Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

L'objectif général de cette procédure est de créer de manière reproductible des disques d'hydrogel d'alginate en bi-couche afin d'étudier les relations entre différentes populations cellulaires lors de co-cultures en 3D. Cette méthode facilite l'analyse des interactions entre plusieurs populations cellulaires dans des cultures hétérogènes spatialement en 3D, ce qui peut aider à répondre à des questions clés en ingénierie tissulaire et en physiologie des tissus soumis à des charges mécaniques. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à offrir un moyen simple, économique et reproductible de construire des hydrogels d'alginate multicouches ensemencés avec des cellules, dont la structure favorise la stimulation mécanique.

La démonstration de cette procédure sera effectuée par Poonam Sharma, étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour former les disques d'alginate, empilez d'abord un morceau de papier filtre épais sur une plaque terminale de trois pouces sur trois, suivie d'une membrane de microtamis à cellules. Utilisez une spatule stérile pour aplatir la membrane et le papier filtre.

Ensuite, retournez l'empilement sur un tas de serviettes en papier et comprimez les matériaux pour éliminer l'excès de solution de chlorure de calcium. Puis, placez un moule de formation de gel comportant des puits cylindriques sur la membrane à microtamis, et utilisez des pinces à rabats pour fixer délicatement le moule à la plaque d'extrémité sur les côtés gauche et droit. Maintenant, empilez un morceau de papier filtre épais sur une petite plaque d'extrémité, suivi d'un morceau de membrane à microtamis, puis retournez l'ensemble afin d'éliminer tout excès de chlorure de calcium, comme vient de l'être démontré.

Lorsque les deux moitiés du moule sont prêtes, resuspendez un fois dix puissance six cellules d'intérêt par millilitre de milieu d'alginate stérile. Le mélange apparaîtra uniformément trouble lorsque les cellules seront correctement dispersées. Ensuite, transférez 130 microlitres de cellules goutte à goutte dans des puits individuels de six millimètres de diamètre sur trois millimètres de hauteur situés dans la moitié inférieure du dispositif de moulage.

Un ménisque légèrement convexe doit être visible au-dessus du bord de chaque puits. Une fois que toutes les cellules ont été ensemencées, utilisez une spatule stérile pour aplanir soigneusement la moitié supérieure du dispositif de moulage. Ensuite, retournez le moule de manière à ce que la membrane de microtamis se retrouve au-dessus des puits, puis placez le moule sur les puits en veillant à recouvrir complètement les puits contenant les mélanges de cellules et d'alginate.

Lorsque le moule est en place, soulevez l'ensemble du moule chargé et, en appuyant fermement au centre, fixez des pinces à linge sur les deux côtés restants de l'ensemble pour maintenir ensemble les moitiés supérieure et inférieure du moule. Les solutions d'alginate contenant les cellules doivent être solidement logées dans les puits. Ensuite, immergez l'ensemble du moule dans un bain de chlorure de calcium à 102 millimolaire dans une hotte de culture cellulaire à température ambiante pendant 90 minutes.

À la fin de l'incubation, transférez l'assemblage sur une pile de serviettes en papier et retirez les deux pinces en métal fixant la plaque supérieure au moule. Séparez les deux moitiés de l'assemblage. Les hydrogels formés dans les puits ne doivent pas présenter de bulles et doivent remplir complètement les puits.

Retirer les deux pinces à linge restantes et séparer le moule contenant l'hydrogel de la plaque terminale restante. À l'aide d'une spatule, suivre soigneusement le contour des puits contenant les hydrogels afin de desserrer délicatement les gels. Ensuite, transférer directement les hydrogels dans un bain de DPBS contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.

