Name: Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Apprenez à préparer des coupes de thymus pour modéliser la sélection positive et négative des lymphocytes T en développement. Cette technique permet d'étudier la migration, la localisation et la signalisation des thymocytes in situ par cytométrie en flux et microscopie biphotonique.

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Nous tenons à remercier Marilaine Fournier pour ses commentaires sur le manuscrit et Josée Tessier pour son assistance technique. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 ont été obtenus par le biais du programme d’échange NIAID, NIH. Cette recherche est financée par une subvention de la Fondation SickKids et de l’IDSEAJN des IRSC (NI15-002), une subvention de fonctionnement de l’IMII des IRSC (MOP-142254) et des fonds de démarrage de l’Établissement de jeunes chercheurs (FRQS) et de la Fondation de l’Hôpital Maisonneuve-Rosemont à HJM. HJM est un boursier junior 1 du FRQS, un nouveau chercheur des IRSC (MSH-141967) et un récipiendaire d’une bourse de transition de carrière en début de carrière de la Fondation Cole.

Protocoles pour toutes les études animales ont été approuvées par le Comité de protection des animaux au Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. La récolte de la souris Thymus pour la préparation des tranches thymiques et seule cellule Suspensions <ol><li> Euthanize la souris avec du CO 2 suivie d&#39; une dislocation cervicale. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, la broche de la face ventrale de la souris jusqu&#39;à une planche de dissection. Pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol. Retirez tout excès d&#39;alcool en tamponnant avec de la gaze pour empêcher l&#39;éthanol de pénétrer dans la cavité thoracique et endommager les tissus. </li><li> Soulevez la peau à la base du sternum avec une paire de pinces et de faire une coupe à travers la peau. Prolonger la coupe de la peau vers le haut à chaque forelimb. </li><li> Faire une coupe supplémentaire à la base du sternum pour séparer la membrane de la cage thoracique. Puis coupez chaque côté de la cage thoracique vers la clavicule. Retournez la cage thoracique plus vers la tête d&#39;exposer la cavité thoracique. Les deux lobesles thymus se situent au-dessus du cœur. </li><li> Retirer le tissu conjonctif autour des lobes thymiques en utilisant des pinces, des ciseaux de microdissection, et / ou des ciseaux courbes tranchantes. Utilisez une paire de fines pointes incurvées pince pour soulever les lobes individuels de dessous ou par l&#39;intermédiaire du tissu conjonctif restant. Note: Ne pas saisir le thymus directement. </li><li> Placez les lobes thymiques dans un tube conique de 15 ml contenant du PBS et mis de côté sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 2. Agarose Embedding et Vibratome tranchage de thymiques Lobes <ol><li> Préparer une solution à 4% d&#39;agarose pour l&#39;enrobage en dissolvant 2 g bas point de fusion d&#39;agarose dans 50 ml de PBS stérile et micro-ondes sur un réglage bas jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose soit complètement dissous. Couvrir flacon de papier d&#39;aluminium et placer dans un bain-marie à 55 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Dans une culture tissulaire capot, de préparer un milieu complet RPMI 1640 qui contient 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 4 mM de L- glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine, et 10 pM2-mercaptoéthanol. </li><li> Ajouter 1,5 ml de milieu RPMI complet 1640 par puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits et placer un insert de culture cellulaire dans chaque puits. Placer la plaque de côté dans un incubateur à 37 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer un bain slushy d&#39;eau glacée avec de l&#39;eau et de la glace dans un seau à glace. </li><li> Retirez délicatement tout le reste du tissu conjonctif entourant chaque lobe thymique utilisant pince fine pointe. Pour ce faire, tandis que le lobe thymique est immergé dans du PBS dans une boîte de culture de tissu, après le transfert sur un tissu lingette imbibé de PBS, ou sous un microscope à dissection. </li><li> Laisser l&#39;agarose refroidir en dessous de 40 ° C, lorsque le ballon est juste tiède au toucher, pour éviter la surchauffe du tissu. Verser le refroidissement 4% d&#39;agarose dans un moule de tissu à une hauteur d&#39;environ 1 cm. </li><li> Utilisez une paire de pinces pour transférer soigneusement le lobe thymique à un tissu essuyez et rouler doucement pour sécher sans endommager les tissus. Assurez-vous que le tissu sèche complètement ou il glissera hors de l&#39;agarose pendant le tranchage. </li><li> Insérez délicatement le lobe dans l&#39;agarose et le positionner horizontalement (pour augmenter la surface de chaque tranche) ou verticalement (pour augmenter le nombre de tranches) au fond du moule. Placer le moule dans de l&#39;eau glacée pendant 5-10 min pour permettre la gélose se solidifier. </li><li> Pendant ce temps, préparer le vibratome à trancher par le montage du bac tampon, l&#39;assemblage du disque de spécimen, et en insérant la lame vibratome. Placez un morceau de ruban de laboratoire sur le disque de spécimen. Stériliser le nettoyage, l&#39;espace de travail assemblé avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Une fois la solidification d&#39;agarose, inverser le moule et appuyez doucement au centre pour libérer le lobe de l&#39;agarose intégré. </li><li> Utilisez une lame tranchante pour couper l&#39;excès d&#39;agarose entourant le lobe laissant ~ 2 mm d&#39;agarose de chaque côté et ~ 0,5 cm en bas. </li><li> Fixer chaque bloc d&#39;agarose avec une goutte de colle de tissu à la pièce de ruban adhésif sur le disque de spécimen. Plusieurs blocs peuvent être collés sur la bande. </li><li> Aligner la lame vibratome wiième sommet du bloc d&#39;agarose. Remplissez le bac tampon avec du PBS stérile jusqu&#39;à ce que le bloc (s) lame et agarose sont complètement immergé. </li><li> Section du tissu d&#39;agarose intégré pour obtenir des tranches d&#39;une épaisseur de 400 à 500 um. Réglez le vibratome à 0,225 mm / sec vitesse de 100 Hz de fréquence, et 5 °. </li><li> Utiliser une spatule recourbée pour recueillir les tranches thymiques dans une plaque de culture tissulaire contenant du PBS stérile car elles sont coupées. Jeter la première et la dernière tranche. </li><li> Examiner les tranches sous un microscope optique à grossissement 4X. Choisissez les tranches avec le tissu thymique intact et entourant agarose (figure 1A). </li><li> Transférer les tranches sur la plaque préparée à l&#39;étape 2.3 en utilisant une pointe de pipette pour glisser doucement la tranche thymique de la spatule coudée sur l&#39;insert de culture cellulaire. Chaque insert peut accueillir ~ 3 tranches. Assurez-vous que les tranches ne se touchent pas les uns les autres ou la culture cellulaire murs d&#39;insertion. </li><li> Maintenir la plaque à 37 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Préparation de thymocytes pour Superposition <ol><li> Isoler lobes thymiques comme décrit dans la section 1. Dissocier les lobes manuellement pour faire une seule suspension cellulaire en utilisant un broyeur 15 ml de tissu stérilisée rempli avec 5 ml de PBS stérile contenant 2% de FBS. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK 1x (0,15 M de NH4CI, 10 mM de KHCO 3, 0,1 mM de Na2EDTA) à la température ambiante pendant 3 minutes pour lyser les globules rouges. </li><li> Remplir le tube à 15 ml avec du PBS contenant 2% de FBS. Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS contenant 2% de FBS et les cellules passent à travers un filtre à mailles de 255 um. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger les cellules à 545 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS contenant 2% de FBS à une concentrtion de 1 x 10 7 cellules par ml. </li><li> Marquer les cellules avec des colorants cellulaires tels que l&#39;ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE des) selon les protocoles du fabricant, sinon en utilisant des thymocytes de souris exprimant les marqueurs congéniques ou rapporteurs fluorescents codés génétiquement pour distinguer des cellules endogènes de tranche. </li><li> Après le lavage final des cellules marquées, resuspendre le culot cellulaire dans un milieu RPMI-1640 complet à 1-3 x 10 6 cellules par 15 pi. </li></ol> 4. Superposition thymocytes sur le thymus Slices <ol><li> Utiliser une pipette pour aspirer tout liquide entourant les tranches thymiques sur l&#39;insert. Remarque: Prenez soin de ne pas endommager l&#39;agarose. Si l&#39;agarose est endommagé, les thymocytes superposées ne seront pas fixer à la surface de la tranche en raison de la perte de tension de surface. </li><li> Sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, overlay 15 pi de thymocytes préparées dans la section 3 sur chaque tranche thymique. </li><li> Incuber les plate à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre aux cellules de migrer dans les tranches thymiques. </li><li> Après 2 heures, rincer les tranches thymiques 3 fois avec 1 ml de PBS pour éliminer l&#39;excès thymocytes superposées qui n&#39;ont pas encore migré dans le tissu. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les tranches thymiques sont prêtes à être récoltées, typiquement de 1 à 72 h en fonction de l&#39;expérience. </li></ol> 5. Dissociation des thymiques tranches pour la cytométrie de flux <ol><li> Préparer un microtube pour chaque tranche en y ajoutant 150 ul de PBS contenant 2% de FBS. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS contenant 2% de FBS à l&#39;insert de culture de tissu avec les tranches thymiques et on agite délicatement avec une spatule recourbée pour détacher les tranches de la surface de la pièce rapportée de culture cellulaire. </li><li> Transférer la tranche de l&#39;insert dans le tube à centrifuger à l&#39;aide d&#39;une spatule coudée. </li><li> perturber manuellement la tranche en utilisant un échantillon de tube centrifuger pilon. Ajouter 150 ul de PBS contenant 2% de FBS jusqu&#39;à un volume final de 300ul. </li><li> Filtrez le tissu dissocié à travers un filtre de 40 um dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Les cellules filtrées sont prêtes à être colorées pour l&#39; analyse cytométrique d&#39;écoulement 40. </li><li> Filtrez les cellules une seconde fois avant de les transmettre sur un cytomètre de flux pour assurer que tous les agarose est éliminé et ne pas obstruer l&#39;écoulement cytomètre. </li><li> Acquérir les cellules sur un cytomètre de flux et analyser les données comme il a été décrit précédemment 40. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des tranches thymiques et des résultats représentatifs de la sélection positive et négative efficace de superposition de pré-sélection du CMH de classe I restreints TCR thymocytes transgéniques par cytométrie en flux. Ce système a été utilisé avec un succès similaire pour soutenir la sélection positive des cellules T CD4 + CMH de classe II restriction de la pré-sélection thymocytes DP 32, et, en présence de l&#39; antigène de l&#39; agoniste, la s...

