Name: Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez le tri cellulaire par fluorescence (FACS) pour analyser les neurones exprimant Fos dans le cerveau de rat frais ou congelé. Cette méthode permet d'isoler des populations neuronales spécifiques pour étudier les neuroadaptations moléculaires.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du NIDA (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. a été soutenu par une nomination au programme de participation à la recherche du NIDA parrainé par les National Institutes of Health et administré par l’Institut d’Oak Ridge pour la science et l’éducation, et a reçu un soutien financier supplémentaire d’une bourse Becas-Chili gérée par le CONICYT et l’Universidad de los Andes, Santiago du Chili. La plateforme FACS de Johns Hopkins a été financée par des P30AR053503 de prix de l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées de l’Institut national de la santé.

<ol><li>Bossert, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+medial+prefrontal+cortex+neuronal+ensembles+mediate+context-induced+relapse+to+heroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin.</a> Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nucleus+accumbens+shell+neuronal+ensembles+in+context-induced+reinstatement+of+cocaine-seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking.</a> J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orbitofrontal+cortex+neuronal+ensembles+in+the+expression+of+incubation+of+heroin+craving%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving.</a> J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+cocaine-activated+nucleus+accumbens+neurons+prevents+context-specific+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization.</a> Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).</li>
<li>Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-fos+to+study+neuronal+ensembles+in+corticostriatal+circuitry+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction.</a> Brain Research. 1628, 157-173 (2015).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric cell sorter.</a> Science. 156, 1364-1365 (1967).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometer%3A+new+instrument+for+ultrarapid+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis.</a> Science. 150, 630-631 (1965).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124, 100-108 (2013).</li>
<li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+a+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128, 173-185 (2014).</li>
<li>Rubio, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-induced+reinstatement+of+methamphetamine+seeking+is+associated+with+unique+molecular+alterations+in+Fos-expressing+dorsolateral+striatum+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons.</a> J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+of+methamphetamine+craving+is+associated+with+selective+increases+in+expression+of+Bdnf+and+trkb%2C+glutamate+receptors%2C+and+epigenetic+enzymes+in+cue-activated+fos-expressing+dorsal+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons.</a> J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).</li>
<li>US National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , (2011).</li>
<li>Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daun02+inactivation+of+behaviourally-activated+Fos-expressing+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles.</a> Current Protocols. , (2016).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+examining+the+role+of+neuronal+ensembles+in+drug+addiction+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).</li>
<li>Mardones, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plasma+membrane+permeabilization+by+freeze-thawing+and+immunofluorescence+epitope+access+to+determine+the+topology+of+intracellular+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins.</a> J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).</li>
<li>Molyneaux, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCoN%3A+genome-wide+analysis+of+in+vivo+transcriptional+dynamics+during+pyramidal+neuron+fate+selection+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex.</a> Neuron. 85, 275-288 (2015).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> J Vis Exp. , e52537(2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

FACS peut être utilisé pour trier les neurones et d&#39;autres types de cellules provenant soit du tissu cérébral adulte frais ou congelé. Comme mentionné dans l&#39;introduction, la possibilité d&#39;utiliser les tissus congelés permet une utilisation optimale des échantillons provenant d&#39;animaux qui ont subi des procédures comportementales complexes et prolongées, comme l&#39;auto-administration et de rechute des études dans la recherche sur la toxicomanie. Ces procédures de comportement prend habituellement 1 - 2...

