Name: Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez la fusion membranaire SNARE-médiée par microscopie TIRF polarisée dans une cellule microfluidique. Cette méthode permet d'observer les étapes de l'ancrage vésiculaire, de la fusion et de la libération du fret avec une résolution temporelle d'environ 15 millisecondes.

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Nous remercions Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) pour la conception et la construction du microscope polarisé TIRF, David Baddeley (Yale University) pour son aide avec l’instrumentation de détection bicolore, et James E. Rothman (Yale University) et Ben O’Shaughnessy (Columbia University) et les membres de leurs groupes pour avoir stimulé les discussions. EK est soutenu par une bourse Kavli Neuroscience Scholar de la Fondation Kavli et une subvention NIH 1R01GM108954.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

la mise en œuvre réussie de l&#39;essai de fusion SUV-SBL décrite ici dépend essentiellement de plusieurs étapes clés, telles que la reconstitution fonctionnelle des protéines dans des liposomes, l&#39;obtention de bons LTTS de qualité, et en choisissant les paramètres d&#39;imagerie droite pour détecter des molécules simples. Bien que cela puisse prendre un certain temps et d&#39; efforts pour réussir, une fois que le test est mis en œuvre avec succès, il fournit une foule de renseignements sur le processus de fusion n...

Fusion membranaire est un processus biologique universel requis pour le trafic intracellulaire de lipides et de protéines, la sécrétion, la fertilisation, le développement, et enveloppait entrée du virus dans des organismes hôtes 1-3. Pour la plupart des réactions de fusion intracellulaire , y compris la libération d&#39;hormones et de neurotransmetteurs par exocytose, l&#39;énergie nécessaire pour faire fondre les deux bicouches lipidiques est assurée par la formation d&#39;un faisceau de quatre hélices entre les récepteurs de la protéine de fixation du facteur apparenté soluble dans le N-éthylmaléimide sensible à des protéines (SNARE), ancrée dans la vésicule (v-SNARE) et la membrane cible (t-SNARE) 4, respectivement. Synaptic vésiculaire exocytose est la réaction de la fusion la plus étroitement régulée et se produit au sein d&#39; une milliseconde après l&#39;arrivée d&#39;une action 1,4,5 potentiel. Le pore de fusion, la connexion initiale entre les deux compartiments de fusion, peut scintiller ouvert et fermé à plusieurs reprises avant refermeture ou l&#39; expansion irréversible 5-7. Les résultats antérieursen transitoire, &quot;kiss &amp; run&quot; fusion, tandis que le second conduit à la pleine fusion. Les facteurs qui régissent l&#39;équilibre entre ces deux modes de fusion et des mécanismes de régulation des pores scintillements ne sont pas bien comprises 5,8. protéines SNARE sont nécessaires pour l&#39;exocytose; fusion des vésicules synaptiques est abolie lors du clivage de SNAREs par des neurotoxines 9. Expériences de fusion en vrac à l&#39; aide de petites vésicules unilamellaires (SUV) ont montré que SNAREs sont non seulement nécessaires, mais aussi suffisante pour entraîner la fusion de la membrane 10. Dans cet essai en vrac, SUVs reconstitués avec v-SNARE (v-SUV) ont été dopés avec des phospholipides fluorescents (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) et ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) et on mélange avec des vésicules non marquées contenant du t-SNARE (t-SUV) dans un premier temps la fluorescence du NBD-PE en v-SUV est désactivé par Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET ) pour LR-PE. En laboratoireELED v-VUS fusionnent avec sans étiquette t-SUV, la densité de surface de fluorophore dans la membrane maintenant combinée est réduite et l&#39;augmentation résultante de NBD-PE fluorescence rapporte l&#39;étendue des lipides de mélange 10. Comme le test en vrac est facile à configurer et à analyser, il a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de SNARE médiée par fusion 10-14. Cependant, il présente plusieurs limites, telles que la faible sensibilité et une mauvaise résolution temporelle. Plus important encore, en tant que mesure d&#39;ensemble, il est en moyenne des résultats sur tous les événements qui font une discrimination entre l&#39;amarrage et la fusion, ainsi que la détection des intermédiaires difficiles de hemifusion. Au cours de la dernière décennie , plusieurs groupes, dont le nôtre, ont mis au point de nouveaux tests pour surveiller les événements de fusion au niveau de la vésicule unique 15-27. Ha et ses collègues ont utilisé v-VUS attachés sur une surface et un suivi de leur fusion avec libres t-VUS 18,19. Le mélange de lipides a été contrôlée en utilisant le FRET entre une paire de fluorophores lié aux lipides emlits dans le v- et