Name: Génie génétique dune levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez un protocole efficace de transformation génétique et de délétion ciblée de gènes chez Yarrowia lipolytica Po1g. Cette méthode améliore la recombinaison homologue par délétion du gène KU70.

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1. Génération de Y. lipolytica KU70 délétion Strain <ol><li> La construction de la cassette de disruption Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifications. <ol><li> Conception des amorces 20 pour amplifier par PCR la cassette d&#39;expression LEU2 (voir le tableau 1) à partir d&#39; un Y. Vecteur d&#39;expression lipolytica et d&#39; introduire des sites LoxP dans le sens 5 &#39;et 3&#39; de la cassette LEU2 avec une longue amorce avant (# 1; tableau 1) et une longue amorce inverse (# 2; tableau 1), respectivement. Pour introduire un site de restriction supplémentaire pour les étapes ultérieures du processus de clonage, ajouter un site de restriction Bam HI dans l&#39; amorce # 1. </li><li> Faire la PCR en utilisant un ADN polymérase haute fidélité comme détaillé dans le tableau 2. </li><li> Purifier le produit PCR LoxP-promoteur-LEU2-terminator-LoxP la cassette en utilisant un purificatio PCRn Kit selon les instructions du fabricant. Ajouter des surplombs 3 &#39;A et le produit de PCR purifié selon les instructions du fabricant 21. Utiliser l&#39; ADN T4 ligase pour ligaturer le produit A-tailed PCR dans un vecteur de clonage TA pour donner le plasmide T-LEU2 selon le tableau 3. </li><li> Amplifier par PCR le 1 kb séquence 5 &#39; en amont du gène en utilisant des amorces KU70 # 3 / # 4 du Y. Po1g lipolytica de l&#39; ADN génomique 22 selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. <ol><li> Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et T-LEU2 plasmidique avec les enzymes Sac II et Bam HI selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. En utilisant l&#39; ADN ligase T4 pour ligaturer le produit purifié et digéré par PCR au Sac II / Bam HI de sites de T-LEU2 pour donner leplasmide T-LEU2-5E selon le tableau 3. </li></ol></li><li> Amplifier par PCR la séquence de 1 kb 3 &#39; en aval du gène en utilisant des amorces KU70 # 5 / # 6 de Y. Po1g lipolytica de l&#39; ADN génomique 22 selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Double digérer à la fois le produit purifié PCR et le plasmide T-LEU2-5E avec Not I et Nde enzymes I selon le Tableau 4. <ol><li> On purifie le mélange de digestion en utilisant un kit de purification de PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer purifié et digéré produit PCR à l&#39;Not I / Nde Les sites que je de T-LEU2-5E pour donner le plasmide T-KO en utilisant l&#39; ADN ligase T4 selon le Tableau 3. </li></ol></li><li> Digest le plasmide T-KO avec Sac II et Nde enzymes I selon le tableau 4 pour produire la cassette de rupture (Figure 1 </strong&gt;). Purifier les fragments d&#39;ADN digérés en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Préparation de cellules compétentes et la transformation de Y. souche lipolytica Po1g <ol><li> Préparation de cellules compétentes <ol><li> Inoculer une colonie de Y. la souche lipolytica Po1g à partir d&#39; une plaque de levure fraîche d&#39; extrait-peptone-dextrose (YPD) dans 10 ml de milieu YPD (1% d&#39; extrait de levure, 2% de peptone, 2% de glucose et 50 mM de tampon citrate pH 4,0) dans un flacon de 100 ml. Incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tpm pendant 20 heures jusqu&#39;à saturation (une DO600 d&#39;environ 15, mesurée en utilisant un spectrophotomètre). </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 5000 x g à température ambiante. Laver les cellules avec 20 ml de Tris-EDTA (TE) du tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), et le culot les cellules comme décrit dans l&#39;étape 1.2.1.2. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 0,1 M d&#39;acétate de lithium (pH 6,0, ajusté avec de l&#39;acide acétique) et incuber pendant 10 min à la chambre temrature. </li><li> Aliquoter les cellules compétentes (100 pi) dans 1,5 ml des tubes stériles. Procéder aux étapes de transformation immédiatement au-dessous, ou ajouter du glycérol à une concentration finale de 25% (v / v) et conserver à -80 ° C pour une conservation à long terme. </li></ol></li><li> Transformation <ol><li> mélanger doucement à 10 ul de l&#39;ADN dénaturé de sperme de saumon (10 mg / ml) et de 1 à 5 ug de la cassette de disruption purifié avec 100 pl de cellules compétentes et on incube à 30 ° C pendant 15 min. </li><li> Ajouter 700 ul de 40% de polyéthylène glycol (PEG) -4000 (dissous dans 0,1 M de lithium acétate pH 6,0), bien mélanger et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 rpm pendant 60 min. Remarque: il est important d&#39;utiliser le PEG avec un poids moléculaire moyen de 4000, au lieu de PEG 3350 (généralement utilisé dans la transformation de la levure classique). </li><li> Choc thermique du mélange de transformation en plaçant le tube dans un bain d&#39;eau à 39 ° C pendant 60 min. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu YPD etrécupérer pendant 2 heures à 30 ° C et 225 rpm. Centrifuger à 9000 g pendant 1 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon TE. </li><li> Repellet les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon TE et on plaque sur des plaques sélectives (par exemple, des plaques déficientes en leucine) et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. </li><li> Choisir entre 4 et 10 colonies individuelles et séparément dans inoculer 2 ml de milieu YPD. Incuber une nuit dans un incubateur en secouant à 30 ° C à 225 tours par minute. Identifier les colonies positives par analyse par PCR de l&#39; ADN génomique provenant de 22 transformants selon le tableau 5 en utilisant deux ensembles d&#39;amorces # 55 / # 56 et # 56 / # 57, respectivement. Note: Le Not I linéarisé pYLEX1 vecteur est transformé en Y. lipolytica Po1g cellules compétentes afin de déterminer l&#39;efficacité de transformation en comptant le nombreunités formant des colonies (ufc) par ug d&#39; ADN plasmidique 23 utilisé. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Marqueur Rescue <ol><li> La construction du plasmide d&#39;expression de Cre <ol><li> Construction de pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH <ol><li> Conception des amorces 20 pour amplifier par PCR les cadres de cre et hph de lecture ouverts. Ajouter une adénine nucléotide supplémentaire en amont des codons de départ dans les amorces sens # 82 et # 84, et d&#39; insérer des sites de restriction Kpnl en aval des codons d&#39;arrêt dans les amorces inverses # 83 et # 85 amplifier par PCR les trames de cre de lecture ouverts et hph de pSH69 (numéro d&#39; accession HQ412578) 24 selon le tableau 2. </li><li> Purifier les deux cre et des fragments hph en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Digest à la fois les cre et hph fragments purifiés avec Kpn I enzyme selon Table 4. Double digérer le plasmide pYLEX1 avec des enzymes Pml I et Kpn I selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. </li><li> Utilisez l&#39; ADN ligase T4 selon le tableau 3 pour ligaturer les cre et hph fragments purifiés et digérés vers des sites Pml I / Kpn I du Y. vecteur d&#39;expression de lipolytica, donnant pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH, respectivement. </li></ol></li><li> Construction de pSL16-CRE-HPH <ol><li> Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de cre partir pYLEX1-CRE en utilisant des amorces # 86 / # 87 flanquant les Sal I / Pst I sites de restriction conformément au Tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant . <ol><li> Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et pSL16-CEN1-1 (227) plasmide 25 avec Sal I etPst I enzymes selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CEN1-1 (227) au niveau des sites correspondant à créer pSL16-CRE en utilisant l&#39; ADN ligase T4 selon le tableau 3. </li></ol></li><li> Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de hph de pYLEX1-HHP en utilisant des amorces # 88 / # 89 flanquant les sites de restriction Xho I / Bgl II selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant . <ol><li> Double digérer à la fois le produit purifié PCR et pSL16-CRE plasmidique avec les enzymes Xho I et Bgl II selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CRE au correspondantsites