Au cours de l&#39;apprentissage, les animaux forment des associations entre des ensembles complexes de stimuli très spécifiques. Cette information à haute résolution est pensé pour être codé par des altérations au sein des modèles spécifiques de neurones faiblement distribués appelés ensembles neuronaux. Ensembles neuronaux ont été récemment identifiés par l&#39;induction de gènes précoces immédiatement (PFGE) tels que Fos, Arc et Zif268 et leurs produits protéiques dans les neurones qui ont été fortement activées pendant le comportement ou l&#39; exposition de repère. Fos-neurones exprimant ont été montré en particulier jouer un rôle causal dans le contexte spécifique et-cue des comportements appris 1-4. Ainsi, neuroadaptations moléculaires uniques dans ces neurones Fos exprimant activés sont les meilleurs candidats pour les mécanismes neuronaux qui codent pour les associations formées au cours des troubles d&#39;apprentissage et d&#39; apprentissage anormal normales, telles que la toxicomanie et le trouble de stress post-traumatique (PTSD) 5 apprises. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment permis l&#39;analyse des neuroadaptations moléculaires uniques dans les neurones Fos exprimant. La cytométrie en flux et tri cellulaire ont été développés dans les années 1960 6,7 à caractériser et isoler les cellules en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de lumière et immunofluorescence, et sont utilisés depuis longtemps en immunologie et en recherche sur le cancer. Cependant cytométrie en flux et FACS nécessite des cellules individuelles dissociées qui sont difficiles à obtenir du tissu cérébral adulte. A été utilisé pour la première FACS pour isoler et analyser la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant neurones striataux provenant de souris transgéniques qui ne nécessite pas de marquage d&#39;anticorps de 8,9. Nous avons développé un procédé FACS à base d&#39; anticorps 10 pour isoler et évaluer des modifications moléculaires dans les neurones activés par des médicaments et / ou des indices chez les animaux de type sauvage exprimant 11-15 Fos. Dans ce procédé, les neurones sont marqués avec un anticorps contre le marqueur neuronal général NeuN, tandis que les neurones fortement activéssont marqués avec un anticorps contre Fos. Bien que notre méthode initiale nécessaire mise en commun jusqu&#39;à 10 rats par échantillon pour les tissus frais, les modifications ultérieures du protocole permis FACS isolement de Fos exprimant neurones et Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) analyse des zones discrètes du cerveau à partir d&#39; un seul rat 13-15 . Dans l&#39; ensemble, les altérations moléculaires uniques ont été trouvés dans les neurones activés lors d&#39; une variété de comportements et au contexte cue activé dans la recherche sur la toxicomanie 12,14,15 Fos-exprimant. Un problème logistique majeur à l&#39;exécution de FACS sur tissu frais est qu&#39;il faut une journée entière pour dissocier le tissu et le processus par FACS. En outre, seulement environ quatre échantillons peuvent être traités par jour. Cela signifie généralement qu&#39;une seule zone du cerveau peut être évalué à partir de chaque cerveau et les zones cérébrales restantes doivent être jetés. Ceci est un problème majeur pour faible débit des procédures comportementales telles que l&#39;auto-administration et l&#39;extinction training qui nécessite une intervention chirurgicale et plusieurs semaines de formation intensive. En outre, les procédures comportementales longues et compliquées le jour de test, il est difficile d&#39;effectuer FACS le même jour. Ce serait un avantage significatif pour être en mesure de geler les cerveaux des animaux immédiatement après les tests de comportement, et ensuite isoler les neurones Fos exprimant d&#39;une ou plusieurs zones du cerveau à différents moments de son choix les enquêteurs. Ici, nous démontrons que notre protocole FACS peut être utilisé pour isoler les neurones Fos exprimant (et d&#39;autres types de cellules) de tissu cérébral à la fois frais et congelés. A titre d&#39;exemple, nous avons isolé des neurones de rat striatum après des injections de méthamphétamine aiguës et de rats naïfs sans injections (condition de contrôle) Fos exprimant. Cependant, ce protocole de FACS peut être utilisé suivant un traitement comportemental ou pharmacologique. Après analyse qPCR de nos échantillons a indiqué que l&#39;expression des gènes à partir de ces types de cellules peut être évaluée avec similar efficacité du tissu à la fois frais et congelés.