t-SUV, respectivement, en utilisant la fluorescence totale de réflexion interne (FRBR) microscopie 18. Plus tard, le laboratoire de Brunger utilisé une seule espèce de lipide-étiquette avec un marqueur de contenu pour la détection simultanée des teneurs en lipides et le mélange 20,28. Tant le lipide et les marqueurs de contenu ont été inclus à des concentrations élevées, auto-extinction; fusion avec VUS non marqués a donné lieu à fluorescence dequenching 20,28. D&#39; autres ont fusionné v-VUS à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs 15-17,21-27,29. La géométrie plane de la cible (t-SNARE contenant) bicouches imite mieux le processus de fusion physiologique de petites vésicules, à forte courbure d&#39;une membrane plasmique à plat. Le groupe Steinem utilise des membranes à pores transmembranaires reconstituées avec du t-SNARE, suspendue sur un substrat de nitrure de silicium poreux et détecté la fusion avec v-SUV individuels en utilisant laser microscopie confocale à balayage 23. f Autresv-VUS d&#39; occasion à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs, pris en charge sur un substrat de verre 15-17,21,22,24-27,29. Le grand avantage de l&#39;utilisation de bicouches pris en charge (SBLS) est que la microscopie TIRF peut être utilisé pour détecter accueil et de fusion des événements avec un excellent rapport signal-bruit et sans interférence de v-VUS libres, bien que l&#39;utilisation microfluidique fournit également la résolution d&#39;événement unique à l&#39;aide champ lointain norme microscopie épifluorescence 24. Une préoccupation majeure est de savoir si et comment les interactions substrat-bicouche affectent pris en charge la qualité de bicouche et le processus de fusion. Les premiers travaux a fait usage de LTTS planes qui ont été directement pris en charge sur un verre ou de quartz substrat 15-17. Ces LTTS ont été faites par adsorption, à l&#39;éclatement d&#39;étalement et de la fusion des membranes du t-SUV sur le substrat. Il a été vite rendu compte, cependant, que l&#39;omission d&#39;un élément clé t-SNARE, SNAP25, de LTTS préparés de cette manière a donné lieu à v-SUV accueil et fusion cinétique indistinguishable de ceux obtenus en utilisant la complète t-SNAREs 17. Parce que SNAP25 est absolument nécessaire pour la fusion in vivo 30,31, la pertinence physiologique de ces premières tentatives a été mis en question. Le groupe de Tamm a surmonté ce défi en utilisant mieux contrôlé appuyé la formation de bicouche 21. Il a utilisé un dépôt de Langmuir-Blodgett , pour la première plaquette exempt de protéines du SBL, suivi par la fusion de cette monocouche avec des T-SUV 21. Cela a abouti à la fusion SNAP25-dépendante. Afin d&#39; éviter des artefacts potentiels associés à un bi - couche directement supporté sur un substrat de verre sans qu&#39;il soit nécessaire d&#39;utiliser des méthodes de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. , A présenté un poly hydraté (éthylène glycol) (PEG) amortit entre la double couche et le substrat 24. Cette modification a aussi entraîné SNAP25 dépendant fusion 24. Bicouches rembourrées sur une couche de polymère mou avaient été connus pour mieux préserver transmembranairela mobilité de la protéine et de la fonction 32, et ont été utilisées dans des études de fusion avec 33 les virus. En outre, les bicouches PEGylés semblent conserver une certaine capacité d&#39;auto-guérison et sont très robustes 34,35. Tout d&#39;abord, une fraction de disponibles dans le commerce, les chaînes de PEG lipidiques liées sont inclus dans la membrane t-SUV. Lorsque ces T-VUS éclatent et forment une bicouche plane sur un substrat de verre, une brosse PEG couvre les deux feuillets de la bicouche planaire. Comme la formation de bicouches plane est entraînée par adhérence des chaînes de PEG entourant t-SUV sur la surface du verre hydrophile, d&#39;un liposome éclatement et la formation de deux couches planes sont relativement insensibles à la composition lipidique utilisée. Cependant, lorsque de grandes quantités de cholestérol sont inclus, ce qui augmente les propriétés de cohésion des VUS, les VUS ne peuvent pas éclater spontanément. Si tel est le cas, les ions divalents ou choc osmotique peuvent être utilisés pour aider à la formation de deux couches planes 25. Comme il est mentionné ci-dessus, dans la présente apapproche une brosse PEG couvre les deux côtés de la plane, soutenue bicouche. La brosse en face du canal d&#39;écoulement microfluidique aide à prévenir l&#39;adhérence non spécifique de v-VUS entrants qui sont aussi généralement recouvertes d&#39;une couche de PEG. Formation de complexes V- et t-SNARE commence à partir de l&#39; extrémité N-terminales et procède à la membrane distale progressivement vers les domaines de la membrane proximale 36. Pour les v-VUS d&#39;interagir avec le