Name: Transplants concurrentiels pour lévaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez l'essai de transplantation compétitive pour évaluer la fitness des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse chez la souris. Cette méthode permet d'étudier l'autorenouvellement sans tri cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous sommes reconnaissants à Roxann Hétu-Arbour pour l&#39;aide à la conception de la figure et la démonstration des procédures. La recherche dans le laboratoire a été soutenu par une bourse de transition de la Fondation Cole, Découverte accorde pas. 419226-2012 du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (FCI Leaders Fund accorde. 31377 pas). KMH est un junior chercheur-boursier du Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité institutionnel de l&#39;éthique animale et de suivre le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux. Note: Pour maintenir des conditions stériles / spécifiques exempts d&#39;agents pathogènes logement, effectuer toutes les procédures impliquant la manipulation directe des souris vivantes à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique ou une hotte à flux laminaire. Nettoyer ou stériliser les cages, les dispositifs de retenue, matériaux de construction, chow et de l&#39;eau fournie aux animaux de manière appropriée. Utilisez, aiguilles jetables seulement stériles pour les injections et pour le prélèvement sanguin. La technique aseptique est crucial lors de la préparation de la greffe. 1. Préparation des souris receveuses <ol><li> Identifier les souris receveuses avec des encoches de l&#39; oreille (ou toute autre méthode approuvée par le comité d&#39;éthique animale locale 8) pour permettre suivi individuel de sang et de moelle osseuse reconstitution périphérique au fil du temps. Peser la souris pour le post-transplantation suivi. Nousbénéficiaires souris e qui sont âgés entre 7 et 12 semaines (moins de 25 g). Remarque: Dans l&#39;exemple fourni, les souris receveuses CD45.1 + CD45.2 + ont été élevés dans la maison en traversant C57BL / 6 souris avec des souris B6.SJL congéniques. </li><li> Irradiation souris receveuses avec deux doses de 450 rad pour détruire l&#39;activité hématopoïétique. Donner la première dose le jour avant la transplantation et la seconde 1-2 heures avant la transplantation. Remarque: les rayons X ou gamma-ray peuvent tous deux être utilisés en fonction de la disponibilité des installations appropriées. </li></ol> 2. Préparation des donateurs et des concurrents des cellules de moelle osseuse <ol><li> Euthanasier donneur (test et de contrôle; CD45.2 +) et concurrent (CD45.1 +; B6.SJL) souris par asphyxie au CO2 suivie par dislocation cervicale ou à l&#39; aide de méthodes approuvées par le comité d&#39;éthique animale locale. </li><li> Placez la souris sur leur dos, les jambes grandes ouvertes, dans une boîte de Pétri vide ou sur une gaze stérile (pour garder la surface de travail propre) iNside une enceinte de sécurité biologique. Mouiller la peau et de la fourrure avec 70% d&#39; éthanol / 30% H 2 O (v / v). </li><li> Coupez le pied avec une lame chirurgicale ou des ciseaux pointus. Découper la peau le long de la jambe et se détacher de la peau à l&#39;aide de pinces dentelées. Coupez l&#39;excès de muscle. </li><li> Disloquer fémur en tirant sur l&#39;os de la jambe et à l&#39;aide lames de ciseaux contre les os du bassin comme une force contre. Détachez tibia et du fémur de la rotule et retirer bits restants du muscle et les tendons. Placez les os dans 2-3 ml stérile tampon phosphate salin (PBS) dans une plaque de culture de tissus à 6 puits. </li><li> Recueillir les cellules de la moelle osseuse en rinçant les os avec 5 ml de PBS stérile. <ol><li> Maintenir l&#39;os doucement avec des forceps et insérer une aiguille de 25 G attachée à une seringue de 1 ml rempli à une extrémité de l&#39;os. Appuyez sur le piston et recueillir les cellules dans un tube de 15 ml conique. Répéter au besoin jusqu&#39;à ce que le centre de l&#39;os est blanc. </li></ol></li><li> Dissocier les cellules par passage répété à travers l&#39;aiguille àobtenir une suspension cellulaire unique. Éviter les bulles et une force excessive. Remarque: Utilisez une aiguille légèrement plus grand (22 G) pour améliorer la viabilité des cellules à cette étape. </li><li> Passez les cellules à travers un tamis en nylon de 70 pm pour assurer la suspension cellulaire uniforme et pour éliminer les débris et les grumeaux. </li><li> Retirer une aliquote pour le comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C. Réajuster la densité cellulaire comme requis dans du PBS stérile (10 8 cellules / ml). Gardez les cellules