Les cellules T se différencient par une série d&#39;intermédiaires du développement dans le thymus au cours de laquelle ils rencontrent plusieurs postes de contrôle qui assurent la génération d&#39;une fonction auto-tolérance de répertoire des cellules T 03/01. La sélection positive favorise la survie des thymocytes avec des récepteurs de cellules T (TCR) capables de reconnaître, avec une faible affinité à modérée, peptide présenté par les grandes molécules complexes d&#39;histocompatibilité (CMH) sur les cellules corticales thymiques épithéliales (cTEC) 2,3. La sélection négative et T régulatrices (T reg) le développement des cellules contribuent à la mise en place d&#39; une auto-tolérance par l&#39;élimination ou le détournement de thymocytes qui répondent fortement à l&#39; auto-peptide présenté par le CMH 2,4. Immature CD4 + CD8 + double positive (DP) thymocytes exprimant des TCR qui passent le processus de sélection se différencient en sous - populations de cellules T matures, dont la majorité sont CMH de classe I restreints cytotoxiques CD8 +ou du CMH de classe II restreint (SP) des cellules T CD4 + auxiliaires simples positifs, avant de quitter le thymus pour exécuter des fonctions effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires 1-3. Ajoutant à la complexité du développement des cellules T est la migration dynamique et rencontres cellulaires de développement thymocytes à travers le réseau de cellules stromales 5-9. Ces cellules stromales jouent des rôles distincts dans le développement des thymocytes et sont différentiellement répartis entre les régions corticales et médullaires thymiques où positive et la sélection négative se produisent 10. Bien que la sélection positive se déroule principalement dans le cortex, il y a accumulation de preuves que thymocytes DP migrent vers la moelle et continuent d&#39;exiger des signaux TCR avant qu&#39;ils ne se différencient en cellules T matures suggérant que la moelle peut fournir des signaux supplémentaires nécessaires à l&#39;achèvement de la sélection positive et de la lignée différenciation 11,12. Plus loin,malgré la présence de cellules spécialisées médullaires thymiques épithéliales (MTEC) qui expriment et présentent des antigènes tissulaires restriction facilitant la suppression des thymocytes autoréactifs 13,14, une grande partie de la sélection négative se produit dans le cortex en réponse à ubiquitaire exprimé auto-peptide présenté par dendritique cellules 15,16. Ainsi, des modèles précis de développement des cellules T doivent fournir un microenvironnement thymique très organisée, avec corticale intacte et les régions médullaires, qui facilite l&#39;interaction entre les thymocytes et les cellules stromales, et prend en charge la migration des thymocytes que ces cellules subissent une sélection positive et négative. Afin de compléter l&#39; analyse ex vivo de thymocytes comme moyen d&#39;étude de sélection positive et négative, un certain nombre d&#39;in vitro, in situ et in vivo dans des modèles de développement des cellules T ont été développés 17-22. Il a été notoirement difficile de récapitulersélection positif in vitro, mais coculture des populations de cellules souches ou de précurseurs de cellules T avec des cellules stromales exprimant ligand Notch, notamment OP9-DL1 / 4 cellules, a la capacité de soutenir l&#39; engagement de la lignée T et une sélection positive limitée qui en fait un précieux modèle in vitro pour étude T développement des cellules 23-25. Limitations de ce système, cependant, comprennent le fait que ces cellules manquent de machines de traitement du peptide unique qui se trouve dans les cellules stromales thymiques et le microenvironnement thymique en trois dimensions. Bien que techniquement plus lourd, in situ et in vivo dans des modèles de sélection thymique peut surmonter certains obstacles liés aux systèmes in vitro. Cultures d&#39;organes thymiques réagréger (RTOC) contiennent des mélanges de thymocytes et les cellules stromales thymiques 18,26,27 définies. Ces reaggregates de cellules épithéliales thymiques maintenir la classe I et II l&#39;expression du CMH et peuvent soutenir development des deux sous-ensembles classiques de cellules T, mais manquent encore défini les structures corticales et médullaires. Culture d&#39;organes thymique fœtal (FTOC) est un modèle populaire du développement des cellules T qui peuvent être ensemencé avec thymocytes par culture goutte pendante de lobes thymiques lymphodepleted ou par injection de thymocytes en lymphoreplete lobes