t-SBL, le v- et le besoin t-SNARE N-terminales pour faire saillie au-dessus des brosses PEG, ce qui semble être le cas dans les conditions de l&#39;essai. La hauteur de brosse peut être adapté à l&#39; étude des protéines autres que SNAREs en faisant varier la densité des lipides pégylés et la longueur de la chaîne de PEG 37,38. Un autre avantage des brosses PEG couvrant les surfaces proximales des bicouches de fusion est qu&#39;ils imitent l&#39;environnement encombré des membranes biologiques qui sont emballés avec 30.000-40.000 protéines membranaires intégrales par micron carré 39. Tout comme les chaînes de PEG dans cet essai, le repulsive couche de protéines portant sur des membranes biologiques doit être mis de côté pour permettre un contact entre les deux bicouches phospholipidiques pour la fusion se produise. des canaux d&#39;écoulement fluidiques sont utilisés dans ce test, car ils offrent des avantages uniques. Tout d&#39;abord, le flux microfluidique permet un dépôt plus uniforme de t-VUS à se répandre et fusible pour former le t-SBL. Deuxièmement, le petit volume de canal (&lt;1 pi) minimise la consommation d&#39;échantillon. Troisièmement, les petits volumes requis permettent à l&#39;ensemble de l&#39;expérience effectuée en vertu du débit constant. Débit supprime faiblement, probablement non spécifique, adhéré v-VUS de la SBL 16. Il maintient également une densité constante de v-VUS au- dessus du t-SBL, ce qui simplifie l&#39; analyse cinétique 17. Enfin, les vésicules accostés se distinguent facilement de celles qui sont libres portés par le flux 25. Quatrièmement, plusieurs canaux microfluidiques peuvent être utilisés sur le même lamelle, sonder chacun un état différent. Ceci permet la comparaison des conditions during le même essai expérimental. Une approche similaire a été utilisée par le groupe van Oijen pour étudier la fusion entre le virus de la grippe et LTTS rembourrées 33. En microscopie TIRF, la décroissance exponentielle du champ évanescent (avec une constante de désintégration ~ 100 nm) confine l&#39;excitation de fluorescence à ces molécules qui sont très près de l&#39;interface verre-tampon. Cela réduit la contribution des molécules fluorescentes qui sont plus loin, augmente le rapport signal-bruit, et permet une sensibilité molécule unique avec des temps d&#39;exposition de vues de 10-40 msec. Le champ évanescent conduit également à une augmentation du signal lors de la fusion: le transfert marqué des lipides du SUV dans la SBL, ils se trouvent, en moyenne, dans un champ d&#39;excitation plus forte. Cette augmentation de la fluorescence est plus forte pour les grands liposomes. Si la lumière polarisée est utilisée pour générer le champ évanescent, d&#39;autres effets contribuent à des changements de fluorescence lors de la transfert des étiquettes du SUV dans la SBL. Certains colorants lipidiques ont un dipôle de transition orienté avec un angle moyen préféré par rapport à la double couche dans laquelle elles sont incorporées. Cela crée une différence dans la quantité de fluorescence émise par les fluorophores quand ils sont dans le SUV par rapport à la SBL, étant donné que le faisceau polarisé excitera les colorants dans les deux membranes différentes. Pour les premiers, le faisceau d&#39;excitation va interagir avec dipôles de transition orientés autour du SUV sphérique, alors que pour ce dernier, les orientations dipolaires seront limitées par la géométrie SBL plat. Par exemple, quand on utilise de lumière polarisée incidente (polarisation perpendiculaire au plan d&#39;incidence), l&#39; excitation est plus efficace lorsque le colorant est dans la SBL que dans le SUV à un lipide colorant transition dipôle orienté parallèlement à la membrane 29,40 (comme celui de Dil ou DiD 41-43). Un SUV dopé avec un tel fluorophore apparaît dim quand il docks sur la SBL (Figure 7, représentat<html> ive résultats). Comme un pore de fusion ouvre et relie les membranes de SUV et SBL, les sondes fluorescentes diffusent dans la SBL et deviennent plus susceptibles d&#39;être excités par le champ évanescent 25,27,29 polarisée s. Par conséquent, le signal de fluorescence intégrée autour du site de fusion augmente fortement au cours du transfert de colorant depuis le SUV dans la (figure 7 et figure 3) SBL 27. Un autre facteur qui contribue à signaler des changements qui l&#39;accompagnent fusion est dequenching de marqueurs fluorescents tels qu&#39;ils sont dilués lorsqu&#39;ils sont transférés dans le SBL. La contribution de dequenching est généralement mineure par rapport aux effets évanescents de décroissance du champ et de polarisation dans l&#39;essai décrit ici, car seule une petite fraction ( <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Des lipides sont marqués. L&#39;augmentation du signal lors de la fusion peut être exploitée pour déduire