Externe Excitation Neurones Utilisation de champs électriques et magnétiques et des cultures dans One- à deux dimensions

L’objectif global de ce protocole pour la stimulation électrique et magnétique de cultures unidimensionnelles et bidimensionnelles est d’utiliser efficacement les cultures neuronales comme modèle réduit de stimulation cérébrale à partir duquel nous pouvons extraire des informations et des paramètres importants. L’utilisation de notre protocole de stimulation électrique avec des cultures unidimensionnelles nous permet de mesurer des paramètres spécifiques liés à l’excitation neuronale, par exemple, la chronaxie et la rhéobase dans différents compartiments du neurone. La technique de stimulation magnétique nous permet de comparer l’effet des champs magnétiques par rapport aux champs électriques sur les cultures neuronales.

Ce modèle nous permet également de mieux diagnostiquer et traiter les troubles cérébraux. Nous proposons une méthode efficace et facile pour cultiver des réseaux neuronaux dans n’importe quel modèle de conception, même les réseaux unidimensionnels. Nous pouvons ensuite orienter des champs magnétiques électriques et variables dans le temps par rapport à ces réseaux pour séparer et observer les contributions des différents compartiments du neurone.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de sujets humains ou de modèles animaux, ce qui permet une recherche poussée et exhaustive des bons paramètres pour la stimulation neuronale. Yuri Burnishev, un technicien de mon laboratoire, et Ami Eisen, un doctorant du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez des cultures neuronales à motifs en ensemenceant des cellules neurales sur des lamelles de verre partiellement pré-recouvertes d’une couche de bioréjection.

Pour ce faire, nettoyez les lamelles de 25 millimètres. Et à l’aide d’une machine à pulvériser, enduire la lamelle d’une couche de biorejet. Ajustez les paramètres du processus de dépôt pour créer une couche composée d’un mince film de chrome de six à 10 angströms, qui assure la stabilité du revêtement et d’une couche d’or de 30 angströms d’épaisseur fournissant au revêtement une réactivité thiol.

Une fois le processus terminé, retirez la lamelle de la machine à pulvériser et examinez le revêtement obtenu. Ensuite, assemblez un système de traceur à stylet modifié en remplaçant une pointe d’encre d’un stylo traceur par une aiguille de gravure métallique tranchante. Placez une feuille de caoutchouc collée sur une plaque rigide dans le traceur afin d’assurer une surface solide et à fort frottement lors de la gravure.

Ensuite, ajustez la position de la feuille en appuyant sur les boutons fournis sur le traceur. Une fois la feuille de caoutchouc en place, pipetez une petite goutte d’eau sur sa surface et placez la lamelle pré-enduite sur la goutte. Ensuite, à l’aide du traceur, gravez les couches métalliques par des rayures répétitives générant des lignes de 200 micromètres d’épaisseur pour créer les motifs souhaités.

Avant une stimulation électrique, placez la lamelle ensemencée dans une chambre d’imagerie. Pour stimuler les cellules avec un champ électrique de direction constante, utilisez deux électrodes parallèles séparées de 11 millimètres et situées sur les côtés opposés de la culture plaquées sur les lamelles de 13 millimètres. Ensuite, assemblez la chambre d’imagerie de culture et le porte-électrode correspondant de manière à ce que les électrodes soient immergées dans le milieu extracellulaire et positionnées à un millimètre au-dessus de la culture.

Ensuite, branchez la paire d’électrodes unique sur l’amplificateur opérationnel qui amplifie le signal du générateur. Appliquez une seule impulsion d’onde carrée bipolaire avec un facteur de service de 50 % et une amplitude de 22 volts. Utilisez une onde bipolaire sans composant CC pour éviter l’électrolyse qui peut se produire au niveau des électrodes.

Appliquez l’impulsion pendant 10 microsecondes à quatre millisecondes pour assurer une stimulation efficace tout en évitant les lésions cellulaires. Pour stimuler les cellules avec des champs électriques changeant de direction, utilisez deux paires d’électrodes perpendiculaires. Assurez-vous que les deux paires d’électrodes ainsi que leurs bornes d’alimentation et de surveillance sont complètement isolées électriquement l’une de l’autre et flottent depuis la terre.

Pour modifier l’orientation du champ électrique, faites varier l’amplitude de la tension appliquée aux deux paires d’électrodes. Ensuite, déterminez l’intensité et la direction du champ résultant par addition vectorielle. Pour générer un champ rotatif d’amplitude fixe, appliquez une onde sinusoïdale à une paire d’électrodes tout en alimentant l’autre paire avec une onde cosinus.

Pour commencer la stimulation magnétique, placez une culture neuronale, cultivée selon un motif de forme circulaire, sous le microscope. Stimulez la culture à l’aide d’une bobine de stimulation magnétique circulaire standard et d’un stimulateur de soutien qui sont disponibles dans le commerce. Pour stimuler les cultures avec des intensités de champ magnétique non standard, connectez une bobine de stimulation magnétique sur mesure au stimulateur sur mesure.

Ensuite, à l’aide d’un pointeur laser, alignez le centre de la culture sur le centre de la bobine pour assurer une stimulation réussie. Ajustez les positions de la bobine de manière à ce qu’elle reste à environ cinq millimètres au-dessus du centre de la culture. Une fois la bobine de stimulation correctement positionnée, chargez le stimulateur à un potentiel allant jusqu’à cinq kilovolts.

Ensuite, à l’aide d’un interrupteur à courant élevé et à haute tension, déchargez le courant de voltagnage élevé à travers la bobine de stimulation pour générer une impulsion magnétique qui stimule l’activité des neurones cultivés. Enfin, montez une bobine de ramassage à la même position que la culture neuronale et mesurez l’intensité du champ magnétique généré. Ce schéma montre qu’en appliquant différentes amplitudes d’impulsions de tension aux deux paires d’électrodes, les champs électriques peuvent être orientés sous tous les angles sans qu’il soit nécessaire de tourner manuellement la culture.

Voici des exemples d’enregistrements de transitoires calciques avec stimulation électrique à différentes tensions appliquées. Lors de l’application d’une durée constante de champ électrique, le nombre de neurones qui se déclenchent et répondent au champ électrique montre une distribution gaussienne cumulative en fonction de l’amplitude de la tension. Et voici un exemple de courbe force-durée obtenue en utilisant ce protocole.

Pour les cultures en anneau répondant au champ magnétique, le taux de réussite de la stimulation augmente avec le rayon de culture. Ce graphique illustre la relation entre la taille de l’anneau et l’intensité du champ magnétique. Les excitations les plus réussies des cultures résident dans le chevauchement entre l’espace de la phase expérimentalement accessible et la région à haute probabilité.

Une fois maîtrisée, la préparation des cultures unidimensionnelles peut être réalisée en trois à quatre heures. Lors de la réalisation d’une stimulation électrique et magnétique, il est important de se rappeler de permettre une récupération complète de la culture à partir de l’étape de stimulation et de s’assurer que tout l’équipement flotte par rapport au sol électrique. En suivant cette procédure, d’autres questions peuvent être abordées telles que la culture de neurones de différentes zones du cerveau, la mesure des statistiques, par exemple, des neurones corticaux.

Une autre possibilité est de mesurer les paramètres de n’importe quel neurone modèle de maladie. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie à l’optimisation de la force et des durées nécessaires à une stimulation cérébrale efficace et sûre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer n’importe quel modèle souhaité de cultures neuronales et d’être capable de les stimuler électriquement ou magnétiquement pour l’étude des interactions des neurones avec les champs électromagnétiques.