Name: Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de lymphocytes tumoraux infiltrant le mélanome humain. Cette méthode avance l'immunothérapie contre le cancer.

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Nous remercions Mme Deborah Postiff et Mme Jackline Barikdar du Tissue Procurement Core et le Dr Cindy DeLong du Laboratoire de Pluripotent Stem Cell Core de l’Université du Michigan pour leur assistance technique. Cette étude a été financée par un financement de démarrage de l’Université du Michigan et des subventions de la Central Surgical Association, de l’American College of Surgeons, de la Melanoma Research Alliance et du NIH/NCI (1K08CA197966-01) à F. Ito.

NOTE: Les patients doivent donner un consentement éclairé à participer à la commission d&#39;examen institutionnel et souches pluripotentes humaines Comité cellulaire approuvé l&#39;étude. 1. Isolement et culture de TIL <ol><li> Obtenir matériel tumoral qui ne sont pas requis pour le diagnostic histopathologique du noyau d&#39;approvisionnement service de pathologie / tissu. Placer 20-100 g d&#39;échantillons de tumeur dans un tube de 50 ml avec 30 ml de milieu de tumeur collecte (tableau 1). </li><li> Disséquer solide, ferme, tissu normal de l&#39;échantillon de tumeur des zones nécrotiques fragiles et / ou sanglantes avec des ciseaux. Après avoir retiré le tissu nécrotique, utiliser les ciseaux pour hacher l&#39;échantillon aussi petit que possible. </li><li> Dissocier le spécimen émincés dans une suspension à cellule unique en utilisant un kit de dissociation dissociateur et de la tumeur (humaine) selon les instructions du fabricant. On filtre la suspension avec un tamis cellulaire de 70 pm qui est fixé sur un tube de 50 ml et on lave le filtre avec 2 fois2 ml de RPMI 1640. </li><li> Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de lymphocytes T (Tableau 1). </li><li> Préparer une solution à gradient en deux étapes tel que Ficoll (solution de gradient) dans un tube de 50 ml, avec une étape inférieure de 10 ml d&#39;une solution à gradient de 100% et une étape intermédiaire de 30 ml d&#39;une solution à gradient de 75% dilué avec un phosphate de Dulbecco une solution saline tamponnée, pas de calcium, pas de magnésium (D-PBS (-)). </li><li> La couche de la suspension cellulaire (étape 1.4) sur la solution à gradient (étape 1.5). Centrifuger à 400 g à 20 ° C pendant 45 min. </li><li> Recueillir la couche contenant les TIL enrichi à l&#39;interface entre la solution de gradient de 100% et la solution de gradient de 75% dans un tube de 50 ml. Diluer la couche de la solution avec les TIL enrichie par l&#39;addition de 20 à 30 ml de D-PBS (-). </li><li> Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la fraction TIL enrichi dans 10 mldes médias de cellules T. </li><li> La culture de la fraction (étape 1.8) avec 2 ml de milieu de lymphocytes T et 6000 UI / ml humaine recombinante (rh) de l&#39; IL-2 dans une plaque à 6 puits à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Changer la moitié des médias le jour 5 après initiation de la culture et tous les 2-3 jours par la suite. </li><li> Fractionner les cellules à un rapport de 1: 2 sans trypsination après avoir suspendu doucement, en doublant le nombre de puits en atteignant 80-90% de confluence. Ajouter un demi-volume (1 ml) de milieu de lymphocytes T frais et de rhIL-2 à 6000 UI / ml. </li></ol> 2. Préparation de la mitomycine-C-traitée SNL Feeder cellulaire Plate <ol><li> La culture des cellules nourricières SNL dans 10 ml de SNL support de cellules nourricières (tableau 1) avec une gélatine revêtues de 10 cm à 0,1% jusqu&#39;à ce que 80-90% de la confluence (3-4 x 10 6 cellules) est atteinte. </li><li> Ajouter 310 pi de 0,4 mg ml de solution / mitomycine C directement dans la boîte de culture cellulaire SNL d&#39;alimentation et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 h et 15 min. Aspirer les médias unend laver les cellules deux fois avec 5 ml de D-PBS (-). </li><li> Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,25% / EDTA 1 mM et on incube à température ambiante pendant 1 min pour dissocier les cellules. Ajouter 4,5 ml de SNL médias de cellules nourricières pour neutraliser et remettre en suspension les cellules dans une seule suspension. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 200 g pendant 5 min. Aspirer les médias et compter les cellules avec un hémocytomètre après remise en suspension dans 10 ml de SNL médias de cellules nourricières. </li><li> Plaque de 1,5 x 10 6 cellules par puits des cellules nourricières SNL sur un plat de 10 cm et on incube à 37 ° C, 5% de CO 2. Utiliser les cellules nourricières SNL dans les 3 jours. </li></ol> 3. Génération de CSPi utilisant le virus Sendai (SeV) Vecteur <ol><li> Récolter les TIL (étape 1.11) et activer 5 x 10 5 cellules de TIL avec des souris de type plaque liée CD3 anti-humain (1 ug / ml) et de la souris soluble CD28 anti-humain (5 pg / ml), avec de la rhIL-2 (6000 IU / ml) dans 2 ml de milieu de lymphocytes T dans une plaque à 6 puits à raison de 37 ° C, 5% CO 2 pendant 5 jours. </li><li> Récolter les TIL (étape 3.1) dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Réactiver 1 x 10 5 cellules de TIL avec des souris de type plaque liée CD3 anti-humain (1 ug / ml) et soluble de souris CD28 anti-humain (5 pg / ml), avec de la rhIL-2 (60 UI / ml) dans 500 ul des supports de reprogrammation (tableau 1) par puits dans une plaque à 24 puits à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 24 heures. Préparer 3 puits pour l&#39;infection SeV: OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC (1 puits); infection SeV (GFP: protéine fluorescente verte) (1 puits); et le nombre de cellules (1 puits). </li><li> Après 24 heures (de l&#39;étape 3.3), compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre et déterminer le volume de chaque virus pour diverses (3-20) multiplicités d&#39;infection (MOI). Retirer un ensemble de tubes de vecteur de virus Sendai de -80 ° C stockage. Décongeler les vecteurs SeV rapidement dans un bain d&#39;eau (37 ° C) et placez-les sur la glace. Volume de virus (ul)= MOI (CIU / cellule) x nombre de cellules / titre du virus (CIU / ml) x 10-3 (pl / ml) </li><li> Ajouter les volumes calculés de chacun des quatre tubes de Sendai vecteur viral qui a effectué individuellement OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-myc en ajoutant un mélange de vecteurs de SeV à 10-20 MOI dans les milieux, y compris TIL activés. </li><li> Pour déterminer l&#39;efficacité de transduction, ajouter les volumes calculés de SeV-GFP dans un puits de TIL activés. </li><li> Placer le plat (de l&#39; étape 3.5 et l&#39; étape 3.6) dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 24 heures. Au bout de 24 h, estimer l&#39;efficacité de l&#39;infection en utilisant des TIL infectées par le SeV-GFP au microscope à fluorescence. </li><li> Recueillir les cellules (de l&#39;étape 3.5) dans un tube de 15 ml. Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de milieu CSEh avec Primate ES cellulaire moyen et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Transférer la suspension dans un plat de 10 cm que Contains mitomycine-C-traité des cellules nourricières SNL dans 10 ml de CSEh médias. Changer les médias CSEh tous les jours jusqu&#39;à ce que les colonies sont cultivées. </li><li> Autour de jour 18 à 21, enlever les cellules nourricières SNL autour des colonies au microscope en utilisant une pointe de 10 pi dans le banc propre. </li><li> Grattez les colonies en utilisant une pointe de 10 pi et de les transférer à l&#39;aide d&#39;une pointe de 200 pi dans 100 pi de CSPi médias par puits d&#39;une plaque de culture tissulaire de 96 puits. La pipette vers le haut et vers le bas à 2-3 fois pour briser les colonies en petits amas ayant une taille moyenne de 50 à 100 um. </li><li> Transférer les petites touffes dans 6 puits des plaques de culture tissulaire avec des cellules nourricières SNL mitomycine-C-traités (de l&#39;étape 2) dans 2 ml par puits de iPSCs support avec le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, 4 ng / ml). Changer les médias CISP chaque jour. </li><li> Transférer les iPSCs à 6 puits des plaques de culture tissulaire avec des cellules nourricières SNL mitomycine-C frais traités avec 1 mg / ml de collagénase IV, tous les 5-6 jours. Préparer 2 puits par plaques de chaque clone pour immunostaining. </li><li> Déterminer la pleine reprogrammation de chaque clone