Name: Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Apprenez à isoler le cercle de Willis chez la souris pour étudier la cérébrovasculature et l'expression génique vasculaire. Cette méthode préserve l'intégrité structurelle des vaisseaux sanguins cérébraux.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Université Paris VI et une subvention Pierre Fabre Innovation.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux normes de la Communauté européenne pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique local pour l&#39;expérimentation animale (Ile de France-Paris-Comité, Autorisation 4270). 1. Anesthésie <ol><li> Perfuser une dose létale de pentobarbital (jusqu&#39;à 1 mg / 10 g de poids corporel) (aiguille de calibre 27 et une seringue de 1 ml) par voie intrapéritonéale à des souris adultes avant la chirurgie. </li></ol> Perfusion 2. Navire NOTE: Il n&#39;y a pas besoin d&#39;appliquer une pommade vétérinaire pour les yeux pendant navire perfusion. Cette procédure est rapide (5-10 minutes) et se termine à la mort de l&#39;animal. Confirmez l&#39;absence de réponse avec une pincée d&#39;orteil. <ol><li> Utilisation de l&#39;iris de ciseaux, faire une incision, d&#39;environ 4 cm de long, dans la paroi abdominale et du péritoine, juste au-dessous de la cage thoracique. </li><li> Faire une petite incision (quelques millimètres de long) dans le diaphragme et continue de l&#39;incision de la membrane sur toute la longueur de la cage thoracique afin d&#39;exposer la cavité pleurale. </li><li> Soulevez le sternum loin et serrer la pointe du sternum avec le hémostatique; placer le hémostatique sur le cou. couper délicatement le tissu adipeux reliant le sternum au cœur. </li><li> Passer l&#39;aiguille de perfusion de calibre 15 à travers le ventricule gauche dans l&#39;apex du cœur. </li><li> Enfin, utiliser des ciseaux pour couper l&#39;un des lobes du foie pour créer une prise. NOTE: Une sortie alternative peut être créée en utilisant l&#39;iris de ciseaux pour créer une incision à l&#39;oreillette droite. </li><li> Perfuser l&#39;animal avec 25 à 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une pompe fonctionnant à un débit de 2,5 ml / min. Le foie doit blanch que le sang est remplacé par PBS. </li><li> Après environ cinq minutes, une fois que le fluide à partir du foie est tout à fait clair, arrêter la perfusion. </li><li> Si immunocoloration ou coloration régulière est prévue, perfuser l&#39;animal avec 50 ml de paraformaldehyde(PFA; 4% dans du PBS) pendant 15 min. NOTE: Attention, les fumées PFA sont toxiques. La perfusion de l&#39;animal avec le PFA doit être effectuée dans une hotte ventilée. </li></ol> 3. Isolement du cerveau et le Cercle de Willis <ol><li> L&#39; isolement du cerveau <ol><li> Retirez la tête avec une paire de ciseaux chirurgicaux. </li><li> Faire une incision médiane avec iris ciseaux, le long de la peau du cou pour le nez. </li><li> Coupez la peau pour exposer le crâne et supprimer tous les muscles résiduels et les tissus adipeux avec des ciseaux de l&#39;iris. </li><li> Placer l&#39;extrémité pointue de l&#39;iris ciseaux dans le trou occipital d&#39;un côté et les faire glisser soigneusement le long de la surface interne du crâne du conduit auditif externe (également connu sous le canal auditif). </li><li> Reproduire l&#39;incision décrite dans 3.1.4 sur le côté controlatéral et de faire une ligne médiane coupe le long de la surface interne de l&#39;os inter-pariétal au début de la suture sagittale. </li><li> Plantez les irisciseaux dans l&#39;os frontal, entre les deux yeux, dans la suture sagittale, puis les ouvrir à diviser le crâne en deux. </li><li> Soulever le cerveau, en saisissant les bulbes olfactifs et en utilisant les iris ciseaux pour couper les connexions nerveuses sur sa surface ventrale. </li><li> Retirez le cerveau et le placer dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant du PBS glacé pour l&#39;isolement de vache. Immerger complètement le cerveau dans le PBS. Si le cerveau a été fixé à 4% PFA (pour la coupe ultérieure et immunocoloration ou coloration régulière), gardez-le dans un bain de 4% PFA à 4 ° C pendant 24 heures. </li></ol></li><li> L&#39; isolement du cercle de Willis REMARQUE: Un microscope à dissection est nécessaire pour l&#39;isolement de vache. Le cerveau doit être conservé à 4 ° C pendant toute la procédure. <ol><li> Mettez le cerveau à l&#39; envers (ie, sur sa surface dorsale) pour visualiser la vache. </li><li> Utilisez une petite pince pour saisir les artères cérébrales antérieures (ACA) à la base des lobes olfactifs ( <strong&gt; a, Figure 1) et exercer une pression pour les dissocier du continuum des navires. Utilisez la même procédure pour couper les artères cérébrales moyennes (MCA) dans b (figure 1). </li><li> Utilisez les extrémités pointues de la pince pour soulever et retirer les artères principales qui forment le CoW du cortex. </li><li> Soulevez le début des postérieurs artères communicantes (PCA) afin de les déconnecter du cerveau, en saisissant les artères cérébrales moyennes (MCA) avec la pince. Ramassez les artères antérieures (ACA et MCA) et tirez-les doucement sur le chiasma optique dans une direction antéro-dorsale. Pour éviter la perturbation de la vache, interrompre le la procédure de traitement avec les autres artères. </li><li> Répéter les étapes 3.2.2 et 3.2.3 pour les artères cérébelleuses supérieure et postérieure (SCA) / (APC) (c, figure 1) et de l&#39;artère basilaire (BA) (d, figure 1), en les tirant dans une dorso direction antérieure. S&#39;arrêter à la fin de la procédure décrite in 3.2.4. </li><li> Retirer l&#39;ensemble CoW en tirant doucement avec la pince. Placez la vache dans un plat de 60 mm de Pétri remplie de PBS glacé et enlever tout tissu cérébral fixé restant avec deux pinces, tenant la vache en place avec de petites épingles. </li><li> Maintenir la CoW récoltées à -80 ° C pour un traitement ultérieur pour la purification de l&#39;ARN (des rendements d&#39;extraction de l&#39;ARN des grandes quantités d&#39;ARN - environ 500 ng) ou de l&#39;extraction des protéines. Remarque: La vache peut être maintenue ex vivo pendant 24 heures, en adaptant le système de bain d&#39;organe développé pour la souris isolée artère olfactive 7. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figure 1: Diagramme schématique d&#39;une vue ventrale du cerveau de souris Soulignant la vache La vache est formée à partir des deux artères carotides internes (MCA), qui sont dérivés des deux artères cérébrales antérieures (ACA);. basilaireartère (BA) branches dans la partie postérieure (PCA) et supérieur (SCA) artères cérébrales, et deux artères vertébrales (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole reproductible pour l&#39;isolement du cercle de Willis. Les troubles cérébro-vasculaires les plus courantes impliquant la vache sont vasculopathies CAA-associée, l&#39;athérosclérose intracrânienne et anévrisme intracrânien, tous qui affectent les parois des vaisseaux artériels. Les facteurs de risque sont bien connus, mais la pathogenèse moléculaire de ces troubles cérébraux reste mal comprise et des marqueurs biologiques spécifiques pour prédire leur occurrence font défaut. Il y a un in...