sur la glace. </li></ol> 3. L&#39;établissement d&#39;équivalents HSC cellulaires des donateurs <ol><li> Transférer l&#39;équivalent de 3 x 10 6 cellules (30 ul) dans 5 ml tube rond en polystyrène de fond pour la coloration par cytométrie en flux. Ajouter un volume égal d&#39;anticorps non marqué contre le CD16 / CD32 pour bloquer la coloration non spécifique (dilué dans du tampon de coloration (PBS additionné de 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 1 mM d&#39;EDTA) pour obtenir une concentration finale de 2,5 pg / ml). Incuber 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 90 ul mélange maître d&#39;anticorps conjugué à un fluorochrome préparé dans un tampon de coloration: cocktail Lineage biotinylé (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incuber sur la glace pendant 30 min, à l&#39;abri de la lumière. Note: Des dilutions appropriées doivent être déterminées pour chaque lot d&#39;anticorps. Voir le tableau des matériaux pour les dilutions utilisées dans cette étude. </li><li> Ajouter 2 ml tampon de coloration à cellules, vortex et centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer l&#39;anticorps non lié. Décanter le surnageant et remettre le culot en tapotant. </li><li> Ajouter 10 ul fluorochrome conjugué streptavidine dilué dans du tampon de coloration (voir tableau des matériaux). Incuber sur la glace pendant 20 min, à l&#39;abri de la lumière. Laver comme à l&#39;étape 3.3 pour éliminer la streptavidine non liée. </li><li> Acquérir des échantillons de cellules en utilisant un cytomètre de flux comportant au moins six détecteurs 9. Déterminer la fréquence de Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 <sup&gt; + cellules (estimation CSH) dans chaque échantillon en utilisant le modèle d&#39;analyse présentés dans la figure 2 et comme précédemment rapporté 10,11. Note: La fréquence des CSH fonctionnelles au sein de cette population peut être estimée entre 1/3 et 1/5 2,12. </li><li> Établir des équivalents HSC estimées pour tous les 11 échantillons, en utilisant un échantillon (typiquement, le compétiteur B6.SJL CD45.1 + dans cet exemple) sous forme de base comme indiqué ci - dessous et sur ​​la figure 2. <ol><li> Calculer le nombre de cellules nécessaires en utilisant les formules suivantes: #transplanted CSH / recipient = 5 x 10 5 cellules x fréquence HSC estimée (tel que déterminé pour l&#39; échantillon de référence; ce nombre est généralement comprise entre 75 et 125 pour type sauvage C57BL / 6) 10-12. Note: Dans la figure 2, pour l&#39; échantillon A, le résultat est de 139 CQH. cellules au total (n transplanté pour les autres échantillons, par exemple , l&#39; échantillon B de la figure 2) = # transplanté fréquence CSH / HSC. Note: Dans la figure 2, pour l&#39; échantillon B, le résultat est 197826 (soit environ 2 x 10 5) des cellules totales de la moelle osseuse. </li></ol></li><li> Calculer les nombres totaux de cellules requises pour receveur de greffe pour chaque échantillon en utilisant les résultats obtenus ci-dessus. Remarque: Ce nombre devrait être de 5 x 10 5 pour l&#39;échantillon de référence (concurrent). <ol><li> Multiplier le nombre obtenu à l&#39;étape 3.7 par le nombre de souris receveuses et ajouter suffisamment de cellules pour au moins deux souris supplémentaires pour compenser le volume mort dans la seringue. </li></ol></li><li> Mélanger concurrent (par exemple, CD45.1 +) et les cellules de test (CD45.2 de +) en rapport 1: 1 équivalent HSC tel que calculé à l&#39; étape 3.6 et ajuster le volume final de 200 pi par injection à l&#39; aide de PBS stérile. Remarque: Pour un groupe de cinq souris receveuses le volume proposé serait donc au moins 1,4 ml, contenant 3,5 x 10 cellules de moelle osseuse 6 concurrents (ou973 CQH estimés pour l&#39; échantillon A de la figure 2), et le nombre équivalent de cellules de test (figure 2, l&#39;équivalent pour l&#39; échantillon B , il est 197,826 x 7 = 1,384,782 cellules de moelle osseuse). </li></ol> 4. Greffes de moelle osseuse <ol><li> Réchauffez les souris receveuses irradiées à l&#39;étape 1.2 avec une lampe chauffante rouge pour assurer la dilatation des vaisseaux sanguins et de faire la queue latérale veines plus visibles. </li><li> Préparer une seringue à tuberculine de 1 ml munie d&#39;une aiguille 27 G (ou plus petit). Aspirer environ 750 ul de la suspension cellulaire préparée (pour les souris receveuses 3). Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans la seringue. </li><li> Insérez la souris dans un dispositif de retenue. Examinez la queue et chercher les veines caudales latérales qui doivent être clairement visibles sur les deux côtés de la queue. Essuyez le site d&#39;injection avec de l&#39;éthanol. Insérez l&#39;aiguille biseau vers le haut, parallèlement à la peau et appuyez doucement sur le piston. L&#39;injection doit être facile. Si la force est recessaires, l&#39;aiguille se trouve pas dans la veine. Remarque: les souris âgées ont une peau plus épaisse, ce qui peut permettre de trouver la veine plus difficile. Si l&#39;aiguille est dans la veine, réinsérer l&#39;extrémité proximale de l&#39;aiguille au site d&#39;injection. </li><li> Retirez l&#39;aiguille et appuyez sur le site d&#39;injection avec de la gaze stérile pendant quelques secondes pour arrêter le saignement. Transférer la souris dans une cage propre. Remarque: Utilisez la même seringue et une aiguille pour trois injections, après quoi l&#39;aiguille peut devenir trop terne. </li><li> Pour la post-transplantation suivi, injecter 1 ml sous-cutanée PBS stérile pour réhydrater la souris pour les cinq premiers jours. Ajouter des antibiotiques dans l&#39;eau potable pour prévenir les infections (si nécessaire, en option). Peser les souris tous les deux à trois jours pour les trois premières semaines et euthanasier les souris qui ont perdu plus de 15-20% de leur poids corporel pré-transplantation (ou tel que déterminé par le comité d&#39;éthique animale locale). </li></ol> 5. Analyse du sang périphérique <ol><li> Récupérer une goutte de sang (unpprox. 50-100 ul) dans des tubes EDTA. <ol><li> Pour recueillir le sang de la veine mandibulaire, utilisez une lancette ou une aiguille de 22 G pour percer la peau du visage près de l&#39;endroit glabre situé sous la mâchoire et placer le tube collecteur pour recevoir la goutte de sang 13. Recueillir le sang à 4, 8, 12 et 16 semaines après la transplantation à suivre multi-lignée reconstitution. </li></ol></li><li> Ajouter 1 ml fraîchement préparée RT lyse des globules rouges tampon (9 parties 0,16 M NH4CI + 1 partie de 0,17 M de Tris-HCl , pH 7,65) à la goutte de sang recueilli dans l&#39; étape 5.1.1. Mélanger l&#39;échantillon et de transfert vers un 5 ml tube en polystyrène à fond rond adapté pour cytométrie en flux. Laisser reposer pendant 4 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 4 volumes de PBS glacé. Mélanger en mettant bout à bout et transférer immédiatement sur de la glace. Centrifugeuse 10 min à 200 xg à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot en tapotant. Surnageant doit être clair et rouge. Ajouter 2 ml de coloration tampon et vortex brièvement. Centrifugeuse 5 min à 200 xgat 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot en tapotant. </li><li> Procéder à la coloration de cytométrie de flux en utilisant le protocole général décrit dans les étapes 3.1 à 3.3 et les anticorps suivants pour le mélange maître: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1. </li><li> Acquérir des échantillons de cellules en utilisant un cytomètre de flux comportant au moins six détecteurs 9. Déterminer la fréquence des cellules dérivées du donneur pour chaque lignée (lymphocytes B CD19 +, les lymphocytes T CD3e +, GR1 granulocytes lumineux) dans chaque échantillon en utilisant le modèle d&#39;analyse présentée dans la figure 3 et que publiée 10,11. </li></ol> 6. Analyse de la moelle osseuse Reconstitution <ol><li> Recueillir les cellules de moelle osseuse comme décrit dans la section 2. Colorer les cellules pour cytométrie de flux utilisant le protocole général décrit dans les étapes 3.1 à 3.3 et les anticorps suivants pour le mélange maître: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Détecter linEAGE anticorps cocktail en utilisant fluorochrome conjugué streptavidine comme décrit à l&#39;étape 3.4. </li><li> Acquérir des échantillons de cellules en utilisant un cytomètre de flux comportant au moins huit détecteurs 9. Si seulement six sont disponibles, ajoutez CD135 sur le même canal que le panneau de la lignée que CD135 + cellules seront exclues. Déterminer la fréquence de Lin donateurs dérivés - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + CSH dans chaque échantillon en utilisant le modèle d&#39;analyse présentée dans la figure 4 et tel que publié 10. </li></ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole décrit ici est conçu pour évaluer l&#39;aptitude relative des donateurs (test) CSH contre concurrent connu CSH. La situation de la concurrence augmente la sensibilité relative de l&#39;essai (plus susceptibles de détecter des baisses modérées dans la condition physique des cellules souches) et fournit un contrôle technique interne pour l&#39;efficacité de l&#39;irradiation et de l&#39;injection. Cependant, il ne doit pas être utilisé comme une mesure absolue de HSC remise en forme; une diminution de la reco...