pour générer pSL16-CRE-HPH en utilisant l&#39; ADN ligase T4 selon le Tableau 3. Remarque: Le Cre expression plasmide résultant, pSL16-CRE-HPH, abrite un marqueur hygromycine B sélectionnable et est un vecteur centromérique et la réplication épisomique (Figure 2). </li></ol></li><li> Vérifiez toutes les constructions par digestion avec des enzymes de restriction appropriées (par exemple, Sal I / Pst I, pour exciser l&#39;insert du vecteur) selon le Tableau 4. </li></ol></li></ol></li><li> Cre recombinase-médiée sauvetage du marqueur <ol><li> Transformer pSL16-CRE-HPS dans des cellules compétentes de la souche knockout KU70 suivant le protocole de transformation décrit dans la section 1.2 ci - dessus. Plate transformé cellules sur YPD, plus hygromycine B (YPDH) plaques (contenant 400 ug / ml d&#39;hygromycine B), et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. </li><li> Effectuer colonie PCR selon le tableau 5 en utilisant des amorces # 84 / # 85 pour identifier positifcolonies contenant pSL16-CRE-HPH plasmidique après transformation. Note: L&#39;amorce sens n ° 84 et l&#39;amorce inverse # 85 sont situés à l&#39; intérieur de la région codante du gène hph (tableau 1). Seuls les clones positifs de générer un produit de PCR spécifique dans la réaction PCR. </li><li> Choisissez un clone positif et inoculer dans 2 ml de milieu YPDH, et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant une nuit à la saturation. Mesurer la densité optique de la cellule 600 avec un spectrophotomètre. Récolter les cellules à une DO 600 de ~ 15. Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante, et laver une fois avec 2 ml d&#39;eau stérile. </li><li> Re-inoculer des cellules dans 2 ml de milieu YPD avec une première DO 600 de 0,1 et permettent aux cellules de se développer dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant la nuit. Streak la culture cellulaire pendant la nuit sur ​​des plaques de YPD pour isoler des colonies isolées 23. Les colonies de la plaque de réplication ONTO YPD, YPDH et les plaques de 23 déficientes en leucine </sup&gt;. Note: Les colonies qui ont perdu à la fois le marqueur LEU2 et pSL16-CRE-HPH plasmide ne peut se développer sur des plaques de YPD (Figure 3). </li></ol></li></ol> 3. Suppression de l&#39;alcool déshydrogénase et de l&#39;alcool oxydase Genes <ol><li> Effectuer une recherche sur Y. base de données du génome de lipolytica utilisant le Local Alignment Search Tool de base (BLAST) pour identifier les gènes candidats pour la suppression 26. Entrer la séquence de la protéine de S. cerevisiae alcool déshydrogénase I dans l&#39; outil de recherche BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). Remarque: L&#39;outil de recherche BLAST retourne séquences les protéines les plus semblables dans le Y. la base de données du génome lipolytica. </li><li> Construire les cassettes de délétion par PCR avec des amorces # 7 à # 56 (tableau 1), et effectuer une digestion de restriction de l&#39; enzyme et les réactions de ligature en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites à la section 1.1 ci - dessus. </li><li> Préparationsont des cellules compétentes de la souche knockout KU70, effectuer des transformations et d&#39; effectuer une PCR pour identifier les colonies positives avec des amorces # 55, # 58 à # 81 (tableau 1) en suivant le protocole décrit dans la section 1.2 ci - dessus. Note: A titre d&#39;exemple, la procédure de suppression du gène YALI0E17787g est décrite dans les figures 4 et 5. Les effets de 1 kb et 2 kb région homologue sur le taux de recombinaison homologue sont rapportés. </li></ol>

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<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Notre objectif pour cette étude est de permettre la génération rapide et efficace de KO de gènes ciblés dans le Y. lipolytica souche Po1g. Plusieurs considérations doivent être abordées pour atteindre cet objectif. Tout d&#39;abord, une grande efficacité de transformation est nécessaire. Ainsi, un protocole de transformation chimique efficace et commode pour le Y. souche lipolytica Po1g a été décrite dans cette étude. L&#39;utilisation de PEG-4000 est un facteur critique pour la trans...

Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, une levure non conventionnelle, peut se développer sous la forme de levure ou mycélium en réponse aux changements des conditions environnementales 1,2. Ainsi, cette levure dimorphique peut être utilisé comme un bon modèle pour l&#39;étude de la différenciation fongique, la morphogenèse et la taxonomie 3,4,5. Il est généralement considéré comme un coffre - fort (GRAS) des espèces de levures, qui est largement utilisé pour produire une variété d&#39;additifs alimentaires , tels que des acides organiques, des polyalcools, des composés aromatiques, des émulsifiants et des agents tensio - actifs 6,7,8,9. Il est un aérobique de obligatoire et une levure oléagineuse bien connu capable d&#39;accumuler naturellement les lipides à des quantités élevées, soit jusqu&#39;à 70% de poids sec des cellules 10. Elle peut aussi utiliser un large éventail de sources de carbone pour la croissance, y compris les différents types de résidus dans le gaspillage de ressources que les nutriments 11,12,13. Toutes ces caractéristiques uniques font Y. lipolytica très attractif pour lesdiverses applications biotechnologiques. Bien que la totalité de la séquence du génome de Y. lipolytica a été publiée 14,15, manipulation génétique de cette levure non conventionnelle est plus complexe que d&#39; autres espèces de levure. Tout d&#39; abord, la transformation de cette espèce de levure est beaucoup moins efficace en raison de l&#39;absence d&#39;un système de transformation génétique 16,17 stable et efficace. En second lieu , l&#39; intégration génomique laborieuse des cassettes d&#39;expression linéaires est couramment utilisé pour l&#39;expression de gènes d&#39;intérêt car aucun système de plasmide épisomique naturel a été trouvée dans cette levure 18. Troisièmement, la génération de knock-outs génétiques et knock-ins sont limitées parce que le gène efficacité du ciblage par recombinaison homologue précis dans cette levure est faible et la plupart des événements d&#39;intégration se produit à travers l&#39; extrémité non homologue de jonction (NHEJ) 19. Dans cette étude, nous présentons un protocole de transformation optimisée pour Y. lipolytica </em&gt; souche Po1g, ce qui est facile, rapide, efficace et reproductible. Pour améliorer la fréquence de recombinaison homologue précise, nous avons supprimé le gène KU70, qui code pour une enzyme clé dans la voie NHEJ. En utilisant le protocole de transformation optimisée et la transformation d&#39; une cassette de knock-out linéaire contenant flanquant régions d&#39;homologie de 1 kb du gène de la KU70 Y. lipolytica Po1g a été supprimé. La robustesse de cette méthode de suppression du gène a ensuite été démontrée en ciblant l&#39; alcool déshydrogénase et les gènes de l&#39; alcool oxydase dans la souche Po1g KU70 Δ. On a observé que la souche de deletion KU70 présentait une efficacité nettement plus élevée du gène de la recombinaison médiée par ciblage homologue à celle de la souche Po1g de type sauvage. En outre, une expression réplicatif Cre plasmide portant le marqueur de résistance à l&#39;hygromycine B a été construit pour réaliser le marqueur de sauvetage. Le sauvetage de marqueur facilite plusieurs tours de ciblage de gènes dans ee a obtenu des mutants de deletion de gène. En plus de la suppression des gènes, notre protocole pour la transformation génétique et la suppression du gène décrit ici peut être utilisé pour insérer des gènes à des loci spécifiques et d&#39;introduire des mutations spécifiques au site en Y. lipolytica génome.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorces oligonucléotidiques</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica souche Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>leucine auxotrophe dérivé de la souche de type sauvage W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vecteur pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Vecteur d’expression Y. lipolytica</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Pour le clonage et la propagation des plasmides</td></tr><tr><td>vecteur pGEM-T&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA vecteur de clonage</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Pour l’isolement des plasmides</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extraire des fragments d’ADN de gels d’agarose et purifier les produits PCR à partir d’une réaction d’amplification</td></tr><tr><td>L’ADN polymérase iProof haute fidélité </td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>ADN polymérase