Le cercle cérébral artériel (circulus artériel cérébral), également connu sous le cercle de Willis (GC), boucle de Willisor Willis polygone) a été décrite par Thomas Willis en 1664. Il est une anastomose circulatoire située autour du chiasma optique et de l&#39;hypothalamus qui peut être considéré comme un moyeu central d&#39;alimentation sanguine vers le cerveau et les structures environnantes. Le sang entre dans la structure par l&#39;intermédiaire de la carotide interne et des artères vertébrales et il sort du cercle par le milieu intérieur et les artères cérébrales postérieures. Chacune de ces artères branches a gauche et à droite de chaque côté du cercle. Le basilaire, après communication, et communicante antérieure artères complète le cercle (figure 1 et figure 2). Le risque d&#39;une altération de la circulation sanguine dans l&#39;une des artères d&#39;écoulement est minimisée par la fusion du sang entrant dans le cercle de la carotide et des artères cérébrales, garantissant ainsi que suffisamment de sang est fourni au bpluie. Cette structure est aussi la principale voie pour la circulation sanguine collatérale dans les maladies occlusives sévères de l&#39;artère carotide interne. Plusieurs types de troubles cérébro-vasculaires ont leur origine dans la vache. Les plus courants sont l&#39; angiopathie cérébrale amyloïde (CAA) de vasculopathies -Associated, l&#39; athérosclérose intracrânienne et des anévrismes intracrâniens. 1, 2, 3 Ces troubles peuvent conduire à une hypoperfusion due à la vasodilatation, et intracérébrales et / ou subarachnoïdiens hémorragies finalement traduire en accidents vasculaires cérébraux ischémiques ou hémorragiques ou , au mieux, une attaque ischémique transitoire. Des progrès récents dans les procédures de diagnostic, y compris la neuro-imagerie, éventuellement associée à une angiographie, ont permis de diagnostiquer cliniquement ces grandes maladies vasculaires cérébrales, sans la nécessité d&#39;une biopsie du cerveau. Néanmoins, des traitements efficaces et spécifiques (pharmacologiques ou endovasculaires) font actuellement défaut et il est donc nécessaire de définir de nouvellesles cibles moléculaires. L&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention de ces maladies chez les humains, il faudra des modèles animaux et les moyens de l&#39;isolement de la cérébro-vasculaire, y compris la vache. Ces modèles devraient fournir des preuves et des indices de changements aux particuliers, y compris les changements inflammatoires, se produisant dans les parois des gros vaisseaux dans des modèles animaux de l&#39; anévrisme de l&#39; artère intracrânienne, CAA ou l&#39; athérosclérose intracrânienne. 4, 5, 6 Nous avons établi une méthode d&#39;isolement de CoW de la souris pour faciliter les études de l&#39;inflammation des vaisseaux dans la maladie d&#39;Alzheimer (AD) et les maladies connexes, tels que CAA. Cette méthode d&#39;isolement de la vache souris a été mis au point pour l&#39;évaluation de l&#39;expression du gène vasculaire cérébral inflammatoire lors de la progression de la maladie. Avec la détection des dépôts bêta-amyloïde dans les parois des artères leptoméningés et piales, cette méthode pourrait rendre plus facile à découragermine de la relation possible entre l&#39;expression des gènes inflammatoires dans la paroi cérébro-vasculaire et de l&#39;accumulation peptide Aß. Le réseau vasculaire du cerveau, y compris le leptoméningée et la pie-mère dans l&#39;espace sous-arachnoïdien est une extension des grosses artères formant le cercle de Willis. La méthode décrite ici pourrait être utilisé pour isoler la vache d&#39;une lignée de souris et pourrait être utilisé pour tous les types de dépistage (par exemple, l&#39; expression des gènes, la production de protéines et de modifications de protéines post - traductionnelles) sur les grands navires de la souris cérébro-vasculaire.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Tamponné Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pince</td><td>Outils Scientifiques Fins</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à Iris Fins Trempés&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux - Droit / Tranchant / Tranchant &nbsp ; Outils</td><td>de sciences fines</td> 16,5 cm <td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Pinces&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à zoom stéréoscopique</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Plat de culture</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute ; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour isoler le cercle de souris de willis