<table><tbody><tr><td>Matrice cérébrale</td><td>CellPoint Scientific</td><td>69-2160-1</td><td>pour obtenir des coupes de cerveau coronaires</td></tr><tr><td>Hibernate A Low Fluorescence</td><td>Brain Bits</td><td>HA-lf</td><td>Buffer A dans le protocole est utilisé pour le traitement des tissus et des cellules de la dissociation aux étapes de fixation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td>La solution enzymatique du protocole est utilisée pour la digestion enzymatique des tissus avant la trituration</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>pour prévenir la perte de cellules pendant le protocole</td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 &micro ; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>pour filtrer la suspension de cellules</td></tr><tr><td>Cell Strainer, 100 & micro ; m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>pour filtrer la suspension cellulaire</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml tube à essai en polystyrène à fond rond avec filtre cellulaire capuchon pression</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>pour filtrer la suspension cellulaire avant de passer dans le cytomètre en flux</td></tr><tr><td>Pasteur Pipet, Glass</td><td>NIH supply</td><td>6640-00-782-6008</td><td>pour faire la trituration tissulaire</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (souris monoclonale) anticorps</td><td>EMD Anticorps Millipore</td><td>FCMAB317PE</td><td>pour détecter les neurones</td></tr><tr><td>Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (conjugué Alexa Fluor 647)&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>Anticorps 8677</td><td>pour détecter les cellules exprimant Fos</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>pour marquer les noyaux</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems.</td><td>KIT0204</td><td>Le kit comprend le tampon d’extraction d’ARN pour l’étape 6.14. Il est utilisé pour collecter des cellules triées</td></tr><tr><td>Système de synthèse d’ADNc Premier brin Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td>pour synthétiser l’ADNc à partir de l’ARN</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems.</td><td>4391128</td><td>faire de la préamplification ciblée à partir de l’ADNc</td></tr><tr><td>TaqMan Advance Fast Master&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués.</td><td>4444963</td><td>faire de la PCR à l’aide des sondes TaqMan</td></tr><tr><td>Fos TaqMan probe Applied</td><td>Biosystems.</td><td>Rn00487426_g1</td><td>Sonde/amorces TaqMan</td></tr><tr><td>NeuN Sonde TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CACTCCAACAGCGTGAC</td><td>séquence nucléotidique pour marqueur de gène neuronal</td></tr><tr><td>NeuN Amorce avant</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Séquence nucléotidique GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td><td>pour marqueur de gène neuronal</td></tr> <tr><td>NeuN Amorce inverse</td><td>Applied Biosystems.</td>Séquence nucléotidique <td>TTCCCCCTGGTCTTTGTGA</td><td>pour marqueur de gène neuronal</td></tr> <tr><td>Gfap Sonde TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00566603_m1</td><td>Sonde/amorces TaqMan pour marqueur de gène astrocityc</td></tr> <tr><td>iba-1 Sonde TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00574125_g1</td><td>Sonde/amorces TaqMan pour marqueur de gène microglya</td></tr><tr><td>Gapdh Sonde TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Séquence nucléotidique CTCATGACCACAGTCCA</td><td>pour le gène de référence/ménage</td></tr><tr><td>Gapdh Amorce directe</td><td>Applied Biosystems.</td>Séquence nucléotidique <td>GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td><td>pour le gène de référence/ménage</td></tr><tr><td>Gapdh Amorce inverse</td><td>Applied Biosystems.</td><td></td><td>Séquence nucléotidique pour le gène de référence/ménage</td></tr><tr><td>Oligo2 Sonde TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn01767116_m1&nbsp ;</td><td>Sonde/amorces TaqMan pour marqueur de gène oligodendrocytaire</td></tr><tr><td>Pipette P1000</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td>Elle est désignée comme la pipette avec un grand diamètre de pointe aux étapes 3.1 et 3.3 pour la trituration tissulaire légère et à l’étape 6.7 pour la remise en suspension des cellules</td></tr><tr><td>7500 Système PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystems.</td><td>446985</td><td>pour la PCR quantitative</td></tr><tr><td>FACSAria I Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>pour le tri FACS</td></tr></tbody></table>

fluorescence tri cellulaire activé (facs) et gene expression analyse de fos exprimant neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

L&#39;étude de la neuroplasticité et altérations moléculaires dans les comportements appris est de commutation de l&#39;étude des régions du cerveau entier à l&#39;étude des ensembles spécifiques de neurones activés faiblement distribués appelés ensembles de neurones qui interviennent dans les associations apprises. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment été optimisé pour les tissus du cerveau de rat adulte et l&#39;isolement des neurones activés en utilisant des anticorps contre le marqueur neuronal NeuN et de la protéine Fos, un marqueur des neurones fortement activés autorisés. Jusqu&#39;à présent, les neurones Fos exprimant et d&#39;autres types de cellules ont été isolées à partir de tissu frais, ce qui a entraîné jours de traitement longs et a permis un nombre très limité d&#39;échantillons de cerveau pour être évalués après des procédures comportementales longues et complexes. Ici , nous avons constaté que les rendements de neurones et de Fos ARNm de striatum dorsal Fos exprimant étaient similaires entre les tissus fraîchement disséqués et le tissu congelé à -80 ° C pendant 3 - 21 jours. En outre, nous avons confirmé le phénotypedes cellules NeuN-positives et NeuN négatives triées en évaluant l&#39; expression des gènes des neurones (NeuN), astrocytes (GFAP), oligodendrocytaire (Oligo2) et microgial (Iba1) marqueurs, ce qui indique que le tissu congelé peut également être utilisé pour FACS isolement de les types de cellules gliales. Dans l&#39;ensemble, il est possible de recueillir, de disséquer et de geler les tissus du cerveau pour les sessions multiples FACS. Ceci maximise la quantité de données obtenues à partir de sujets animaux précieux qui ont souvent subi des interventions comportementales longues et complexes.