des propriétés de fusion des pores en comparant le temps,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, requis pour un lipide pour échapper à travers un pore qui est librement perméable aux lipides à l&#39;instant réel de libération, <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Si les deux échelles de temps sont comparables, on en conclut que le pore présente une faible résistance à l&#39;écoulement des lipides. Toutefois, si le temps de libération réelle est beaucoup plus longue que le temps pour la libération de diffusion limitée, cela indiquerait un processus, tels que les pores vacillement, retardant la libération des lipides. Le temps de libération limitée par diffusion, <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Dépend de la taille du liposome de fusion et de lipides diffusivité; son estimation exige que ces deux paramètres à quantifier. La sensibilité seule molécule de l&#39;essai permet lipidique diffusivité à mesurer au moyen de plusieurs fluorophores unique de lipides après leur libération dans la SBL pour chaque événement de fusion 26. La taille de chaque vésicule fusionpeut être estimée 27 en combinant : (i) l&#39;intensité d&#39;un colorant unique de lipides, (ii) la modification de la fluorescence totale autour d&#39; un site d&#39;accueil après que tous les fluorophores sont transférés dans la SBL lors de la fusion, (iii) la densité de marquage connu de SUV les lipides, et (iv) la surface par lipide. Pour de nombreux événements de fusion, les temps des lipides de libération réels se sont révélés être beaucoup plus lent que prévu par la diffusion à libération contrôlée 27, comme cela a été indiqué précédemment en supposant que la taille de SUV uniforme 44. En supposant un retard de lipide libération est due à des pores de scintillement, un modèle quantitatif permet d&#39; estimer « l&#39; ouverture des pores&quot;, la fraction du temps le pore reste ouvert pendant la fusion 27. À chaque fois que possible, il est important de tester les mécanismes de fusion en utilisant à la fois solubles dans les lipides et les contenus des étiquettes. Par exemple, le lipide libération pourrait être retardée par des procédés autres que le scintillement des pores, telles que la restriction de la diffusion des lipides par les protéines SNARE qui entourent til pore. Si tel était le cas, alors la libération de contenus précéderait libération des étiquettes lipidiques, à condition que le pore est assez grand pour permettre le passage de sondes solubles. Une faille plus fondamentale dans l&#39;approche pourrait être dans l&#39;hypothèse que le transfert des lipides marqués à la SBL se produit à travers une fusion étroite pores reliant la SBL à une vésicule qui a conservé en grande partie sa forme pré-fusion. Transfert de Lipid dans le SBL pourrait également résulter de la dilatation rapide du pore de fusion avec une concomitante, extrêmement rapide effondrement du SUV dans la membrane SBL, comme précédemment suggéré sur la base de données des lipides de libération seuls 29. Contrôler à la fois des lipides et le contenu de libérer en même temps, on a constaté que de nombreux pores refermés après libération de leurs marqueurs de lipides, mais a conservé une partie de leur cargaison soluble 27. Ceci indique qu&#39;au moins certains des liposomes ne fusionnent pas dans la SBL après la fusion, et que le transfert des lipides de colorant dans le SBL se produit à travers un pore de fusion. En outre, lipid et le contenu de presse a eu lieu simultanément 27, ce qui rend peu probable que le retard de lipide libération était due à l&#39; entrave de la diffusion des lipides par les protéines SNARE entourant le pore 45. Un protocole de fusion SUV-SBL qui ne surveille pas le contenu soluble communiqué a été publié par Karatekin et Rothman 25. Ici, des développements plus récents sont inclus, la surveillance soit simultanée des teneurs en lipides et libèrent et l&#39; estimation des propriétés SUV, lipides, et la fusion des pores 27. Le protocole commence avec des instructions pour la préparation des cellules microfluidiques, réalisés par collage d&#39; un poly (diméthylsiloxane) , des rainures (PDMS) élastomère à blocs contenant une lamelle de verre 25. Ensuite, la préparation de v-SUV à la fois avec les lipides et le contenu des marqueurs est expliqué. Les articles 4 et 5 fournissent des instructions pour l&#39; assemblage des cellules microfluidiques, formant les LTTS in situ et la vérification des défauts et la fluidité, l&#39; introduction de vSUVS dans les cellules d&#39;écoulement et la détection d&#39;événements de fusion. Section 6 fournit des instructions pour l&#39;analyse des données.