par coloration immunohistochimique de marqueurs de pluripotence (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 et OCT3 / 4) 1. NOTE: Pour plus d&#39; évaluation du potentiel de pluripotence, confirment que les lignes iPSC entièrement reprogrammées peuvent se différencier en trois couches germinales par une formation de corps embryoïdes et le dosage de différenciation ou d&#39; un essai de formation de tératome 16. </li><li> Vérifiez que les lignes iPSC entièrement reprogrammées démontrent un caryotype normal par analyse cytogénétique. </li><li> Pour la formation de tératome, injecter un indifférenciée COPSi TIL dérivé (1 x 10 6) en suspension dans 100 pi de DMEM contenant 10% de FCS dans le tissu sous - cutané des souris âgées de souris NOD / SCID femelles de 6 à 8 semaines. sections de tératome Stain avec hématoxyline et éosine. </li></ol> 4. immunofluorescence des CSPi pour SSEA3, SSEA4, TRA1-60 et TRA1-81 <ol><li> Laver CSPi avec 1 ml de PBS et fixer les CSPi avec 1 ml de 4% par anraformaldehyde solution pendant 10 min. Retirer la solution de paraformaldéhyde 4% et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois. NOTE: Soyez prudent lorsque vous utilisez paraformaldehyde car il est toxique. </li><li> Prétraiter les CSPi avec un tampon de blocage (tableau 1) pendant 30 min. Pendant ce temps, diluer les anticorps primaires (rat anti-humain SSEA3, souris anti-humain SSEA4, souris anti-humaine TRA1-60, et la souris TRA1-81 anti-humain) solution de sérum de chèvre à 1:50 dans 1,5% dilué avec du PBS et TritonX -100 (volume total: 1 ml). </li><li> Éliminer le tampon de blocage (tableau 1). Ajouter la solution d&#39;anticorps primaire dilué et on incube pendant 1 heure à température ambiante. Pendant ce temps, diluer l&#39;anticorps secondaire (IgG anti-souris et IgM ou anti-rat IgM) à 1:50 dans 1,5% de solution de sérum de chèvre. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire dilué et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Ajouter la solution d&#39;anticorps secondaire dilué et on incube pendant 45 min à température ambiante dans une pièce sombre. </li&gt; <li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire dilué et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Observer les CSPi avec microscopie immunofluorescence. </li></ol> 5. immunofluorescence des CSPi pour Oct3 / 4 <ol><li> Laver CSPi avec 1 ml de PBS et fixer les CSPi avec 1 ml de solution de paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. Retirer la solution de paraformaldéhyde 4% et se laver les CSPi avec PBS 3 fois. </li><li> Ajouter un tampon de perméabilisation (tableau 1) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Retirer le tampon de perméabilisation et ajoute un tampon de blocage (tableau 1). </li><li> Incuber à température ambiante pendant 30 min. Pendant ce temps, diluer l&#39;anticorps primaire (souris Oct3 anti-humaine / 4) à 1:50 dans un tampon de blocage. </li><li> Ajouter la solution d&#39;anticorps primaire dilué et on incube à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire dilué et laver les CSPi avec 1ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Pendant ce temps, le diluth de l&#39;anticorps secondaire (chèvre anti-souris IgG / IgM) 1: 100 dans un tampon de blocage. </li><li> Ajouter la solution d&#39;anticorps secondaire dilué et on incube à la température ambiante dans une chambre noire pendant 45 min. </li><li> Retirer la solution secondaire diluée et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Observer les CSPi sous microscopie immunofluorescence. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
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<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous avons démontré un protocole pour la reprogrammation TIL de mélanome à CSPi par transduction SeV-médiation des quatre facteurs de transcription OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Cette approche, en utilisant un système de SeV pour reprogrammer les cellules T, offre l&#39;avantage d&#39;une méthode non intégrant 7. Une étude antérieure a montré qu&#39;un système de reprogrammation du SeV a été très efficace et fiable pour reprogrammer non seulement les fibroblastes , mais auss...

