Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of

L'objectif général de ce dispositif est d'analyser les comportements olfactifs de mouches dans un olfactomètre à quatre quadrants à l'aide d'un script fourni de suivi automatisé des mouches. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles sur la manière dont les systèmes neuronaux olfactifs perçoivent le monde extérieur, et sur la façon dont le cerveau décode et oriente les décisions comportementales. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est polyvalente et robuste, et permet de répéter les tests de réponses olfactives par une population de mouches dans un grand espace expérimental.

Pour ce protocole, préparez cinq chambres à odeurs composées chacune d'un récipient extérieur en plastique, d'un récipient intérieur en verre et d'un bouchon intermédiaire en téflon (PTFE) sur mesure. Ce bouchon est un couvercle d'origine dont la partie centrale a été retirée et auquel sont fixées deux valves à sens unique. Utilisez quatre de ces chambres à odeurs comme témoins de solvant, et une chambre pour l'odeur test.

Vérifiez que chaque chambre est propre, puis chargez un récipient d’arôme avec un millilitre de solvant ou de dilution d’arôme. Ensuite, vérifiez la position du récipient dans la chambre en plastique et assurez-vous qu’aucun liquide ne s’est renversé. Fixez le couvercle à l’aide du bouchon vissé et d’un joint torique sur l’insert en PTFE afin d’éviter toute fuite.

Élever les mouches sur un milieu standard à base de farine de maïs. Dans un flacon standard, placer 30 mâles et 30 femelles, et laisser les œufs être pondus pendant cinq jours à température ambiante. À partir de tels flacons, collecter les mouches nouvellement écloses.

Pour chaque cohorte expérimentale, collecter 25 mouches mâles et 25 mouches femelles sous une brève anesthésie au dioxyde de carbone et laisser la cohorte vieillir sur un milieu standard pour mouches pendant deux à quatre jours. Entre 40 et 42 heures avant l'expérience, transférer la cohorte dans un flacon contenant environ 10 millilitres de gel d'agarose à un pour cent pour assurer l'humidité sans nourriture. La privation de nourriture permet d'augmenter l'activité motrice globale, et plus de 90 % des mouches devraient survivre au processus de jeûne.

Si plus de 10 % meurent, ce qui peut arriver avec un génotype faible, essayez d'appliquer une privation de nourriture d'une journée à toutes les mouches de l'expérience. Au moins cinq minutes à l'avance, allumez le régulateur de température et réglez-le à 25 degrés Celsius. Ensuite, reliez les chambres à odeur à l'arène à l'aide d'un tube en plastique.

Vérifiez le débit d'air dans chaque quadrant de l'arène à l'aide d'un débitmètre électronique. Assurez-vous que les flux d'air de contrôle et d'agent odorant fonctionnent tous deux à 100 millilitres par minute. Les mouches sont très sensibles au débit d'air, et il est essentiel de vérifier le débit d'air de chaque quadrant avant chaque expérience.

Nettoyez maintenant l'arène et les plaques de verre à l'aide d'éthanol à 70 %. Essuyez toutes les pièces deux à trois fois et laissez-les sécher complètement à l'air avant de poursuivre. Ensuite, fixez les plaques de verre à l'arène à l'aide de pinces.

Ensuite, transférez les mouches dans l'arène sans anesthésie. À l'aide de la gravité, laissez-les entrer par le trou dans l'une des plaques de verre, puis recouvrez le trou avec une maille circulaire. Placez maintenant l'arène chargée de mouches dans la chambre étanche à la lumière.

Ensuite, connectez les quatre flux d'air de contrôle à chaque coin de l'arène. Fermez la porte de la chambre et laissez les mouches s'acclimater au nouvel environnement pendant 10 à 15 minutes. Après la période d'acclimatation, effectuez une expérience témoin de cinq à dix minutes au cours de laquelle les mouches sont exposées à quatre flux d'air de contrôle.

Il est essentiel d'analyser immédiatement les données. Si les mouches ne sont pas uniformément réparties dans l'arène, celle-ci doit être réinitialisée. Il est crucial de tester le comportement des mouches témoins exposées uniquement à de l'air pur.