thymiques et soutenir le développement efficace des CD4 + et CD8 + T cellules au fil du temps dans la culture 18,28-31. Au début de la culture des lobes thymiques fœtaux il y a un manque de mTECs, mais les structures corticales et médullaires définies peut se développer au fil du temps en fonction des conditions. Une considération importante est que ce modèle peut préférentiellement soutenir foetal contre le développement des cellules T de l&#39;adulte. Enfin, l&#39;injection intrathymique des précurseurs thymiques définis chez la souris adulte est techniquement difficile, mais prévoit clairement un environnement pour soutenir Développement des cellules T in vivo. Ceux - ci in situ et des modèles in vivo sont d&#39; excellents outils de to le développement étude des lymphocytes T et leur utilisation doivent être considérés sur une base expérience par expérience. Tranches thymiques, cependant, ont récemment émergé comme un modèle complémentaire polyvalent pour étudier la sélection thymique in situ avec la possibilité d&#39;accueillir unique, complexe, et les expériences de débit généralement plus élevés. Tranches thymiques maintenir l&#39;intégrité des régions corticales et médullaires et fournissent un cadre de cellules stromales qui prend en charge la migration des thymocytes au cours du développement ainsi que l&#39; efficacité de sélection positive et négative 11,32-39. Sous - ensembles ajoutés au - dessus des tranches thymiques thymocytes migrent dans les tissus et à leur microenvironnement créneau approprié 34,37. Thymocytes superposées peuvent être distinguées des cellules endogènes de tranche thymique par des marqueurs ou des marqueurs fluorescents congéniques et peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs jours. cultures thymique tranche organotypiques peuvent être utilisés pour étudier divers aspectsdu développement des cellules T y compris la sélection thymique, le comportement des thymocytes (migration et interactions cellulaires), et thymocytes localisation, entre autres. Etant donné la possibilité de générer ~ 20 tranches thymiques par souris, l&#39;évolutivité des expériences est généralement supérieure à l&#39; autre dans des modèles in situ de sélection thymique. Bien que la préparation de tranches thymiques nécessite un équipement spécialisé, comme le vibratome, et la durée de vie des tranches thymiques dans la culture est limitée en raison de la perte de cellules dans le temps par l&#39;intermédiaire de la mort cellulaire et l&#39;absence d&#39;une membrane d&#39;encapsulation, des tranches thymiques fournissent un excellent modèle pour l&#39;analyse de la sélection thymique des populations synchronisées de thymocytes dans un microenvironnement thymique mature. Ici, nous décrivons la préparation de tranches thymiques (y compris la récolte du thymus, de l&#39;agarose plongement de lobes du thymus et vibratome sectionnement du tissu incorporé), l&#39;isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l&#39;analyse cytométrique de flux.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Moule d’enrobage d’agarose à basse température de fusion</td></tr><tr><td>(tronqué - T12)</td><td>Polyciences</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm carré, tronqué à 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Lames de préparation à double tranchant</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif pour tissus</td><td>3M&nbsp ;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0,4 et micro ; m Inserts de culture cellulaire&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>De plusieurs marques testées, celles-ci ont maintenu les cellules au sommet des tranches le meilleur</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 avec L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>L-Glutamine inactivée par la chaleur</td></tr><tr><td>, 200</td><td>mM Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Broyeurs de tissus</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter Component</td><td>Supply</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube Échantillon Pilon</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 et micro ; m Nylon Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Pince Inox Tip</td><td>Dumont&nbsp ;</td><td>RS-5047</td><td>Pince incurvée à pointe fine, taille .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Micro Pince</td><td>Dumont&nbsp ;</td><td>RS-5090&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et applications de cultures organotypiques de thymus slice

