Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of Drosophila Dans un Olfactométre quatre quadrants

L’objectif global de cette configuration est d’analyser les comportements olfactifs des mouches dans un olfactomètre à quatre quadrants à l’aide d’un script logiciel de suivi automatisé des mouches fourni. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les systèmes neuronaux olfactifs détectent le monde extérieur et sur la façon dont le cerveau décode et oriente les décisions comportementales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est polyvalente et robuste, et qu’elle permet de tester à plusieurs reprises les réponses olfactives d’une population de mouches dans une vaste arène expérimentale.

Pour ce protocole, préparez cinq chambres odorisantes composées d’un récipient extérieur en plastique, d’un récipient intérieur en verre et d’un couvercle en PTFE sur mesure. L’insert est un couvercle de récipient d’origine dont la partie centrale a été retirée et deux vannes unidirectionnelles fixées. Utilisez quatre des chambres d’odorisant pour le contrôle des solvants et une chambre pour un odorisant d’essai.

Assurez-vous que chaque chambre est propre, puis chargez un récipient odorant avec un millilitre de dilution de solvant ou d’odorant. Ensuite, vérifiez la position du récipient dans la chambre en plastique et assurez-vous qu’aucun liquide n’a été renversé. Fixez le couvercle à l’aide du bouchon à vis et d’un joint torique sur l’insert en PTFE pour éviter les fuites.

Élevez les mouches sur un milieu de semoule de maïs standard. Dans une bouteille standard, placez 30 mâles et 30 femelles, et laissez pondre les œufs pendant cinq jours à température ambiante. À partir de ces bouteilles, collectez les mouches nouvellement enfermées.

Pour chaque cohorte expérimentale, prélever 25 mouches mâles et 25 mouches femelles sous une brève anesthésie au dioxyde de carbone et laisser la cohorte vieillir sur un milieu anti-mouches standard pendant deux à quatre jours. 40 à 42 heures avant l’expérience, transférez la cohorte dans un flacon contenant environ 10 millilitres de gel d’agarose à un pour cent pour l’humidité sans nourriture. La famine aide à augmenter l’ensemble du mouvement, et plus de 90 % des mouches devraient survivre au processus de famine.

Si plus de 10 % meurent, ce qui peut se produire dans un génotype faible, essayez d’utiliser une famine d’un jour pour toutes les mouches de l’expérience. Au moins cinq minutes à l’avance, allumez le régulateur de température et réglez-le sur 25 degrés Celsius. Ensuite, connectez les chambres odorantes à l’arène via un tube en plastique.

Vérifiez le débit d’air dans chaque quadrant de l’arène à l’aide d’un débitmètre électronique. Assurez-vous que les flux d’air de contrôle et d’odorisant fonctionnent tous deux à 100 millilitres par minute. Les mouches sont très sensibles au flux d’air, et il est essentiel que le flux d’air pour chaque quadrant soit vérifié avant chaque expérience.

Maintenant, nettoyez l’arène et les plaques de verre avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez toutes les pièces deux à trois fois et laissez-les sécher complètement à l’air libre avant de continuer. Ensuite, fixez les plaques de verre à l’arène.

Ensuite, transférez les mouches dans l’arène sans anesthésie. En utilisant la gravité, laissez-les entrer par le trou de l’une des plaques de verre, puis couvrez le trou avec un treillis circulaire. Maintenant, placez l’arène chargée à la mouche dans la chambre étanche à la lumière.

Ensuite, connectez les quatre flux d’air de contrôle à chaque coin de l’arène. Fermez la porte de la chambre et laissez les mouches s’acclimater au nouvel environnement pendant 10 à 15 minutes. Après la période d’acclimatation, exécutez une expérience de contrôle de cinq à dix minutes au cours de laquelle les mouches sont exposées à quatre courants d’air témoins.

Il est essentiel d’analyser les données immédiatement. Si les mouches ne sont pas réparties uniformément dans l’arène, l’arène doit être réinitialisée. Il est essentiel de tester le comportement des mouches témoins pour purifier l’air.

