Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

L’objectif global de cette procédure de dissection est d’isoler le cercle murin de Willis pour faciliter l’étude des gros vaisseaux de la cérébrovascularisation de la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de l’expression des gènes cérébrovasculaires dans diverses maladies qui affectent les vaisseaux cérébraux telles que la maladie d’Alzheimer et l’angiopathie ameloïde cérébrale. Le principal avantage de cette technique est que les grands récipients peuvent être isolés rapidement et facilement sans modifier la structure du récipient.

Commencez par utiliser des ciseaux à iris pour faire une incision de quatre centimètres de long dans la paroi abdominale et le péritoine d’une souris anesthésiée mortellement juste sous la cage thoracique. Ensuite, faites une incision de quelques millimètres de long dans le diaphragme, en continuant l’incision sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. Soulevez le sternum et fixez la pointe avec un hémostat, en posant l’hémostat sur le cou.

Ensuite, coupez soigneusement le tissu adipeux reliant le sternum au cœur. Passez maintenant une aiguille de profusion de calibre 15 à travers le ventricule gauche jusqu’à l’apex du cœur et utilisez des ciseaux pour couper l’un des lobes du foie afin de créer une sortie pour le perfusat. Perfuser l’animal avec 25 à 50 millilitres de PBS à un débit de pompe de 2,5 millilitres par minute pendant une dizaine de minutes.

Le foie devrait blanchir lorsque le sang est remplacé par du PBS. Lorsque le liquide du foie est complètement clair, arrêtez la perfusion. Pour isoler le cerveau, utilisez des ciseaux à iris pour faire une incision médiane le long de la peau, du cou au nez.

Coupez la peau avec les ciseaux à iris pour exposer le crâne et éliminer tout muscle résiduel et tissu adipeux. Ensuite, placez les pointes des ciseaux de l’iris dans un côté du foramen magnum et faites glisser soigneusement les pointes le long de la surface interne du crâne jusqu’au méat auditif externe. Faites une incision similaire de l’autre côté du foramen magnum, suivie d’une coupe sur la ligne médiane le long de la surface interne de l’os interpariétal jusqu’au début de la suture sagittale.

Plantez les ciseaux à iris fermés dans l’os frontal entre les yeux dans la suture sagittale, et ouvrez les lames pour fendre le crâne en deux. À l’aide d’une pince, saisissez les bulbes olfactifs et utilisez les ciseaux à iris pour couper les connexions nerveuses sur la surface ventrale du cerveau. Plongez ensuite le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 millimètres de PBS glacée.

Pour isoler le cercle de Willis, transférez la parabole sur un sac de glace sous un microscope à dissection et tournez le cerveau sur sa surface dorsale pour visualiser le cercle de Willis. Utilisez la petite pince pour saisir les artères cérébrales antérieures à la base des lobes olfactifs et exercez une pression pour dissocier les artères du continuum vasculaire. Coupez les artères cérébrales moyennes de la même manière.

Ensuite, utilisez les extrémités pointues de la pince pour saisir les artères cérébrales moyennes et soulever le début des artères communicantes postérieures, déconnectant les deux ensembles d’artères du cerveau. Ensuite, soulevez les artères antérieures, en les tirant doucement sur le chiasma optique dans une direction dorsale antérieure. Retirez les artères cérébelleuses supérieure et postérieure de la même manière, puis déplacez l’artère basilaire.

Enfin, utilisez la pince pour transférer doucement tout le cercle de Willis dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS glacé, et fixez les vaisseaux en place avec de petites broches, à l’aide de deux pinces pour retirer soigneusement tout tissu cérébral restant. Le cercle de Willis doit ressortir en un seul morceau et doit être légèrement transparent en raison de l’absence de sang résiduel dans le système vasculaire. Le cercle propre de Willis devrait exprimer spécifiquement les marqueurs des cellules musculaires lisses vasculaires, tels que l’actine musculaire lisse, la chaîne lourde de myosine et la smoothéline.

Les marqueurs neuronaux, tels que la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline ou la protéine 2 associée aux microtubules, en revanche, ne devraient être qu’à peine détectables dans le cercle de Willis. De plus, l’expression du marqueur endothélial, E-Selectin, dans le tissu neural non circulaire de Willis, est très similaire à celle obtenue pour les échantillons de cercle de Willis, reflétant peut-être l’existence d’un réseau cerveau-capillaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les vaisseaux cérébraux de la souris sont très fins et se cassent facilement. Ainsi, la dissection doit être effectuée très soigneusement, sans se précipiter, pour s’assurer que toute la structure est récoltée en un seul morceau. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies neuronales inflammatoires pour explorer les troubles vasculaires cérébraux dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer et de maladies apparentées telles que l’angiopathie amyloïde cérébrale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le cercle de Willis d’une souris.