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymiques produit de sélection dans un microenvironnement thymique unique et hautement organisée aboutissant à la génération d&#39;un répertoire des cellules T auto-tolérance fonctionnelle. Dans les modèles in vitro pour étudier l&#39; engagement de la lignée de T et de développement ont permis de mieux comprendre ce processus. Cependant, ces systèmes manquent de milieu thymique complet en trois dimensions nécessaires pour le développement des lymphocytes T et, par conséquent, sont des approximations incomplètes de sélection thymique in vivo. Certains des défis liés au développement de la cellule de modélisation de T peuvent être surmontés en utilisant des modèles in situ qui fournissent un microenvironnement thymique intact qui soutient pleinement la sélection thymique de développer des cellules T. Cultures tranche organotypiques thymiques complètent existant techniques in situ. tranches thymiques préserver l&#39;intégrité des régions corticales et médullaires thymiques et fournissent une plate-forme pour étudier le développement des thymocytes superposées d&#39;un stade de développement défini ou de endogène T caunes dans un microenvironnement thymique matures. Compte tenu de la capacité de générer ~ 20 tranches par souris, des tranches thymiques présentent un avantage unique en termes d&#39;évolutivité pour des expériences à haut débit. En outre, la relative facilité à générer des tranches et le potentiel thymiques de superposer différents sous-ensembles de thymiques ou d&#39;autres populations de cellules issues de milieux divers génétiques renforce la polyvalence de cette méthode. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de tranches thymique, l&#39;isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l&#39;analyse cytométrique de flux. Ce système peut également être adapté pour étudier le développement des cellules T non conventionnelles, ainsi que de visualiser la migration des thymocytes, des interactions de cellules stromales thymocytes et des signaux associés à la sélection de TCR thymique par microscopie biphotonique.