Cela permettra de vérifier rapidement que toutes les conditions d’arrière-plan sont normales. Une fuite de lumière, un déséquilibre de température, une arène inclinée ou une contamination par une odeur peuvent tous causer des problèmes. Si nécessaire, jetez les mouches et nettoyez à nouveau l’arène.

Si une contamination par un odorant est suspectée, remplacez tous les tubes. Continuez à répéter l’essai de contrôle avec de nouvelles cohortes jusqu’à ce que les animaux ne montrent aucune préférence pour l’un ou l’autre des quatre quadrants. Ensuite, connectez la chambre d’essai à l’odorisant à l’installation à l’aide d’une vanne à trois voies, ou reconnectez le tube et exécutez une expérience de test pendant cinq à 10 minutes.

Pour des enregistrements expérimentaux plus longs, arrêtez et redémarrez rapidement le programme de suivi toutes les 20 minutes, sinon les fichiers de données seront trop volumineux. Entre les tests, jetez les mouches, nettoyez l’arène et les plaques de verre avec de l’éthanol à 70 % et remplacez les tubes de connexion. Gardez le flux d’air sec pour rincer continuellement le système.

Pour plus d’efficacité, il est bon d’avoir deux arènes pour que le nettoyage puisse être effectué pendant les courses. Si plusieurs expériences sont fausses le même jour, faites très attention à ce qu’il ne reste aucune odeur dans le système d’une exécution précédente. Ce n’est normalement pas un problème avec de faibles concentrations d’odorant ou de CO2, mais pour des stimuli très concentrés, un intervalle allant jusqu’à 24 heures entre les expériences peut être nécessaire.

Pour l’analyse des données, utilisez la routine Matlab personnalisée fournie pour convertir les données au format Matlab. Chargez le fichier de données brutes réalisé en temps réel par le logiciel de suivi, et créez un masque spatial qui suit les contours de l’arène. Appliquez le masque aux données brutes pour supprimer tous les points de données qui se trouvent à l’extérieur de l’arène, car ils représentent du bruit.

Ensuite, supprimez tous les points de données qui se déplacent à moins de 0,163 centimètre par seconde pendant plus de trois secondes. Ces données sont susceptibles d’être du bruit ou des mouches immobiles. Maintenant, visualisez les points de données restants en les traçant tous sur les périodes d’enregistrement.

Les données peuvent également être considérées comme des trajectoires uniques. Les limites d’odeur peuvent être rapidement estimées sur la base des données comportementales des mouches. Ensuite, calculez l’indice d’attraction et effectuez des tests statistiques comme décrit dans le protocole texte.

25 mouches mâles et 25 mouches femelles ont été testées dans l’appareil comportemental. En réponse à l’air sec, les mouches ont exploré toute l’arène sans préférence pour un quadrant. La ligne montre la trajectoire suivie d’une mouche.

Lorsque le vinaigre de cidre de pomme a été introduit dans le flux d’air du quadrant supérieur gauche, la plupart des mouches ont été attirées par ce quadrant d’odeur. Lorsqu’un odorisant répulsif, le propionate d’éthyle à 10 %, a été introduit dans le quadrant supérieur gauche, ce dernier a été évité. L’indice attractif de ce quadrant a obtenu un score de 0,68.

Un indice attractif est l’indice le plus utilisé dans la mesure de la réponse olfactive. Une valeur supérieure ou inférieure à zéro indique une attraction ou une répulsion. Le script compensait les légères variations de position de l’arène entre les essais.

Les points de données qui auraient pu être du bruit ou des mouches immobiles ont été supprimés. Bien que le test puisse être exécuté pour n’importe quelle durée, il est intéressant de voir les changements dans les mouvements de la cohorte sur des groupes de 10 secondes pour apprécier l’accoutumance aux odeurs et d’autres phénomènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exécuter et d’analyser efficacement les comportements olfactifs dans un test à quatre champs.

Une fois maîtrisée, chaque expérience olfactive peut être réalisée en une heure environ, et nous effectuons régulièrement quatre à six expériences au cours d’une journée.