épithéliales intestinales humaines dans des conditions physiologiques telles que la mécanique péristaltisme-like et l&#39;écoulement du fluide. Ici, nous utilisons un microdispositif biomimétique gut-on-a-chip (Figure 1A)</strong...

Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la croissance des villosités des cellules intestinales humaines sous des mouvements et un écoulement similaires à la péristaltique dans un dispositif microfluidique de type « intestin-sur-puce », ainsi que de montrer comment co-cultiver ces cellules avec un microbiome intestinal vivant. Cette méthode peut donc aider à répondre aux questions clés dans les domaines de la gastro-entérologie, de la microbiologie clinique et des sciences pharmaceutiques, notamment en identifiant les mécanismes des maladies et en validant l'efficacité et la toxicité de nouveaux composés médicamenteux. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent établir in vitro un écosystème viable et fonctionnel du microbiome postérieur de l'intestin humain vivant, en utilisant un système microphysiologique.Les implications de cette technique peuvent s'étendre à des maladies telles que la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, puisque la co-culture stable des cellules de l'hôte avec le microbiome peut reproduire la complexité de ces affections. Bien que cette méthode permette de mieux comprendre les interactions complexes entre le microbio

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Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l'écran de l'efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie de mise en place d’un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions entre des fragments de tissu intestinal de souris et des bactéries intestinales spécifiques. Le dispositif se compose de deux paires de ports d'entrée-sortie, le premier connectant la lumière du tissu intestinal et y fournissant la suspension bactérienne spécifique, et le second fournissant en permanence des fluides aux puits du dispositif pour...

Un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions hôte-microbiote

Ici, nous présentons un protocole de coculture de cellules primaires, de modèles de tissus et de biopsies à l’emporte-pièce dans une puce microfluidique multi-organes pendant une période allant jusqu’à 28 jours. Des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines, des agrégats hépatiques et des biopsies cutanées ont été combinés avec succès dans une circulation de milieu commune.

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

Nous présentons ici un protocole pour cultiver le microbiote intestinal du côlon in vitro, à l’aide d’une série de bioréacteurs qui simulent les conditions physiologiques du tractus gastro intestinal.

Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

neuroHuMiX est un modèle avancé d’intestin sur puce permettant d’étudier les interactions des cellules bactériennes, épithéliales et neuronales dans des conditions de co-culture proximales et représentatives. Ce modèle permet de démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la communication entre le microbiome intestinal et le système nerveux.

Un modèle d’intestin sur puce pour étudier l’axe microbiome intestinal-système nerveux

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

L’intégration d’organoïdes intestinaux canins et d’un système microfluidique Gut-on-a-Chip offre des modèles translationnels pertinents pour les maladies intestinales humaines. Les protocoles présentés permettent la morphogenèse 3D et la modélisation dynamique in vitro de l’intestin, ce qui contribue au développement de traitements efficaces pour les maladies intestinales chez les chiens et les humains avec One Health.

Morphogenèse tridimensionnelle dans l’intestin canin sur puce à l’aide d’organoïdes intestinaux dérivés de patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin

Cet article décrit un protocole de création d’un dispositif de culture microfluidique de vagin sur puce (Vagina Chip) qui permet d’étudier les interactions de l’hôte humain avec un microbiome vaginal vivant dans des conditions microaérophiles. Cette puce peut être utilisée comme outil pour étudier les maladies vaginales ainsi que pour développer et tester des contre-mesures thérapeutiques potentielles.

Modélisation de microenvironnements vaginaux sains et dysbiotiques dans un vagin humain sur puce

Notre protocole détaillé décrit la création et l’utilisation du modèle avancé d’intestin sur puce, qui simule la muqueuse intestinale humaine avec des structures 3D et divers types de cellules, permettant une analyse approfondie des réponses immunitaires et des fonctions cellulaires en réponse à la colonisation microbienne.

Modèle d’intestin sur puce immunocompétent pour l’analyse des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale

Découvrez la co-culture du microbiome intestinal avec des villosités humaines dans un dispositif microfluidique gut-on-a-chip. Cette méthode simule les mouvements péristaltiques pour étudier les interactions hôte-microbe et les maladies gastro-intestinales.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

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