Thymique analyse de soutien des tranches de différents aspects du développement des cellules T telles que la sélection positive et négative. Pour les expériences réussies, la qualité de la tranche thymique est primordiale. Ainsi, les tranches thymiques devraient être examinés pour assurer l&#39;intégrité du tissu thymique et que l&#39;agarose entourant la tranche thymique est intacte (figure 1A). La tension superficielle peut être compromise lorsque l&...

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l&#39;analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des tranches thymiques qui, combinées à la cytométrie en flux, peuvent être utilisées pour modéliser la sélection positive et négative des lymphocytes T en cours de développement. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant le développement des lymphocytes T, telles que les signaux régulant la sélection positive et négative des lymphocytes T en cours de maturation dans leur environnement tissulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les tranches thymiques préservent l'intégrité du cortex et de la moelle thymiques, tout en offrant une plateforme pour étudier le développement de sous-populations définies de thymocytes au sein d'un microenvironnement thymique intact.Commencez par épingler un souris euthanasiée sur une planche de dissection avec la face ventrale vers le haut. Vaporisez la souris avec de l'éthanol à 70 %, puis absorbez l'excès d'éthanol avec de la gaze afin d'empêcher qu'il n'entre dans la cavité thoracique et n'endommage les tissus. Ensuite, soulevez la peau à la base du sternum à l'aide d'une pince et faites une incision à travers la peau.Étendre la coupure de la peau vers le haut jusqu'à chaque membre antérieur. Effectuer une coupure supplémentaire à la base du sternum afin de séparer le diaphragme de la cage thoracique. Ensuite, couper chaque côté de la cage thoracique en direction de la clavicule et rabattre la cage thoracique vers la tête, exposant ainsi la cavité thoracique.Les deux lobes du thymus se trouvent au-dessus du cœur. Utilisez une pince et des ciseaux de microdissection pour retirer le tissu conjonctif entourant les lobes thymiques. Ensuite, utilisez une paire de pinces courbes à extrémités fines pour soulever les lobes individuels par en dessous, ou par l'intermédiaire du tissu conjonctif restant.Placer les lobes thymiques dans un tube conique de 15 millilitres contenant du PBS et les garder sur de la glace jusqu'à utilisation. Préparer d'abord une solution d'agarose à quatre pour cent pour l'inclusion en dissolvant deux grammes d'agarose à bas point de fusion dans 50 millilitres de PBS stérile, puis chauffer au four à micro-ondes à puissance faible jusqu'à dissolution complète de l'agarose. Recouvrir le flacon de papier d'aluminium et le placer dans un bain-marie à 55 degrés Celsius jusqu'au moment de l'utiliser.Dans une hotte de culture tissulaire, ajoutez 1,5 millilitre de milieu RPMI-1640 complet dans les puits d'une plaque de culture cellulaire à six puits. Ensuite, placez un insert de culture cellulaire dans chaque puits. Réservez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu'à utilisation.Préparez un bain d'eau glacée boueuse avec de l'eau et de la glace dans un seau à glace. Transférez les lobes thymiques sur un essuie-tissu imprégné de PBS et retirez soigneusement tout tissu conjonctif résiduel entourant chaque lobe thymique à l'aide de pinces fines. Transférez-les dans une boîte de culture contenant du PBS.Après avoir laissé refroidir l'agarose jusqu'à ce que le flacon soit légèrement tiède au toucher, verser l'agarose refroidie à quatre pour cent dans un moule à tissu sur une hauteur d'environ un centimètre. Ensuite, utiliser une paire de forceps pour saisir délicatement le lobe thymique par le tissu conjonctif restant, puis le rouler doucement sur une lingette en papier pour le sécher sans endommager le tissu. Veiller à ce que le tissu soit complètement sec, sinon il glissera hors de l'agarose lors de la section. Insérez délicatement le lobe dans l'agarose et positionnez-le au fond du moule, soit horizontalement pour augmenter la surface de chaque tranche, soit verticalement pour augmenter le nombre de tranches. Placez le moule dans de l'eau glacée pendant cinq à dix minutes afin de permettre la solidification de l'agarose. Pendant ce temps, préparez le vibratome pour la découpe en fixant le bac à tampon, en insérant la lame du vibratome et en assemblant le disque de spécimen.Placer un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le disque d'échantillon. Enfin, stériliser l'espace de travail assemblé et propre avec de l'éthanol à 70 %. Une fois que l'agarose a solidifié, retourner le moule et appuyer doucement en son centre pour libérer le lobe d'agarose inclus.Utilisez maintenant une lame bien aiguisée pour couper l'excès d'agarose entourant le lobe, en laissant environ deux millimètres d'agarose de chaque côté et 0,5 centimètre au fond. Ajoutez une goutte de colle tissulaire sur le morceau de ruban adhésif du disque d'échantillon et fixez-y le bloc d'agarose. Plusieurs blocs peuvent être collés sur le ruban.Ensuite, alignez