Hématopoïèse est un processus de régénération qui assure la reconstitution des cellules sanguines qui ont été perdus à cause de blessures, le rayonnement et la mort cellulaire. Ce procédé est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (HSC) qui résident en grande partie dans la moelle osseuse adulte. En outre, les cellules souches hématopoïétiques peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques dans les maladies auto - immunes, des affections malignes hématologiques et de déficiences immunitaires 1. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la fonction HSC, y compris leur expansion proliférative et leur capacité à atteindre et engraft l&#39;os receveur après la greffe osseuse. Bien que des études récentes ont rapporté plusieurs marqueurs de surface cellulaire, y compris les membres de la famille SLAM CD150 et CD48, pour enrichir prospectivement CSH adultes et CSH fœtales à environ 50% de pureté 2-4, la mesure standard d&#39;or pour CSH fonctionnelle reste un test repeupler in vivo déterminer leur capacité à rétablir le sang cproduction ell dans un hôte irradié 5. L&#39;essai de repopulation clonale in vivo a été initialement développé par Till et McCulloch 6 et a depuis été affiné et étendu. Comme défini à l&#39;origine, les CSH assurer la production de cellules sanguines à vie grâce à l&#39;auto-renouvellement et la différenciation. Le transfert de CSH dans un destinataire irradié nous permet donc d&#39;évaluer: leur capacité à se différencier grâce à l&#39;analyse des différentes lignées de cellules sanguines (lymphocytes T, les lymphocytes B, les granulocytes, les monocytes) et leur capacité d&#39;auto-renouvellement par la transplantation de série. L&#39;essai devrait normalement impliquer la comparaison de la fonctionnalité et / ou de la quantité de deux populations de CSH, par exemple, les cellules provenant de deux souris de différents génotypes ou des cellules qui ont été traitées ou non traitées avec différents facteurs qui pourraient influer sur le maintien ou l&#39; expansion de CSH en culture. chimérisme du donneur, ou la contribution des donateurs transférés CSH to la production de cellules sanguines peut alors être déterminée par analyse par cytométrie de flux dans le sang périphérique et la moelle osseuse en utilisant des marqueurs de surface cellulaire ou d&#39;autres méthodes qui permet de distinguer les cellules du donneur dans le receveur, ou l&#39;hôte. Les marqueurs les plus utilisés sont certainement les deux allèles du gène PTPRC ou de l&#39; antigène CD45 leucocytaire 7 que nous avons choisi pour les exemples fournis ci - dessous. L&#39;essai de repopulation clonale peut être soit concurrentiel ou non concurrentiel. Dans un contexte non compétitif, CQH de contrôle et de test sont transférés dans des souris receveuses distinctes et les résultats pour chaque type de cellule est indépendant de l&#39;autre. Dans un contexte concurrentiel, la fonction des deux essais et de contrôle CSH est mesuré par rapport à une population de concurrent CSH. Le protocole décrit ici utilise le paramètre concurrentiel, mais peut également être adapté pour les situations non concurrentielles. Les deux approches ont leurs avantages et leurs limites, et nous allons les comparer en détail dans lediscussion. Nous décrivons également des approches différentes pour assurer l&#39;équité dans le nombre de transplantés CSH, expliquer comment adapter le dosage pour la quantification des CSH en limitant essai de dilution (LDA), et de fournir des exemples des deux greffes réussies ou non pour l&#39;interprétation des résultats.