haute fidélité</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>BglII&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>PstI&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>de restriction SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase& nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Échelle d’ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb Échelle d’ADN</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Spermatozoïde de saumon</td><td>ADN Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td> Perles de <td></td><td></td></tr><tr><td>verre (425-600 &micro ; m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de charge d’ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure Bacto</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1ère Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB sans acides aminés</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplément-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Bouillon</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine PCR</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermocycleur</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur stationnaire/à secousses</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>BioPhotomètre plus</td><td></td></tr><tr><td>imageur gel</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

génie génétique d&#39;une levure unconventional for renewable biofuel and production biochemical

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica est une espèce de levure non pathogènes, dimorphes et strictement aérobies. En raison de ses caractéristiques physiologiques distinctifs et caractéristiques métaboliques, cette levure non conventionnelle est non seulement un bon modèle pour l&#39;étude de la nature fondamentale de la différenciation fongique, mais est également une plate-forme microbienne prometteuse pour la production biochimique et diverses applications biotechnologiques, qui nécessitent de nombreuses manipulations génétiques. Cependant, les manipulations génétiques de Y. lipolytica ont été limités en raison de l&#39;absence d&#39;un système de transformation génétique efficace et stable, ainsi que des taux très élevés de recombinaison non homologue qui peut être principalement attribuée au gène KU70. Nous rapportons ici un protocole simple et rapide pour la transformation génétique efficace et pour la suppression du gène en Y. lipolytica Po1g. Tout d&#39; abord, un protocole pour la transformation efficace de l&#39; ADN exogène dans Y. lipolytica Po1g a été créé. Second, pour atteindre le double croisement taux de recombinaison homologue amélioré pour deletion supplémentaire de gènes cibles, le gène KU70 a été supprimée par la transformation d&#39; une cassette de disruption 1 kb portant homologie bras. Troisièmement, mettre en évidence le gène suppression efficacité accrue après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes cibles codant pour l&#39; alcool déshydrogénase et l&#39; alcool oxydase en utilisant les mêmes procédures sur la souche KU70 de plate - forme de KO. On a observé que le taux de recombinaison homologue précise sensiblement augmenté de moins de 0,5% pour la suppression du gène dans KU70 Po1g à 33% -71% pour la suppression d&#39; un gène unique des 11 gènes cibles dans KU70 Po1g Δ. Un plasmide réplicatif portant le marqueur de résistance à l&#39;hygromycine B et le système Cre / loxP a été construit et le gène marqueur de sélection dans les souches de levure knock-out a finalement été éliminé par l&#39;expression de la recombinase Cre pour faciliter des cycles multiples de targemanipulations génétiques ted. Les mutants de délétion d&#39;un gène unique résultant ont des applications potentielles dans les biocarburants et la production biochimique.

Y. linéarisé Vecteur d&#39;expression lipolytica a été inséré dans la plate - forme d&#39;arrimage pBR dans le génome de Y. lipolytica souche Po1g en effectuant une simple recombinaison de croisement 27. En utilisant la procédure rapide de transformation chimique établie dans cette étude, le Y. linéarisé vecteur d&#39;expression lipolytica a été transformé avec succès dans la souche Po1g de type sauvage à une efficacité de transform...

Nous rapportons ici des méthodes de manipulation génétique moléculaire de la souche Po1g de Yarrowia lipolytica pour améliorer l’efficacité de la délétion de gènes. Les souches de Y. lipolytica qui en résultent ont des applications potentielles dans la production de biocarburants et de produits biochimiques.