la lame du vibratome avec le sommet du bloc d'agarose, puis remplissez le bac à tampon avec du PBS stérile jusqu'à ce que la lame et les blocs d'agarose soient complètement immergés. Réglez les paramètres de coupe sur le vibratome. Sectionnez le tissu inclus dans l'agarose afin d'obtenir des tranches d'une épaisseur de 400 à 500 microns.Utilisez une spatule courbée pour recueillir les tranches thymiques dans une plaque de culture tissulaire contenant du PBS stérile au fur et à mesure de leur découpe. Examinez les tranches au microscope optique avec un grossissement de quatre fois. Sélectionnez les tranches présentant un tissu thymique intact ainsi que l'agarose environnante.Ensuite, utilisez une pipette pour faire glisser délicatement une tranche de thymus depuis la spatule incurvée jusqu'aux inserts de culture cellulaire dans la plaque à six puits. Chaque insert peut accueillir jusqu'à trois tranches. Conservez la plaque à 37 degrés Celsius jusqu'à utilisation.Après avoir isolé les lobes thymiques de souris congéniques, comme précédemment, utilisez un homogénéisateur de tissus stérile de 15 millilitres rempli de cinq millilitres de PBS stérile contenant 2 % de FBS pour dissocier manuellement les lobes. Transférez la suspension de cellules uniques dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 545 ×g pendant cinq minutes à 4 °C.Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de lyse 1 X ACK et incubez à température ambiante pendant trois minutes afin de lyser les globules rouges. Remplissez ensuite le tube jusqu'à 15 millilitres avec du PBS contenant 2 % de FBS. Centrifugez les cellules à 545 ×g pendant cinq minutes à 4 °C.Après avoir re-suspendu le culot cellulaire dans 10 millilitres de PBS contenant 2 % de FBS, faire passer les cellules à travers un filtre maille 255 microns. Compter les cellules à l’aide d’un hématimètre. Après centrifugation des cellules à 545 × g pendant cinq minutes à 4 °C, re-suspendre le culot cellulaire dans du milieu RPMI-1640 complet à raison d’un à trois fois dix puissance six cellules par 15 microlitres, puis procéder au recouvrement des thymocytes.Utilisez une pipette pour aspirer soigneusement tout le PBS entourant les tranches thymiques sur l'insert sans endommager l'agarose. Sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, ajoutez délicatement 15 microlitres des thymocytes préparés sur chaque tranche thymique. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures afin de permettre aux cellules de migrer dans les tranches thymiques.Après deux heures, rincer les tranches thymiques trois fois avec un millilitre de PBS afin d'éliminer les thymocytes excédentaires qui n'ont pas encore migré dans le tissu. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les tranches thymiques soient prêtes à être récoltées, généralement entre une et 72 heures selon l'expérience. Des thymocytes transgéniques restreints par la classe I du CMH avant sélection ont été déposés sur des tranches thymiques, et le développement de lymphocytes T matures CD4 positifs ou CD8 positifs, exprimant un seul marqueur (single positive), a été suivi par cytométrie en flux.Lorsqu'on les superpose à des tranches thymiques provenant de souris knock-out pour la bêta-2-microglobuline, les thymocytes transgéniques pour le récepteur des cellules T OT-1, pré-sélectionnés, restent au stade double positif et ne génèrent pas de lymphocytes T CD8 positifs significatifs en simple positivité. En revanche, lorsqu'ils sont superposés à des tranches thymiques de type sauvage contenant des ligands de sélection endogènes, le développement de lymphocytes T CD8 positifs après 72 heures démontre la capacité de ce modèle à soutenir la sélection positive. Pour modéliser la sélection négative face à un antigène ubiquitaire, des thymocytes marqués au CTV provenant de souris de type sauvage et des thymocytes marqués au CFSE provenant de souris knock-out pour le récepteur des cellules T transgénique OT-1 et pour RAG-1 ont été mélangés en proportions égales et superposés à des tranches thymiques de type sauvage en présence ou en absence d'un peptide d'ovalbumine.Après 24 heures d'incubation, les proportions relatives des cellules superposées ont été analysées par cytométrie en flux. Cette image montre les rapports relatifs des cellules transgéniques OT-1 vivantes positives au CFSE par rapport aux tranches de cellules sauvages vivantes positives au CTV après incubation avec ou sans peptide d'ovalbumine. Une diminution de la proportion relative des cellules transgéniques OT-1 représente une sélection négative des cellules transgéniques OT-1 en présence du peptide d'ovalbumine.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tranches thymiques, isoler des thymocytes et déposer des cellules au-dessus des tranches thymiques afin d'analyser leur développement in situ. Les tranches thymiques peuvent également être utilisées pour d'autres applications, telles que l'immunofluorescence et la microscopie à deux photons, permettant de déterminer la localisation, la migration, les interactions cellulaires et la signalisation du récepteur des cellules T durant la sélection thymique.