Tri neurones Fos-positifs et Fos-négatifs de tissus frais et congelé striatum dorsal de rats simples après des injections de méthamphétamine aiguës. Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour trier les neurones Fos-positifs et négatifs de Fos à partir d&#39;un seul rat striatum dorsal 90 min après une injection intrapéritonéale de la méthamphétamine (5 mg / kg). les rats naïfs dans leurs cages ont été utilisées comme tém...

Nous présentons ici un Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) protocole pour étudier les altérations moléculaires à Fos-exprimant ensembles neuronaux de tissu cérébral à la fois frais et congelés. L&#39;utilisation de tissus congelés permet FACS isolement de nombreuses zones du cerveau sur plusieurs sessions afin de maximiser l&#39;utilisation de sujets d&#39;animaux précieux.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

L'objectif général de cette procédure est de dissocier les neurones exprimant Fos à partir de tissu cérébral adulte de rat frais ou congelé, en vue d'un tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cellules neuronales d'intérêt afin d'identifier les neuroadaptations moléculaires spécifiques des neurones activés par un comportement. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'utilisation de tissu congelé, facilitant ainsi l'isolement de cellules provenant de plusieurs régions cérébrales à différents jours.Pour traiter ce tissu cérébral frais, insérez deux lames de rasoir prérefroidies ou plus dans les fentes d'une matrice de découpe cérébrale refroidie sur glace afin de couper des tranches coronales d'un à deux millimètres contenant les régions cérébrales d'intérêt, en plaçant les sections sur une plaque de verre refroidie au fur et à mesure de leur découpe. Commencez par disséquer la région cérébrale d'intérêt, jetez les autres zones et retirez la substance blanche. Pour congeler le tissu, transférez les échantillons dans un microtube et immergez le tube dans de l'isopentane à moins 40 degrés Celsius pendant 20

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d'expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d'isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

Cette vidéo présente un protocole permettant d’isoler les cellules de l’hippocampe du rat, y compris les neurones, les astrocytes et la microglie.

Obtention de diverses populations de cellules neurales à partir d’un hippocampe de rat

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Obtention d’une suspension unicellulaire à partir de tissu cérébral de rat congelé

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la technique de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier des types spécifiques de cellules neurales en vue d’une analyse ultérieure de l’expression génique spécifique au type de cellule, des marqueurs épigénétiques et/ou de l’expression des protéines.

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

Le but de cette étude est d'identifier les réseaux cérébraux distribués liés à la récompense en délimitant une technique immunohistochimique fiable en utilisant l'activation de c-fos cellulaire pour mesurer les changements simultanés dans les voies de la dopamine et sites terminaux après nouvelle ingestion de gras et de sucre chez les rats.

Détection simultanée de c-Fos Activation de Sites de récompense dopaminergique mésolimbique et mésocortical Après Naive sucre et de graisse Ingestion chez le rat

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Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

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Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) est un outil puissant pour étudier le rôle de la protéine translocatrice 18 kDa ou de l’expression du récepteur 5HT2A de la sérotonine dans la maladie d’Alzheimer à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit l’application ex vivo de FACS-RTT dans le modèle de rat TgF344-AD.

Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif

Découvrez le tri cellulaire par fluorescence (FACS) pour analyser les neurones exprimant Fos dans le cerveau de rat frais ou congelé. Cette méthode permet d'isoler des populations neuronales spécifiques pour étudier les neuroadaptations moléculaires.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat (Vidéo) | JoVE Journal

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

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