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Le cercle cérébral artériel (circulus artériel cérébral) ou d&#39;un cercle de Willis (GC) est une anastomose circulatoire entourant le chiasma optique et de l&#39;hypothalamus qui fournit le sang vers le cerveau et les structures environnantes. Il a été impliqué dans plusieurs troubles cérébro-vasculaires, y compris l&#39;angiopathie cérébrale amyloïde (CAA) vasculopathies -Associated, l&#39;athérosclérose et intracrânienne anévrismes intracrâniens. Les études sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces maladies pour l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour leur prévention nécessitent des modèles animaux. Certains de ces modèles peuvent être transgéniques, alors que d&#39;autres nécessiteront l&#39;isolement du cérébro-vasculaire, y compris la méthode de CoW.The décrit ici est approprié pour l&#39;isolement de vache dans toute lignée de souris et a un potentiel considérable pour le criblage (expression des gènes, la production de protéines, modifications des protéines post - traductionnelles, analyse sécrétome, etc.) des études sur les grands navires de la cérébro de la sourisvasculature. Il peut également être utilisé pour des études ex vivo, en adaptant le système de bain d&#39;organe isolé développé pour les artères olfactives de la souris.

<html> La souris PBS-perfusé est tué et la vache est isolé comme décrit dans la section 3.2 du protocole. Lorsque la dissection est effectuée correctement, la vache doit sortir en un seul morceau et devrait être légèrement transparent en raison de l&#39;absence de sang résiduel dans le système vasculaire. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figure 2: La vache souris a...

Nous décrivons ici un protocole reproductible pour isoler le cercle de souris de Willis.

Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

L'objectif général de cette procédure de dissection est d'isoler le cercle de Willis murin afin de faciliter l'étude des gros vaisseaux de la vascularisation cérébrale de la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de l'expression génique vasculaire cérébrale dans diverses maladies affectant les vaisseaux cérébraux, telles que la maladie d'Alzheimer et l'angiopathie cérébrale amyloïde. Le principal avantage de cette technique est que les gros vaisseaux peuvent être isolés rapidement et facilement sans altérer leur structure.Commencez par utiliser des ciseaux Iris pour pratiquer une incision de quatre centimètres de long dans la paroi abdominale et le péritoine d’un souris profondément anesthésiée, juste sous le bord des côtes. Ensuite, pratiquez une incision de quelques millimètres de long dans le diaphragme, puis prolongez l’incision sur toute la longueur de la cage thoracique afin d’exposer la cavité pleurale. Soulevez le sternum et pincez son extrémité avec une pince hémostatique, en appuyant la pince contre la nuque.Ensuite, retirez soigneusement le tissu adipeux reliant le sternum au cœur. Introduisez maintenant une aiguille de perfusion de calibre 15 dans le ventricule gauche jusqu'à l'apex cardiaque, puis utilisez des ciseaux pour sectionner un des lobes du foie afin de créer une sortie pour le liquide de perfusion. Perfusez l'animal avec 25 à 50 millilitres de PBS à un débit de pompe de 2,5 millilitres par minute pendant environ dix minutes.Le foie doit devenir pâle lorsque le sang est remplacé par du PBS. Lorsque le liquide provenant du foie est complètement clair, arrêtez la perfusion. Pour isoler le cerveau, utilisez des ciseaux Iris pour pratiquer une incision médiane le long de la peau, du cou jusqu'au nez.Retirer la peau avec les ciseaux à iris afin d'exposer le crâne et d'éliminer tout tissu musculaire résiduel et tout tissu adipeux. Ensuite, insérer les pointes des ciseaux à iris dans un côté du foramen magnum et faire glisser délicatement les pointes le long de la surface interne du crâne jusqu'au méat auditif externe. Effectuer une incision similaire de l'autre côté du foramen magnum, puis une incision médiane le long de la surface interne de l'os interpariétal jusqu'au début de la suture sagittale.Placer les ciseaux Iris fermés sur l'os frontal entre les yeux, au niveau de la suture sagittale, puis ouvrir les lames pour fendre le crâne en deux. À l'aide de la pince, saisir les bulbes olfactifs et utiliser les ciseaux Iris pour sectionner les connexions nerveuses situées sur la surface ventrale du cerveau. Ensuite, plonger le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS glacé.Pour isoler le cercle de Willis, transférez la boîte sur un sachet réfrigérant sous un microscope stéréoscopique et retournez le cerveau sur sa face dorsale afin de visualiser le cercle de Willis. Utilisez la pince fine pour saisir les artères cérébrales antérieures à la base des lobes olfactifs, puis exercez une pression pour dissocier ces artères du réseau vasculaire. Coupez les artères cérébrales moyennes de la même manière.Ensuite, utilisez les extrémités pointues de la pince pour saisir les artères cérébrales moyennes et soulever le départ des artères communicantes postérieures, en déconnectant ainsi les deux paires d'artères du cerveau. Puis, soulevez les artères antérieures en les tirant doucement au-dessus du chiasma optique dans une direction antérieure et dorsale. Retirez les artères cérébelleuses supérieure et postérieure de la même manière, suivies du déplacement de l'artère basilaire.Enfin, utilisez la pince pour transférer délicatement tout le cercle de Willis dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du PBS glacé, puis fixez les vaisseaux en place à l’aide d’épingles fines, en utilisant deux pinces pour retirer soigneusement tout tissu cérébral restant. Le cercle de Willis doit sortir d’un seul tenant et présenter une légère transparence due à l’absence de sang résiduel dans la vascularisation. Le cercle de Willis propre doit exprimer spécifiquement des marqueurs des cellules musculaires lisses vasculaires, tels que l’actine des muscles lisses, la myosine lourde des muscles lisses et la smoothéline.Les marqueurs neuronaux, tels que la glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline ou la protéine 2 associée aux microtubules, devraient, en revanche, être à peine détectables dans le cercle de Willis. De plus, l'expression du marqueur endothélial, E-sélectine, dans les tissus nerveux situés en dehors du cercle de Willis, est très similaire à celle observée dans les échantillons du cercle de Willis, ce qui reflète peut-être l'existence d'un réseau de capillaires cérébraux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les vaisseaux cérébraux de la souris sont très fins et se rompent facilement. Ainsi, la dissection doit être effectuée avec beaucoup de précaution, sans précipitation, afin de garantir que l'ensemble de la structure soit prélevée en un seul morceau. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs spécialisés dans le domaine des maladies inflammatoires du système nerveux pour explorer les troubles vasculaires cérébraux dans des modèles murins de la maladie d'Alzheimer et de maladies apparentées telles que l'angiopathie cérébrale amyloïde.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler le cercle de Willis chez une souris.

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Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris. Cette procédure est utilisée dans la recherche en neuroimmunologie pour comprendre comment les cellules immunitaires du plexus choroïde affectent la santé du cerveau et diverses maladies neurologiques.

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Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

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Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

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Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Apprenez à isoler le cercle de Willis chez la souris pour étudier la cérébrovasculature et l'expression génique vasculaire. Cette méthode préserve l'intégrité structurelle des vaisseaux sanguins cérébraux.

Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

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