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Cette vidéo montre la dissection et l'enlèvement du thymus du fœtus ainsi la préparation des cultures ex vivo de la 2-dGuo traités thymus.

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L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Ce protocole décrit une méthode pour l’imagerie simultanée de thalamocortical axon branching et synapse formation dans cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Les axones thalamocortical individuels et leurs terminaisons présynaptiques sont visualisés par une technique d’électroporation monocellulaires avec DsRed et synaptophysine GFP-étiquetée.

Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

Nous fournissons une méthode pour la génération, la culture et l’analyse systématique des tranches organotypique dérivées de tumeurs pulmonaires murine. Nous décrivons également comment optimiser pour l’épaisseur de la tranche et comment sélectionner des concentrations du médicament pour traiter les tranches de la tumeur.

Mise en place et l’analyse de la tumeur tranche Explants comme une condition préalable à des tests de Diagnostic

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Ce protocole décrit la préparation de cultures en tranches organotypiques (OTSC). Cette technique facilite la culture ex vivo de tissus multicellulaires intacts. Les OTSC peuvent être utilisés immédiatement pour tester leur réponse respective aux médicaments dans un environnement multicellulaire.

Cultures de coupes organotypiques en tant que modèles précliniques du microenvironnement tumoral dans le cancer du pancréas primitif et les métastases

Apprenez à préparer des coupes de thymus pour modéliser la sélection positive et négative des lymphocytes T en développement. Cette technique permet d'étudier la migration, la localisation et la signalisation des thymocytes in situ par cytométrie en flux et microscopie biphotonique.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

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