<table><tbody><tr><td>Tubes microtainers avec K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de 20 G</td><td>BD Seringue</td><td></td><td>Pour le prélèvement sanguin de la veine mandibulaire</td></tr><tr><td>Rôtissoire LabQuake Shaker</td><td>Thermo&nbsp ; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris purifié CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>CD3e anti-souris conjugué à Pe-Cy7 (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>anti-souris conjugué au PE CD19 (clone 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (équivalent APC-Cy7) anti-souris GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>FITC-conjugué anti-souris CD45.1 (clone A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-conjugué anti-souris CD45.2 (clone 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anti-humain biotinylé/souris CD45R (B220) (clone RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Anti-souris biotinylé TER119 (clone TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidine</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0,5 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>anti-souris conjugué au PE CD117 (clone 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0,25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Ly6A/E (Sca1) (clone D7) (clone D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0,25 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-conjugué anti-souris CD135 (clone A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-conjugué anti-souris CD150 (clone TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &mu ; g/ml
BD Biosciences et eBioscience ne proposent pas le même clone</td></tr> : <tr><td>seringue à tuberculine de 1 ml avec aiguille de 27 G</td>, <td>seringue BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>seringue de tuberculine de 1 ml avec aiguille de 25 G</td>, <td>seringue BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; crépine à cellules m</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