Après une à cinq minutes, transférez les hydrogels dans des puits individuels d'une plaque à six puits contenant une solution de milieu de croissance pour basilic suffisante pour immerger complètement les gels pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de CO2. Pendant les 30 dernières minutes de l'incubation, utilisez des pinces à dessin pour fixer le moule doté de puits ayant une hauteur égale à la moitié de celle du moule de formation des gels, sur les plaques d'extrémité en aluminium de trois par trois pouces ou trois par 1,5 pouce, situées sur les côtés gauche et droit, afin de créer un moule de découpe. Ensuite, créez le mode de recuit en fixant avec des pinces un moule dont les puits ont un diamètre supérieur de trois millimètres à ceux du moule de formation des gels, sur des plaques d'extrémité en aluminium de trois par trois pouces, placées sur les côtés gauche et droit.

Transférez maintenant les hydrogels dans les puits du moule de découpe. Chaque gel doit s'insérer fermement dans le puits, avec la moitié du gel qui dépasse au-dessus du moule. Utilisez ensuite un scalpel pour découper le long de la surface du moule afin de diviser l'hydrogel en deux.

Retournez la moitié supérieure du gel et placez-la dans une cavité ouverte du moule. Le morceau de gel doit s'ajuster fermement dans la cavité, mais désormais les deux moitiés doivent atteindre la hauteur du moule, la surface interne coupée étant visible. Ensuite, placez un morceau de membrane sèche de microtamis pour cellules au-dessus des cavités, en veillant à ce que la membrane soit en contact avec toutes les moitiés de gel à souder, puis recouvrez la membrane avec un morceau de papier filtre épais.

Lorsque les gels sont entièrement recouverts, imbiber le papier filtre avec du citrate de sodium supplémenté en EDTA, puis incuber les gels à température ambiante. Après une minute, éliminer la membrane microtamis pour cellules et le papier filtre épais, puis retirer les pinces agrafes. Ensuite, ouvrir le moule et transférer une moitié de gel dans un moule d'hybridation préparé, la surface coupée étant orientée vers le haut.

À l’aide d’une spatule, transférer une deuxième demi-gelée traitée sur la première gelée, de sorte que la surface coupée soit en contact avec la surface coupée de la première gelée. Une fois toutes les gelées placées, utiliser une spatule pour appuyer doucement sur les gelées afin d’éliminer les bulles d’air, puis plonger soigneusement le moule d’hybridation dans le bain de chlorure de calcium. Après 30 minutes, transférer le moule d’hybridation sur une pile de serviettes en papier et retirer les pinces de fixation.

Ensuite, séparer le moule de la plaque terminale et transférer brièvement les gels dans un bain de DPBS, puis les immerger dans le milieu de culture cellulaire approprié. Les gels bicouches terminés présentent une séparation initiale totale des populations cellulaires, comme observé sur cette image de cellules 293 FT marquées avec des colorants traceurs cellulaires verts ou rouges. La viabilité des cellules souches mésenchymateuses humaines incluses après recuit est élevée au sein des hydrogels stratifiés, similaire à la viabilité cellulaire observée dans les hydrogels massifs.

Après avoir isolé la contrainte maximale de chaque cycle au cours d'une compression cyclique non confinée de quatre heures, les hydrogels stratifiés sans cellules présentent une réponse en contrainte au chargement cyclique significativement plus faible en amplitude par rapport aux hydrogels sans cellules massifs non stratifiés, bien que les deux types d'hydrogels restent intacts après sept jours de culture. Une fois maîtrisée, cette technique, y compris la préparation de tous les matériaux, peut être réalisée en moins de quatre heures et demie si elle est correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de travailler de manière réfléchie et lente afin d'éviter toute erreur et de suivre plus facilement les différents échantillons.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la stimulation mécanique et l'immunomarquage peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les interactions entre les différentes populations cellulaires pouvant former des matrices extracellulaires. Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine de la mécanobiologie et du génie tissulaire d'étudier plus facilement les relations entre différentes populations cellulaires, telles que les cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les cellules du noyau pulposus. N'oubliez pas que le travail avec des objets tranchants, des matériaux biologiques, et en particulier des cellules humaines, peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adéquats doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.