Cela permettra rapidement de vérifier que toutes les conditions ambiantes sont normales. Une fuite de lumière, un déséquilibre thermique, une arène inclinée ou une contamination par des odeurs peuvent tous causer des problèmes. Si nécessaire, éliminez les mouches et nettoyez à nouveau l'arène.

Si une contamination par un odorant est suspectée, remplacez tous les tubes. Continuez à répéter le test témoin avec de nouveaux lots jusqu'à ce que les animaux ne montrent aucune préférence pour l'un des quatre quadrants. Ensuite, connectez la chambre d'odorant de test au dispositif à l'aide d'un robinet à trois voies, ou reconnectez les tubes et effectuez une expérience de test pendant cinq à dix minutes.

Pour des enregistrements expérimentaux plus longs, arrêtez et redémarrez rapidement le programme de suivi toutes les 20 minutes, sinon les fichiers de données seront trop volumineux. Entre les tests, éliminez les mouches, nettoyez l'arène et les plaques de verre avec de l'éthanol à 70 %, puis remplacez les tubes de connexion. Maintenez un flux d'air sec afin de purger continuellement le système.

Pour des raisons d'efficacité, il est conseillé d'avoir deux arènes afin de permettre le nettoyage pendant les expériences. Si plusieurs expériences sont réalisées le même jour, veillez particulièrement à ce qu'aucune odeur résiduelle d'un essai précédent ne persiste dans le système. Ce problème est généralement négligeable avec de faibles concentrations d'odeur ou avec le CO2, mais pour des stimuli fortement concentrés, un intervalle pouvant atteindre 24 heures entre deux expériences peut être nécessaire.

Pour l'analyse des données, utilisez la routine Matlab sur mesure fournie afin de convertir les données au format Matlab. Chargez le fichier de données brutes généré en temps réel par le logiciel de suivi, puis créez un masque spatial qui suit les contours de l'arène. Appliquez ce masque aux données brutes pour supprimer tous les points de données situés en dehors de l'arène, car ils représentent du bruit.

Ensuite, supprimez tous les points de données qui se déplacent à moins de 0,163 centimètre par seconde pendant plus de trois secondes. Ces données sont probablement du bruit ou correspondent à des mouches immobiles. Visualisez maintenant les points de données restants en les traçant tous au cours des périodes d'enregistrement.

Les données peuvent également être visualisées sous forme de trajectoires individuelles. Les limites de l'odeur peuvent être rapidement estimées à partir des données comportementales des mouches. Ensuite, calculez l'indice d'attraction et effectuez les tests statistiques comme décrit dans le protocole textuel.

25 mouches mâles et 25 mouches femelles ont été testées dans l'appareil comportemental. En réponse à de l'air sec, les mouches ont exploré toute l'arène sans préférence pour un quadrant particulier. La ligne indique la trajectoire suivie par une mouche.

Lorsque du vinaigre de cidre a été introduit dans le flux d'air du quadrant supérieur gauche, la majorité des mouches ont été attirées par ce quadrant odorant. Lorsqu'un odorant répulsif, le propionate d'éthyle à 10 %, a été introduit dans le quadrant supérieur gauche, ce quadrant a été évité. L'indice d'attraction de ce quadrant s'est établi à 0,68.

L'indice d'attraction est l'indice le plus couramment utilisé dans la mesure de la réponse olfactive. Une valeur supérieure ou inférieure à zéro indique respectivement une attraction ou une répulsion. Le script compense les légères variations de position de l'arène entre les essais.

Les points de données qui auraient pu être du bruit ou correspondre à des mouches immobiles ont été supprimés. Bien que le test puisse être effectué sur n'importe quelle durée, il est intéressant d'observer les changements dans les déplacements de la cohorte par intervalles de 10 secondes afin de mieux percevoir l'habituation aux odeurs et d'autres phénomènes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser et d'analyser efficacement les comportements olfactifs dans un test à quatre compartiments.

Une fois maîtrisé, chaque expérience olfactive peut être réalisée en environ une heure, et nous effectuons habituellement quatre à six expériences au cours d'une même journée.