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) water Millipore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Cholride de sodium (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hydroxyethyl] pipérazine-N'-[acide 2-éthanesulfonique] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>Tampon HEPES-KOH (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp ; mM KCl, 100&nbsp ; &mu ; M EGTA, 1&nbsp ; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Solvants</fort></td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>dans une bouteille en verre, ATTENTION, porter un EPI</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>dans une bouteille en verre, ATTENTION, porter EPI</td></tr><tr><td colspan="4">Préparation de liposomes</forte></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton étanche au gaz Les</td> tailles <td>Hamilton</td><td>var. utilisent</td><td>uniquement des sringe en verre avec des solents (Chlorophorme/ Méthanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Tubes en verre Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm bouchon à vis tube de culture</td><td>Pyrex&nbsp ;</td><td>70825-16</td><td>Nettoyez soigneusement, rincez avec du chloroforme</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Les lipides 850457 lipides polaires Avanti</td><td></td><td>se dissolvent dans CHCl3 ou sous forme de poudre lyphilisée dans des flacons scellés. Aliquote à l’ouverture. Conservez les pellicules lipidiques supplémentaires sous forme de films lipidiques séchés sous atmosphère inerte à -20 °C. Conservez les stocks en CHCl3/MeOH (2:1, v/v) à -20 °C. Passons à RT avant d’ouvrir</td></tr><tr><td>le 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (sel de sodium), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>Idem que ci-dessus.</td></tr><tr><td>1-stéaroyl-2-arachidonoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>Idem que ci-dessus.</td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (cerveau, porcin) (sel d’ammonium), cerveau PI(4,5)P2</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td>840046</td><td>Mêmes que ci-dessus.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (sel d’ammonium), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Lipids polaires</td><td>810145</td><td>Idem que ci-dessus.</td></tr><tr><td>1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>Idem que ci-dessus.</td></tr><tr><td>cholestérol (laine ovine, >98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Même que ci-dessus.</td></tr><tr><td>DiD' huile ; Huile DiIC18(5) (1,1'-Dioctadécyl-3,3,3',3'-Tétraméthylindodicarbocyanine Perchlorate)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>bain de chaleur au-dessus de Tm des lipides utilisés</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta ;-D-Glucopyranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>stocker à -20 &deg ; C, venons-en à RT avant d’ouvrir</td></tr><tr><td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Cassettes de dialyse, 20k MWCO, 3&nbsp ; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbants</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp ; Gradient de densité Moyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, ultra-clair, 13,2 ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Sondes moléculaires</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp ; Colonnes de chromatographie, 2,5 & fois ; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td><td>Molecular Sobes</td><td>S-6650</td><td>5,000x Concentré en DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre pyrex, 150 x 20 mm, complète avec couvercle</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Perforateur - Poinçon à biopsie réutilisable, 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Poinçonneuse manuelle</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>Foret .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN poinçon rond revêtu SYNEO</td><td></td><td>CR0350265N20R4</td><td>diamètre : 0,9 mm, taille de l’alésage du poinçon : 0,74 mm</td></tr><tr><td>Tube Tygon Microbore, 0,25 mm ID, 0,76 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0,010 » ID, 0,030</td></tr> » <tr><td>OD Tube en silicone (0,51 mm ID, 2,1 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0,020 » ID, 0,083 » OD</td></tr><tr><td colspan="4">Cover glass - cleanroom cleanroom</td></tr><tr><td>Schott Nexterion cover slip glass D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>nettoyeur plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF setup and accessories</td></tr><tr><td>IX81 corps de microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM caméra CCD</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, platine de microscope chauffée</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>Seringues en verre Hamilton 1 ml (4x)</td><td>Hamilton</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>pousse-seringue</td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