transplants concurrentiels pour l&#39;évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

La définition de référence d’une cellule souche hématopoïétique (CSH) est une cellule qui, lorsqu’elle est transférée dans un receveur irradié, aura la capacité de rétablir la production de cellules sanguines pendant toute la durée de vie du receveur. Ce protocole explique comment mettre en place un test fonctionnel pour comparer les capacités des CSH de deux populations différentes de cellules, comme la moelle osseuse de souris de deux génotypes différents, et comment analyser les souris receveuses par cytométrie en flux. Le protocole utilise des équivalents HSC plutôt que le tri cellulaire pour la normalisation et discute des avantages et des inconvénients des deux approches. Nous discutons plus en détail des différentes variantes du protocole de base, y compris les greffes en série, les tests de dilution limitante, les tests de retour à l’origine et les transplantations non compétitives, y compris les avantages et les utilisations préférées de ces approches variées. Ces tests sont essentiels pour l’étude de la fonction des CSH et pourraient être utilisés non seulement pour l’étude des aspects intrinsèques fondamentaux des CSH de la biologie, mais aussi pour le développement de tests précliniques pour la greffe de moelle osseuse et l’expansion des CSH en culture.

Une description générale de la mise en transplantation concurrentielle, y compris les greffes secondaires (voir plus loin) peut être trouvée dans la figure 1. Une analyse représentative pour l&#39; os pré-greffe osseuse CSH peut être trouvée dans la figure 2. Des informations plus détaillées sur l&#39;exclusion des doublets et les cellules mortes peuvent être trouvées ailleurs 9. Le...

Ce protocole fournit des directives étape par étape pour la mise en place d’expériences compétitives de greffe de moelle osseuse de souris afin d’étudier la fonction des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques sans purification préalable des cellules souches par tri cellulaire.

Transplants concurrentiels pour l&#39;évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

L'objectif général de cette expérience est de déterminer la capacité de survie des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse in vivo à l'aide d'un test de greffe compétitive. Cette méthode permet donc de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie des cellules souches et de la transplantation de cellules hématopoïétiques, notamment sur l'impact de diverses manipulations sur l'auto-renouvellement des cellules souches après greffe. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle nécessite un nombre limité d'animaux et qu'elle ne fait pas appel au tri cellulaire.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction des cellules souches, elle peut également être utile dans d'autres domaines tels que l'immunologie, grâce à l'utilisation de chimères mixtes de moelle osseuse. Le développement initial de cette technique dans les années 1960 a permis aux chercheurs du domaine de la biologie des cellules souches d'explorer l'identité et la fonction des cellules souches hématopoïétiques chez l'homme et la souris. La procédure sera démontrée par Roxanne Hetu-Arbour, étudiante à la maîtrise dans le laboratoire, et Edward Owusu Kwar

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce manuscrit fournit une description de la méthodologie utilisée pour établir des modèles murins de transduction-transplantation. Un compte rendu détaillé est donné des erreurs techniques à éviter lors de la réalisation de greffes de moelle osseuse. Il faut bien comprendre l’importance d’un titre viral élevé, de la transfection/transduction et de l’irradiation.

Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.

Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Ce protocole permet le maintien des cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes in vitro en imitant le microenvironnement de moelle en utilisant des acides gras abondants, le cholestérol, des concentrations plus faibles de cytokines, et l’hypoxie.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Ce protocole décrit l’injection intrafémorale de quelques cellules souches hématopoïétiques ou leucémiques, y compris des cellules génétiquement modifiées, dans des modèles murins de xénogreffes, ce qui permettra non seulement une transplantation rapide et sûre de cellules, mais aussi des analyses en série de la moelle osseuse.

Des injections intrafémorales simplifiées à l’aide de souris vivantes permettent une analyse continue de la moelle osseuse

Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.

Injection intrafémorale de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéprimées 

Ici, nous présentons un protocole qui intègre la technologie CRISPR/Cas9 avec le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour identifier les gènes candidats qui sont cruciaux pour la capacité de prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices.

Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Découvrez l'essai de transplantation compétitive pour évaluer la fitness des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse chez la souris. Cette méthode permet d'étudier l'autorenouvellement sans tri cellulaire.

Transplants concurrentiels pour l'évaluation des cellules souches hématopoïétiques de remise en forme

Explorer plus de vidéos