La technologie de reprogrammation cellulaire qui permet la génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) via la surexpression d&#39;un ensemble défini de facteurs de transcription est très prometteuse dans le domaine des thérapies cellulaires 1,2. Ces CSPi présentent des caractéristiques de transcription et épigénétiques et ont la capacité d&#39;auto-renouvellement et la pluripotence, de manière similaire à des cellules souches embryonnaires (CSE) 3-5. Des progrès remarquables réalisés dans la technologie de reprogrammation au cours de la dernière décennie nous a permis de générer des CSPi humaines , même à partir de cellules différenciées, telles que les cellules T 6-8. T iPSCs dérivées de cellules (TiPSCs) conservent la même configuration réarrangé de récepteur des cellules T (TCR) des gènes de chaîne comme les cellules T d&#39; origine, ce qui permet la régénération des cellules T spécifiques d&#39;antigène à partir TiPSCs 11/09. Près de 80% des lymphocytes infiltrant de mélanome (TILs) obtenu à partir de la tumeur d&#39;un patient à reconnaître spécifiquement des antigènes associés à une tumeur d&#39;unnd maintenir cytotoxicité contre les cellules cancéreuses d&#39; origine 12. En particulier, l&#39;expression de la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) sur des TIL a été trouvée pour identifier le répertoire de tumeur autologue réactif, notamment muté lymphocytes CD8 + 13 spécifiques à néoantigène. Le transfert adoptif de l&#39; ex-vivo de TIL autologues expansées en combinaison avec les schémas de préparation et lymphodepleting administration systémique de l&#39; Interleukine-2 (IL-2) peut provoquer une régression substantielle du mélanome métastatique dans les sous - ensembles de patients 14. Malgré des résultats encourageants dans des modèles précliniques et chez les patients, une mauvaise survie des cellules T infusées et l&#39;existence de voies immunosuppresseurs semblent compromettre le plein potentiel de la thérapie adoptive de cellules T. Les protocoles cliniques actuels exigent beaucoup de manipulation ex vivo de cellules T autologues afin d&#39;obtenir un grand nombre. Cela se traduit par la génération de cellules différenciées T qui ont une faible survie, prol réduitela capacité iferative et des niveaux élevés de PD-1 15. Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant CSPi qui peuvent fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l&#39;immunothérapie. Nous avons récemment rapporté la reprogrammation du mélanome TIL exprimant des taux élevés de PD-1 par le virus Sendai (SeV) de transduction médiée des quatre facteurs de transcription, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-myc 16. Bien que des vecteurs rétroviraux nécessitent l&#39;intégration dans les chromosomes de l&#39;hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation, vecteurs SeV sont non-intégration et sont finalement éliminés du cytoplasme. Reprogrammant l&#39; efficacité est beaucoup plus élevé avec un système de SeV par rapport aux vecteurs de lentivirus ou retrovirus 6-8. En outre, en particulier SeV peut reprogrammer les cellules T dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP), tandis que certains clones générés par iPSC lentivirus ou des vecteurs rétroviraux peuvent provenir de lignées non lymphoïdes 6-8. Ici, nous détaillonsles procédures mises en œuvre pour l&#39;isolement et l&#39;activation du mélanome humain TIL et pour la génération de CSPi TIL dérivées en utilisant un système de reprogrammation SeV.

<table><tbody><tr><td>Tubes doux MACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Dissociateur doux MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation tumorale, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Technologies de la vie</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Tubes coniques Cntrifuge</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>l’homme AB sérum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant humain (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris NA/LE purifiée anti-humaine CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Souris NA/LE purifiée anti-humaine CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Cumberland Produits pharmaceutiques inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Plaques de culture tissulaire (6 puits)</td><td>Plaques</td> de culture tissulaire Corning <td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (24 puits)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai vecteur viral</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL cellules nourricières</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycine C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble dans l’eau (0,5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gélatine</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain lymphocytes tumorales infiltrant

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Le transfert adoptif de lymphocytes ex vivo élargi infiltrant les tumeurs autologues (TIL) peut servir de médiateur des réponses durables et complets dans des sous - ensembles importants de patients atteints de mélanome métastatique. Les principaux obstacles de cette approche sont la viabilité réduite des cellules T transférées, causées par le raccourcissement des télomères, et le nombre limité de TIL obtenus à partir de patients. des cellules T différenciées avec moins longs télomères serait un sous-ensemble de cellules T idéal pour une thérapie adoptive des lymphocytes T, mais, en générant un grand nombre de ces cellules T différenciées moins est problématique. Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant des cellules souches pluripotentes induites (CISP) que l&#39;auto-renouvellement, maintenir télomères pluripotence, ont allongées, et de fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l&#39;immunothérapie. Ici, nous présentons un protocole pour générer CSPi en utilisant des vecteurs de virus Sendai pour la transduction des facteurs de reprogrammation en TIL. Ce protocole génèrents entièrement reprogrammées, clones sans vecteur. Ces CSPi TIL dérivés pourraient être en mesure de générer des cellules T patient et spécifiques de tumeurs moins différenciées pour la thérapie adoptive de cellules T.

