Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

L’objectif global de cette procédure est de dissocier les neurones exprimant Fos du tissu cérébral de rat adulte frais ou congelé pour un tri cellulaire activé par fluorescence ultérieur, ou FACS. Cette méthode peut être utilisée pour isoler les cellules neuronales d’intérêt afin d’identifier la neuroadaptation moléculaire unique des neurones activés par le comportement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’utiliser des tissus congelés, facilitant l’isolement des cellules de plusieurs zones du cerveau à différents jours.

Pour traiter ce tissu cérébral frais, insérez deux lames de rasoir pré-refroidies ou plus dans les fentes d’une matrice de tranchage de cerveau glacée pour couper des tranches coronales d’un à deux millimètres contenant les régions cérébrales d’intérêt, en plaçant les sections sur une plaque de verre réfrigérée au fur et à mesure qu’elles sont coupées. Tout d’abord, disséquez la région cérébrale d’intérêt, éliminez les autres zones et retirez la substance blanche. Pour congeler le tissu, transférez les échantillons dans un microtube et immergez-le dans de l’isopentane à moins 40 degrés Celsius pendant 20 secondes pour le stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit traité ultérieurement.

Pour hacher le tissu, laissez les échantillons décongeler sur une plaque de verre froide pendant pas plus d’une minute avant de les recouvrir d’une à deux gouttes de solution tampon A. Ensuite, en tenant une lame de rasoir complètement verticale par rapport à la plaque, hachez le tissu 100 fois dans chaque direction orthogonale. Pour bien hacher le tissu, il est essentiel de garder le tissu humide avec le tampon A et de suivre les temps et la direction de hachage spécifiés.

Il est essentiel d’éliminer la majorité de la substance blanche lors de la dissection tissulaire et de garder le tissu recouvert de tampon A pour améliorer l’efficacité du hachage et maintenir la santé des cellules. Lorsque le tissu a été soigneusement traité, utilisez la lame de rasoir pour transférer les morceaux dans un tube de microcentrifugation contenant un millilitre de tampon A froid, et retournez le tube trois à cinq fois pour immerger tout le tissu haché dans la solution. Pour dissocier les fragments de tissu en suspension unicellulaire, granulez les échantillons par centrifugation.

Jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez lentement un millilitre de solution enzymatique froide et fraîchement décongelée le long de la paroi interne du microtube. Et à l’aide d’une pipette de grand diamètre de pointe, aspirez immédiatement et distribuez l’intégralité de chaque granule quatre fois pour disperser les morceaux de tissu hachés.

Ensuite, retournez rapidement le microtube pour éviter que les pastilles ne collent au fond du tube, et incubez l’échantillon en le mélangeant bout à bout pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de la digestion, centrifugez à nouveau le tube et ajoutez 0,6 millilitre de tampon A froid aux cellules. À l’aide de la même pointe de pipette, aspirez et distribuez immédiatement les granulés cinq fois.

Ensuite, sélectionnez une pipette en verre de 1,3 millimètre et utilisez-la pour triturer doucement les échantillons 10 fois. Placez l’échantillon sur de la glace pendant deux minutes pour permettre aux débris et aux cellules non dissociées de se déposer au fond du tube. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution tampon A à la pastille restante et utilisez une pipette de 0,8 millimètre de diamètre pour triturer l’échantillon 10 fois de plus. Après avoir laissé les tissus se décanter comme nous venons de le démontrer, mettez le surnageant en pool avec la première suspension cellulaire et ajoutez 600 microlitres supplémentaires de tampon à la pastille. Ensuite, utilisez une pipette de 0,4 millimètre pour triturer l’échantillon et placez le tube sur de la glace pendant deux minutes pour permettre aux tissus de se déposer.

Le respect des étapes de trituration mécanique dans le protocole est important pour un tri réussi. Ensuite, mettez en pool le surnageant avec les cellules dissociées. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de tampon A à l’échantillon et répétez la trituration de la pipette de 0,4 millimètre trois fois de plus.

Placez les tubes sur de la glace pendant deux minutes pour permettre aux cellules de se déposer. Et ensuite, regroupez le surnageant dans un deuxième tube de 15 millilitres. Répéter le processus de trituration trois fois de plus, à l’aide de la plus petite pipette en verre, augmente considérablement le rendement des cellules pour le tri ultérieur.

Une fois que tous les surnageants ont été collectés, ajoutez 800 microlitres de moins 20 degrés Celsius 100 % éthanol à quatre mirotubes sur de la glace. Ensuite, transférez 800 microlitres de cellules du premier tube de surnageant collecté dans chacun des deux premiers tubes d’éthanol et 800 microlitres de cellules du deuxième tube de surnageant dans chacun des deux derniers tubes d’éthanol. Retournez les tubes pour mélanger les échantillons.

Ensuite, placez les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes, en les mélangeant par inversion toutes les cinq minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez les cellules. Ensuite, en touchant uniquement la paroi du microtube, utilisez une micropipette pour retirer lentement tous les microlitres de chaque surnageant, sauf les 50 derniers litres.

Filtrez chacune des deux suspensions de cellules séparément à l’aide de deux paires différentes de crépines de cellules. Les cellules sont alors prêtes pour le marquage avec des anticorps contre les marqueurs cellulaires d’intérêt et le tri par cytométrie en flux. L’analyse d’échantillons de tissus cérébraux frais et congelés révèle la présence de petites populations homogènes de cellules neuronales de taille et de granularité similaires.

Les petites populations homogènes peuvent être fermées pour exclure tout agrégat cellulaire, et les neurones peuvent être identifiés par leur positivité NeuN et DAPI. Dans les échantillons de tissus frais et congelés, les niveaux d’ARNm NeuN sont également significativement plus élevés dans les populations NeuN-positives que dans les populations NeuN-négatives. En revanche, les niveaux d’ARNm des marqueurs cellulaires gliaux et olidogodendrocytes sont plus élevés dans la population négative aux NeuN que dans la population positive aux NeuN.

Une tendance similaire à l’augmentation des niveaux d’ARNm des marqueurs cellulaires microgaux est observée dans la population négative à NeuN, bien que cela ne soit pas statistiquement significatif. De plus, les niveaux d’ARNm Fos sont plus élevés dans les neurones Fos-positifs que dans les neurones Fos-négatifs, avec une multiplication par trois de l’ARNm Fos dans les neurones Fos-positifs à partir de tissus frais, et une augmentation de onze fois plus d’ARNm Fos dans les neurones Fos-positifs à partir de tissus congelés, confirmant la validité de la méthode d’identification de gènes d’intérêt spécifiques à partir de cellules triées en flux dans des conditions de tissus frais et congelés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre les étapes critiques de prévention de la lyse cellulaire.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le tri cellulaire activé par fluorescence peuvent être effectuées pour isoler les sous-ensembles cellulaires d’intérêt en vue d’une analyse moléculaire ultérieure en aval. L’utilisation de tissus congelés permet de trier les échantillons à des jours différents, ce qui est essentiel pour les expériences qui impliquent des procédures de récolte et de préparation de tissus longues et compliquées. Cette technique peut également être utilisée pour préparer post-mortem des échantillons de cerveau humain congelés stockés pendant plusieurs mois ou années pour le tri par cytométrie en flux.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents au comportement des neurones exprimant Fos ou d’autres cellules de type sauvage immunomarquées d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier les cellules du tissu cérébral de rat frais ou congelé pour le tri cellulaire activé par fluorescence des neurones ou des types de cellules d’intérêt.