Génie génétique d&#39;une levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Le but général de cette procédure est de développer des méthodes efficaces de génie génétique pour une espèce de levure non conventionnelle, incluant la construction d'ADN transformant, la transformation de l'ADN, la sélection des transformants et la délétion ciblée de gènes par recombinaison homologue. Nous avons mis au point une technique très performante de délétion génique dans la souche Yarrowia lipolytica PO1G, avec des applications potentielles dans la production de biocarburants et de produits chimiques d'origine biologique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la disruption génique médiée par PCR, réside dans la disponibilité de grandes quantités de fragments de délétion génique ainsi que d'un large éventail de marqueurs sélectionnables.Dans cette étude, nous décrivons un protocole de transformation génétique pour la souche Yarrowia lipolytica PO1G, qui est efficace, simple, reconnu et reproductible. La souche de Yarrowia lipolytica PO1G avec délétion de KU70, construite dans cette étude, présente une fréquence de recombinaison homologue très élevée, permettant des criblages plus rapides et plus faciles des délétions ciblées de gènes. La première étape de cette procédure consiste à amplifier, par PCR, le cassette d'expression LEU2 à partir d'un vecteur d'expression de Y. lipolytica et à introduire des sites LoxP aux extrémités 5' et 3' du cassette LEU2.Un site de restriction BamHI est également introduit dans le premier amorce pour les étapes ultérieures du processus de clonage. Après purification de la cassette promoteur LoxP, LEU2, terminateur LoxP, des extrémités 3' en A sont ajoutées au produit de PCR purifié. Le produit de PCR doté d'une queue en A est ensuite ligaturé dans un vecteur de clonage de type TA afin d'obtenir le plasmide T-LEU2.La deuxième étape de PCR consiste à amplifier la séquence amont de un kilobase à l'extrémité 5' du gène KU70 en utilisant les amorces trois et quatre à partir de l'ADN génomique de Y.lipolytica PO1G. Ensuite, effectuer une double digestion des deux produits : le produit de PCR purifié et le plasmide T-LEU2, à l'aide des enzymes SacII et BamHI, puis ligaturer le produit de PCR purifié et digéré aux sites SacII et BamHI du plasmide T-LEU2 afin d'obtenir le plasmide T-LEU2-5E. La troisième étape de PCR consiste à amplifier la séquence aval de un kilobase à l'extrémité 3' du gène KU70 en utilisant les amorces cinq et six à partir de l'ADN génomique de Y.lipolytica PO1G.Ensuite, digérez doublement le produit PCR purifié et le plasmide T-LEU2-53 avec les enzymes NotI et NdeI, puis ligez le produit PCR purifié et digéré aux sites NotI NdeI de T-LEU2-5E afin d'obtenir le plasmide T-KO. Enfin, digérez le plasmide T-KO avec les enzymes SacII et NdeI pour produire la cassette de disruption. Commencez cette procédure en préparant des cellules compétentes de Y.lipolytica PO1G.Inoculez une colonie de la souche Y.lipolytica PO1G à partir d'une plaque fraîche de dextrose extrait de levure et de peptone, ou milieu YPD, dans 10 millilitres de milieu YPD contenu dans un flacon de 100 millilitres. Incubez pendant 20 heures dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius et 225 tr/min jusqu'à saturation. Le jour suivant, récupérez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 5000 × g à température ambiante.Lavez les cellules avec 20 millilitres de tampon TE et récupérez à nouveau les cellules par centrifugation. Après élimination du surnageant, resuspendez les cellules dans un millilitre d'acétate de lithium 0,1 molaire et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Répartissez les cellules compétentes en aliquots de 100 microlitres dans des tubes stériles de 1,5 millilitre.Passez immédiatement à la procédure de transformation en mélangeant doucement 10 microlitres d'ADN de sperme de saumon dénaturé et de un à cinq microgrammes de la cassette de disruption purifiée avec 100 microlitres de cellules compétentes. Incubez à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajoutez 700 microlitres de polyéthylène glycol à 40 % pour 1000.Mélanger soigneusement et incuber dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius à 225 tr/min pendant 60 minutes. Ensuite, chauffer brièvement le mélange de transformation en plaçant le tube dans un bain-marie à 39 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après 60 minutes, ajouter un millilitre de milieu YPD au tube et laisser les cellules se rétablir pendant deux heures à 30 degrés Celsius à 225 tr/min.Centrifuger à 9000 × g pendant une minute à température ambiante. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon TE. Centrifuger à nouveau les cellules et jeter le surnageant.Resuspendre le culot dans 100 microlitres de tampon TE et étaler sur une plaque déficiente en leucine. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Avant d'effectuer le sauvetage du marqueur médié par la recombinase CRE, le plasmide d'expression de CRE est construit comme décrit dans le protocole textuel.Les caractéristiques de ce plasmide à réplication épisomale comprennent un gène de recombinase CRE, un marqueur de résistance à l'hygromycine B et un gène de résistance à l'ampicilline. Pour commencer cette procédure, transformer le plasmide d'expression de CRE dans des cellules compétentes de la souche ayant une invalidation du gène KU70, en suivant le protocole de transformation démontré précédemment. Ensemencer les cellules transformées sur des plaques YPD contenant de l'hygromycine B et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.Après avoir effectué la PCR de colonies, comme décrit dans le protocole écrit pour identifier les colonies positives, sélectionnez une colonie positive pour ensemencer deux millilitres de milieu YPDH et incubez-les toute la nuit à 30 degrés Celsius dans un incubateur agité à 225 tr/min jusqu'à la saturation. Le jour suivant, mesurez l'OD 600 de la culture à l'aide d'un spectrophotomètre. Lorsque les cellules atteignent une OD 600 d'environ 15, récoltez-les par centrifugation à 5000 × g pendant cinq minutes à température ambiante.Éliminer le surnageant, ajouter deux millilitres d'eau stérile et centrifuger à nouveau. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans du milieu YPD. Réensemencer les cellules dans deux millilitres de milieu YPD avec une OD 600 initiale de 0,1. Incuber les cellules toute la nuit dans un incubateur à 30 degrés Celsius à 225 tr/min.Le jour suivant, étaler la culture cellulaire de nuit sur des boîtes de milieu YPD afin d'isoler des colonies individuelles. Incuber à 30 degrés Celsius jusqu'à apparition des colonies. Repiquer les colonies sur des boîtes de milieu YPD, YPDH et sur des boîtes dépourvues de leucine.Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours. Un schéma du plasmide d'invalidation de KU70 est présenté. La digestion du plasmide avec les enzymes SacII et NdeI produit la cassette de disruption.L'électrophorèse sur gel confirme la présence d'une bande de 4,3 kilobases, qui correspond à la taille attendue de la cassette de disruption. La délétion du gène KU70 chez Y.lipolytica PO1G est confirmée par PCR. Les pistes 1 à 10 contiennent des produits de PCR amplifiés à partir de l'ADN génomique de transformants, et la piste 11 contient des produits de PCR provenant de la souche sauvage.La voie sept illustre un crible positif tandis que la voie une montre un faux positif. Le gène marqueur de sélection dans la souche de crible de KU70 a été finalement éliminé par l'expression de la recombinase CRE. Les transformants positifs dépourvus de marqueur ont été vérifiés par leur croissance sur une seule plaque YPD.Pour vérifier l'augmentation du taux de délétion génique, après la délétion du gène KU70, 11 gènes cibles ont été supprimés individuellement selon la même procédure dans la souche délétée pour KU70. Chaque disruption génique a été confirmée par PCR, et un résultat représentatif est montré ici, les bandes une, deux et quatre étant identifiées comme des délétions positives. La souche « Yarrowia lipolytica » PO1G avec délétion KU70 Platinum constitue un système plus efficace et un meilleur choix pour les applications en ingénierie métabolique et en optimisation de souches lors de la construction d'autres mutants chromosomiques par délétion. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension complète de la stratégie de délétion ciblée d'un gène unique par recombinaison homologue dans les cellules yarrowia lipolytica PO1G.

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