La figure 1 représente la vue d&#39; ensemble de la procédure qui implique l&#39;expansion initiale du mélanome TIL avec rhIL-2, qui est suivie par une activation avec un anti-CD3 / CD28 et le transfert de gène de OCT3 / 4, KLF4, SOX2, et c-Myc pour TIL pour la production d&#39;iPSCs. Habituellement, TIL sur la culture avec rhIL-2 commencent à se former des sphères 21-28 jours après le début de la culture. À ce stade, TIL sont prêts à être activés avec anti-CD3 / CD28. L...

L’objectif de ce protocole est de montrer le protocole de reprogrammation des lymphocytes infiltrant le mélanome en cellules souches pluripotentes induites.

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

L'objectif général de cette expérience est de générer des cellules souches pluripotentes induites, ou iPSCs, à partir de lymphocytes infiltrant le mélanome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie tumorale, notamment en ce qui concerne l'immunothérapie anticancéreuse. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes humaines à partir de lymphocytes infiltrant la tumeur, offrant ainsi un nombre illimité de lymphocytes T spécifiques de la tumeur, peu différenciés, pour l'immunothérapie.Cette technique pourrait avoir des applications pour le traitement du mélanome métastatique, car actuellement, la faible survie des lymphocytes T en milieu clinique constitue la principale limitation de la thérapie par lymphocytes T adaptatifs. Cette méthode pourrait également être utile pour l'étude du répertoire de récepteurs des lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Kumiko Iwabuchi, chercheuse postdoctorale de mon laboratoire.Après avoir obtenu le matériel tumoral, sélectionnez cinq à vingt grammes d'échantillons tumoraux et utilisez des ciseaux pour disséquer les tissus normaux, solides et fermes en les séparant des zones nécrosées fragiles ou hémorragiques des échantillons tumoraux. Hachez les échantillons disséqués aussi finement que possible, puis utilisez un dissociateur et un kit de dissociation de tumeurs humaines pour disperser les fragments tumoraux en une suspension monocellulaire, conformément aux instructions du fabricant. À la fin de la dissociation, filtrez les cellules à travers un tamis de 70 microns dans un tube de 50 millilitres et rincez le tamis deux fois avec deux millilitres de RPMI 1640.Ensuite, faire un culot des cellules par centrifugation et resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu frais pour lymphocytes T. Pour séparer les cellules par gradient de densité, déposer d'abord une couche de 30 millilitres de solution de gradient à 75 %, suivie de 10 millilitres de solution de gradient à 100 % dans du DPBS sans calcium ni magnésium, dans un nouveau tube de 50 millilitres. Puis, déposer délicatement les cellules sur le dessus de la solution de gradient en prenant soin de ne pas perturber les couches, et centrifuger l'échantillon.À la fin de la séparation, transférer les lymphocytes infiltrant les tumeurs, ou TILs, enrichis situés à l'interface entre les solutions de gradient dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et laver les cellules avec 20 à 30 millilitres de DPBS frais. Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu frais pour lymphocytes T, puis ajouter deux millilitres de TILs par puits à cinq puits d'une plaque à six puits et compléter les cultures de TILs avec de l'IL-2 humaine recombinante pendant cinq jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au cinquième jour, renouveler la moitié du milieu dans chaque puits, puis tous les deux à trois jours par la suite.Lorsque les cultures atteignent une confluence de 80 à 90 %, utiliser une pipette pour resuspendre doucement les cellules dans chaque puits et diviser les cultures dans un rapport de un à deux, dans un millilitre de milieu frais pour lymphocytes T enrichi en IL-2 humaine recombinante. Pour préparer les plaques d'alimenteurs SNL traitées à la mitomycine C, cultiver d'abord les cellules alimentaires SNL dans 10 millilitres de milieu pour cellules alimentaires SNL sur une plaque de 10 centimètres recouverte de gélatine à 0,1 %. Lorsque les cellules sont confluentes à 80 à 90 %, traiter les alimenteurs avec de la mitomycine C pendant deux heures et 15 minutes à 37 degrés Celsius, sous atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone.À la fin de l'incubation, laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de DPBS. Ensuite, détacher les cellules nourricières à l'aide de trypsine-EDTA à température ambiante. Après une minute, neutraliser la réaction de dissociation avec 4,5 millilitres de milieu frais pour cellules nourricières SNL et transférer la suspension de cellules uniques dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation.Résuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu frais pour cellules nourricières SNL pour le dénombrement. Ensuite, ensemencer 1,5 × 10⁶ cellules nourricières SNL par puits dans des boîtes de 10 centimètres et incuber les cultures à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant jusqu'à trois jours. Pour générer les iPSC à l’aide du virus de Sendai, transférer 5 × 10⁵ LIT par puits dans une nouvelle plaque de six puits revêtue d’anticorps anti-CD3 humain de souris, dans 2 millilitres de milieu frais pour lymphocytes T enrichi en IL-2 humaine recombinante et en anticorps soluble anti-CD28 humain de souris.Activer les LIT dans l'incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours. Ensuite, utiliser une pipette pour regrouper les cultures dans un tube conique de 15 millilitres afin de les compter. Puis transférer un fois dix puissance cinq LIT par puits dans une plaque de 24 puits revêtue d'anticorps anti-humain CD3, dans 500 microlitres de milieu de reprogrammation supplémenté en anticorps anti-humain CD28 de souris soluble et en interleukine-2 humaine recombinante.Après 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, dénombrer les cellules dans chaque puits et préparer plusieurs volumes de virus aux multiplicités d'infection appropriées. Ensuite, ajouter un mélange de vecteurs viraux de Sendai à une MOI de 10 à 20 dans un volume approprié de milieu, puis ajouter le milieu contenant le virus dans chaque puits de lymphocytes intra-tumoraux (TIL). Pour déterminer l'efficacité de transduction, ajouter le volume calculé de virus de Sendai exprimant la GFP dans un puits de TIL activés et replacer les cultures dans l’incubateur pendant 24 heures.Le lendemain, observer les cellules infectées par le virus Sendai exprimant la GFP en microscopie à fluorescence afin d'estimer l'efficacité d'infection de la transduction. Rassembler les cellules infectées viralement provenant de chaque puits dans un tube de 15 millilitres pour une centrifugation, puis re-suspendre le culot dans 0,5 millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines enrichi en milieu pour cellules souches embryonnaires de primate et en facteur de croissance fibroblastique basique. Ajouter ensuite 9,5 millilitres de milieu frais pour cellules souches embryonnaires humaines aux cellules, puis transférer la suspension sur une plaque de cellules nourricières SNL traitées à la mitomycine C.Dans cette image, des LIT au jour 21 de culture avec de l'IL-2 humaine recombinante, prêts à être activés avec des anticorps anti-CD3 et CD28, sont présentés. Les LIT peuvent être transfectés avec un virus Sendai à une multiplicité d'infection de 20. Ici, un clone pluripotent typique sur des cellules nourricières SNL, 18 à 21 jours après l'infection par le virus Sendai, est montré.Comme on peut l'observer sur ce caryogramme représentatif, les CIP dérivées des LIT présentent un caryotype normal. La coloration par immunofluorescence destinée à confirmer l'expression des marqueurs de pluripotence sur les CIP dérivées des LIT montre que ces cellules expriment les niveaux attendus de marqueurs typiques de la pluripotence. De plus, les CIP dérivées des LIT de mélanome sont capables de former des tératomes contenant une variété de cellules issues des trois feuillets embryonnaires.De plus, les iPSC dérivées de LIT ont conservé leurs réarrangements du récepteur des cellules T, comme évalué par électrophorèse capillaire. Cette première avancée ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'oncologie pour explorer des immunothérapies anticancéreuses plus efficaces chez les patients atteints de mélanome métastatique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier la prolifération et la viabilité des cellules T avant l'infection par le virus Sendai et d'évaluer l'efficacité de l'infection par l'expression du GFP en contour.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des cellules TIL humaines à partir de TIL de mélanome.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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