fusion snare-médiée de single protéoliposomes avec bicouches supportées tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par polarized frbr microscopie

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Dans le procédé omniprésent de fusion membranaire de l&#39;ouverture d&#39;un pore de fusion établit la première liaison entre les deux compartiments séparés auparavant. Pendant neurotransmetteur ou la libération d&#39;hormones par exocytose, le pore de fusion peut et fermer à plusieurs reprises, la régulation cargaison cinétique de libération transitoirement ouverts. la dynamique de Pore déterminent également le mode de recyclage des vésicules; Résultats de réapposition de sceau irréversibles transitoire fusion, &quot;kiss-and-run&quot;, alors que la dilatation conduit à pleine fusion. Pour mieux comprendre les facteurs qui régissent la dynamique des pores, nous avons développé un test pour contrôler la fusion membranaire en utilisant polarisée totale fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie avec une sensibilité seule molécule et ~ 15 résolution temporelle msec dans un biochimiquement bien défini dans le système in vitro. Fusion de marquée par fluorescence de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines v-v-SNARE (SUV) avec une double couche plane portant le t-SNARE, supporté sur un coussin de polymère mou (t-SBL, t-supporté bicouches) Est surveillée. Le test utilise des canaux d&#39;écoulement microfluidiques qui assurent la consommation minimale de l&#39;échantillon tout en fournissant une densité constante de VUS. Exploiter le signal amélioration rapide lors du transfert d&#39;étiquettes lipidiques du SUV à la SBL lors de la fusion, la cinétique de transfert lipidique de colorant est surveillée. La sensibilité de la microscopie TIRF permet de suivre simples étiquettes lipidiques fluorescentes, à partir de laquelle des lipides diffusivité et la taille SUV peuvent être déduites pour chaque événement de fusion. Lipid fois colorant de libération peuvent être beaucoup plus longtemps que prévu pour le passage sans entrave à travers les pores ouverts en permanence. L&#39;utilisation d&#39;un modèle qui suppose un retard de lipide libération est due à des pores de scintillement, un pore «ouverture», la fraction du temps le pore reste ouvert pendant la fusion, peut être estimée. Un marqueur soluble peut être encapsulé dans les VUS pour la surveillance simultanée des lipides et de la libération de la cargaison soluble. Ces mesures indiquent des pores peuvent reboucher après avoir perdu une partie de la cargaison soluble.

qualité SBL Il est crucial de vérifier la qualité et la fluidité du SBL avant l&#39;expérience de fusion. La fluorescence sur le côté inférieur, le verre d&#39;un canal microfluidique doit être uniforme, sans défauts apparents. Si une bulle d&#39;air passe à travers le canal, il laisse généralement des cicatrices visibles sur le SBL. S&#39;il y a de telles grandes cicatrices d&#39;échelle / défauts, ne pas uti...

Ici, nous présentons un protocole pour détecter un seul, les événements de fusion SNARE médiation entre liposomes et bicouches pris en charge dans des canaux microfluidiques utilisant TIRFM polarisée, avec une sensibilité et une seule molécule ~ 15 résolution temporelle msec. Lipid et la libération de la cargaison soluble peuvent être détectés simultanément. la taille des liposomes, des lipides diffusivité et la fusion des pores propriétés sont mesurées.

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

L'objectif général de ce dosage est d'observer les événements individuels de fusion membranaire induits par les protéines SNARE neuronales et exocytotiques afin de comprendre les mécanismes fondamentaux de la libération des neurotransmetteurs et des hormones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la fusion membranaire, telles que la manière dont la libération du contenu s'effectue à travers un pore de fusion dynamique, et le devenir du pore après la fusion. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer, pour des événements individuels et dans des environnements biochimiquement définis, les stades distincts de l'ancrage des vésicules, de la fusion menant à l'ouverture et de la cinétique de libération du contenu.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'exocytose, elle peut également être appliquée à d'autres réactions de fusion membranaire, comme la fusion de virus enveloppés avec les membranes cellulaires cibles lors d'une infection. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car de nombreuses étapes différentes doivent être maîtrisées, allant de la microfabrication à la purification des protéines et à l'imagerie. Pour commencer, préparez un moule mère en silicone en utilisant des techniques standard de photolithographie et le modèle présenté ici.Ensuite, ajoutez 100 millilitres de la base de PDMS et 10 millilitres de l'agent de réticulation dans un gobelet en plastique jetable, puis mélangez soigneusement le mélange. Placez ensuite le gobelet dans un dessiccateur sous vide. Appliquez un vide, mais surveillez attentivement afin d'éviter tout débordement du mélange.Une fois dégazé, versez une grande goutte du mélange de PDMS dégazé dans une boîte de Pétri en verre, puis appliquez le moule sur le PDMS en orientant le côté modèle vers le haut afin d'éviter d'emprisonner des bulles sous le wafer. Ensuite, versez du PDMS dégazé sur le modèle jusqu'à ce qu'il soit recouvert de cinq à huit millimètres du polymère. Si une bulle d'air apparaît, retirez-la délicatement à l’aide de la pointe d’une pipette.Placer le modèle recouvert de PDMS sur une surface plane d'un four et faire cuire pendant trois heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, utiliser une lame de scalpel neuve pour découper un bloc de PDMS contenant les structures de canaux moulées. Remarquer que le bloc découpé doit pouvoir être placé sur une lame de couverture.Ensuite, placez le côté des rainures du canal vers le haut et utilisez un poinçon pour percer le bloc d'un seul mouvement continu. Veillez à retirer la pièce découpée de chacun des huit emplacements de trou. Une fois terminé, fixez les rainures du bloc vers le bas sur un morceau propre de papier d'aluminium.À présent, découpez le tube de manière à ce qu'il présente une légère inclinaison à une extrémité, puis utilisez une paire de pinces pour insérer le tube d'environ un tiers dans les trous perforés. Coupez les tubes de sorte qu'ils puissent atteindre le réservoir de tampon et la pompe à seringue. Pour relier les tubes aux seringues de la pompe à seringue, découpez un court morceau d'un tube en silicone plus large, puis insérez-y d'un côté le tube plus fin.Ce bloc de PDMS prêt à l'emploi peut être conservé pendant plusieurs mois. Tout d'abord, placer le bloc de PDMS sous vide poussé pendant au moins 20 minutes afin d'éliminer les gaz dissous et de réduire le risque de formation de bulles d'air dans les canaux microfluidiques durant l'expérience de fusion. Ensuite, s'assurer que la zone de la platine du microscope est réglée à la température souhaitée.Pendant que la température s'équilibre, préparez les vésicules unilamellaires petites marquées au NBD-PE et contenant des protéines t-SNARE, ou des témoins sans protéine, en diluant 30 microlitres des vésicules avec 60 microlitres de tampon. Ensuite, aspirez la solution dans une seringue de trois millilitres. Expulsez la majeure partie de l'air situé au-dessus de l'échantillon tout en tenant la seringue verticalement.Ensuite, scellez l'extrémité à l'aide d'un film de paraffine et créez un vide en tirant le piston vers le bas. Pendant la création du vide, tapez doucement sur le corps de la seringue pour accélérer la dégazéification de la solution. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air n'apparaisse plus lorsque le vide est appliqué.Ensuite, utilisez une aiguille hypodermique dont le diamètre est légèrement supérieur à celui du tube capillaire microfluidique pour percer un trou dans le bouchon d'un tube de microcentrifugation. Remplissez les vésicules unilamellaires petites dégazées dans le tube de microcentrifugation, placez-le dans le support sur la platine du microscope, et laissez la solution s'équilibrer à la température définie. Placez une lame couvre-objet propre dans un nettoyeur à plasma, puis appliquez un plasma d'air sur la lame couvre-objet pendant environ cinq minutes.Ensuite, retirez le lamelle et placez-la, côté traité vers le haut, sur quelques feuilles de papier sans peluches servant d'amortisseur. Puis, placez le bloc de PDMS, côté structuré vers le bas, au-dessus du lamelle. Utilisez une paire de pinces pour appuyer doucement sur le bloc, sans toutefois appuyer suffisamment fort pour briser le verre.Placer la cellule d'écoulement assemblée sur la platine du microscope. Ensuite, connecter les tubes aux réservoirs de vésicules unilamellaires petites et à la pompe à seringue. Commencer à aspirer les vésicules unilamellaires petites à un débit de trois microlitres par minute jusqu'à ce que la solution remplisse complètement les canaux.Lorsque les solutions dans tous les canaux commencent à remonter dans le tube côté sortie, réduire le débit à 0,5 microlitre par minute et incuber de 30 à 45 minutes. Le temps entre le traitement au plasma de la lame de verre et l'écoulement des VUS dans le canal ne doit pas dépasser 10 minutes, car l'effet du traitement au plasma est transitoire. Vérifier les canaux pour détecter toute fuite à l’aide d’une imagerie de fluorescence avec un objectif de faible grossissement, puis rincer tous les canaux avec du tampon désaéré pour éliminer les vésicules non liées.Ensuite, passez à l'objectif à immersion huile de fort grossissement pour la microscopie TIRF, et fixez la cellule d'écoulement en la collant sur la platine du microscope. Fermez le diaphragme de champ à environ 40 micromètres de diamètre, puis ajustez l'intensité de la lumière d'excitation à 488 nanomètres à l'aide du logiciel afin de blanchir de manière significative, mais pas complète, la fluorescence dans la zone exposée. L'intensité de fluorescence au centre de la zone exposée doit être inférieure à celle des bords, car les molécules intactes de NBD-PE pénètrent et diffusent sur une certaine distance avant d'être blanchies.Cependant, si les VUS adhérents à la surface ne se rompent pas, tous les fluorophores dans la zone exposée doivent être éliminés par photoblanchiment. Pour vérifier les résultats des mesures d'état de l'étude, arrêtez l'illumination puis recommencez quelques minutes plus tard afin de vérifier si la fluorescence s'est rétablie. Dégazez le tampon de reconstitution et utilisez-le pour diluer la solution mère de vésicules unilamellaires petites réconstituées contenant le v-SNARE, de sorte que la solution finale produise de 10 à 100 événements de fusion dans le champ de vision au cours de 60 secondes.Trop d'événements de fusion augmentent la fluorescence de fond et rendent la détection et l'analyse des événements difficiles. En revanche, un taux de fusion trop faible peut entraîner de mauvaises statistiques. Faire circuler les vésicules unilamellaires petites reconstituées avec du v-SNARE dans le canal à un débit de deux microlitres par minute, puis passer aux réglages d'excitation et d'émission appropriés pour surveiller le mélange des lipides.Ensuite, ajustez l'angle et la polarisation de la microscopie par réflexion totale interne (TIRF) comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Excitez en continu et surveillez la fluorescence des vésicules à l’aide d’un laser de 561 nanomètres. Lorsque les vésicules atteignent le canal d’écoulement et s’ancrent puis fusionnent avec la bicouche supportée, le signal de fluorescence de fond commence à s’accumuler.Réglez l'intensité du laser d'excitation à l'aide du logiciel afin de blanchir en continu la fluorescence de fond, de manière à pouvoir observer facilement de nouveaux événements d'ancrage et de fusion. Enregistrez plusieurs vidéos à différentes positions dans un canal donné. Vérifiez la fluorescence du NBD-PE afin de confirmer que le bicouche supporté ne présente pas de défauts à ces positions.La récupération de la fluorescence après photobléachage est montrée ici pour une bicouche supportée reconstituée avec un t-SNARE, relativement exempte de défauts et fluide. La zone est imagée avec une faible exposition à la lumière afin de suivre la récupération de la fluorescence par diffusion des lipides marqués au NBD. Il est plus facile d'observer les événements d'ancrage et de fusion en surveillant la fluorescence provenant uniquement des marqueurs lipidiques.Dans la séquence d'images présentée ici, une image a été enregistrée toutes les 18 millisecondes. Lors de la fusion, les marqueurs lipidiques passent dans le bicouche supporté et diffusent loin du site de fusion. Dans certains cas, il peut être souhaitable de surveiller simultanément le mélange des lipides et la libération du contenu soluble.Un événement représentatif illustrant un mélange simultané de lipides et une libération de cargaison soluble est montré ici. Aux concentrations élevées utilisées pour l'encapsulation, la fluorescence du contenu soluble, représentée en rouge, est initialement auto-inhibée. Une augmentation nette de la fluorescence des lipides, représentée en bleu, indique un mélange de lipides dû à un événement de fusion, comme dans la surveillance monocouleur des marqueurs lipidiques présentée précédemment.L'ouverture du pore libère le colorant contenu dans la phase soluble et atténue le phénomène de quenching initial du colorant dans la lumière de la vésicule. Cela entraîne une augmentation du signal du contenu soluble, représenté en rouge. Fait intéressant, la fluorescence du contenu atteint un plateau stable.Ceci indique que le pore s'est refermé après avoir libéré toutes les étiquettes lipidiques et une fraction du contenu soluble. À la fin, le signal du contenu soluble, représenté en rouge, diminue très rapidement. Cela est probablement dû soit à une fusion complète rapide, soit à l'éclatement du liposome.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer une cellule d'écoulement microfluidique à partir d'une bicouche supportée réconstituée avec des protéines t-SNARE, et comment surveiller et analyser des événements individuels de fusion de vésicules à l'aide de la microscopie de fluorescence par résonance évanescente (TIRF). Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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