Name: Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Apprenez à créer des hydrogels d'alginate bicouches pour étudier les interactions entre populations cellulaires hétérogènes en co-culture 3D. Cette méthode économique et reproductible facilite la recherche en ingénierie tissulaire et la mécanobiologie.

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Ce travail a été financé par la National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Préparation pour la formation de disques alginate <ol><li> Préparer une 4% (p / v) de solution d&#39;alginate dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans chlorure 1x ajouté de calcium ou le chlorure de magnésium et le placer dans un bain-marie à 37 °. Les concentrations de la solution d&#39;alginate peuvent varier, mais de 1 à 4% (p / v) de solution d&#39;alginate sont recommandées. </li><li> Mélanger la solution d&#39;alginate dans un rapport de 1: 1 avec la base de milieux de culture cellulaire chaud (par exemple, milieu de Eagle modifié par Dulbecco.) Pour le type cellulaire souhaité. La concentration de l&#39; alginate est maintenant la moitié de la concentration initiale, à savoir., 2% (p / v). Stériliser alginate solution / des médias en utilisant des filtres de seringue en nylon 0,2 um stérile. </li><li> Préparer un bain d&#39;eau stérile 102 mM de chlorure de calcium dihydraté dans de l&#39;eau stérile avec suffisamment de solution pour immerger les moules (~ 200 - 300 ml). </li><li> Recueillir la &quot;formation de gel moule&quot; stérile (6 mm de diamètre x 3 mm puits cylindriques de hauteur dans un 3 en x 3 en tôle d&#39;aluminium, voir <strong&gt; Figure 1) et endplates (Bottom: un 3 x 3 en tôle d&#39;aluminium, Top: un 1,5 po x 3 po plaque d&#39;aluminium) et de préparer des moules comme suit: <ol><li> Couper le papier épais de filtre (papier filtre buvard) et la membrane microtamis cellulaire (10 taille um des pores) aux dimensions de la partie supérieure et de plateaux bas et placez-les dans le bain de chlorure de calcium jusqu&#39;à saturation, environ 1 min. Si vous le souhaitez, stériliser le papier filtre épais et la membrane microtamis par autoclave ou lumière ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation. </li><li> Mettre en place une moitié (la moitié inférieure) de la construction du moule. <ol><li> Placer les éléments suivants au sommet d&#39;une autre dans l&#39;ordre suivant et lisser à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile: un grand plateau vertébral (3 pouces x 3 pouces), le papier filtre épais, puis la membrane micro-tamis. </li><li> Inversez et appuyez sur le moule sur une pile de serviettes en papier pour assurer la perte de solution de chlorure de calcium en excès. </li><li> Placer le &quot;moule formation de gel» avec les puits cylindriques au-dessus du cmembrane microtamis ell et doucement fixer le moule ensemble sur deux côtés à l&#39;aide des clips de liant sur les côtés gauche et droit. Assurez-vous de laisser assez de place pour le plateau vertébral supérieur (1,5 po x 3 po) pour couvrir complètement les puits plus tard. </li></ol></li><li> Mise en place de la seconde moitié (la moitié supérieure) de la construction du moule. <ol><li> Placez les éléments suivants au sommet de l&#39;autre dans l&#39;ordre suivant et lisser: petit endplate, papier filtre épais, membrane microtamis. </li><li> Inversez et appuyez sur cette moitié du moule sur une pile de serviettes en papier pour assurer la perte de solution de chlorure de calcium en excès. Ne pas fixer cette moitié du moule en utilisant des clips liant à ce moment. </li></ol></li></ol></li><li> les cellules de culture comme recommandé par les instructions du fabricant. Récolter les cellules souhaitées pour incorporer dans les hydrogels d&#39;alginate en couches. La densité cellulaire recommandée est de 1 - 2 x 10 6 cellules / ml, mais cela peut varier en fonction des expériences souhaitées. Remarque: Lorsque vous utilisez cette méthodepour la fabrication de couches avec différents types de cellules, assurez-vous de la culture de deux types de cellules en parallèle pour la superposition. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ensemencées à une densité cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml , on utilisera , par exemple , pour le protocole suivant. Le nombre de cellules et le numéro de disque peuvent être mis à l&#39;échelle pour des expériences au besoin. <ol><li> Une à deux semaines avant l&#39;enrobage, les cellules souches mésenchymateuses d&#39;ensemencement à une densité cellulaire de 3.000 - 5.000 cellules / cm2 dans 10 ml de milieu de croissance de base (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, 10% de sérum bovin fœtal, 2% de L-Glutamine, 1 % non-acides aminés essentiels, 1% de pénicilline / streptomycine) dans T-75 flacons. </li><li> Retirez le support passé tous les 2 - 3 jours et le remplacer par 10 ml de milieu de croissance basale jusqu&#39;à ce que les cellules sont 80 - 90% de confluence. </li><li> Pour récolter les cellules, enlever les milieux épuisés, et la pipette 3 ml de solution saline tamponnée phosphate 1x Dulbecco sans chlorure de calcium ajouté ou de chlorure de magnésium pour rincer les cellules. Retirer cette solution, pipette 3 ml de 0,25% TryPSIN-EDTA sur des cellules en croissance en flacons T-75, et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Après que les cellules ont soulevé de la surface adhérente, ajouter 6 - 9 ml de milieu de croissance de base. </li><li> MSCs centrifuger à 600 xg pendant 5 min à température ambiante, Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1-5 ml de milieu de croissance basale. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre en utilisant des instructions de l&#39;appareil. </li><li> Enlever 1 x 10 6 cellules provenant de la remise en suspension des cellules totales, centrifuger en utilisant les mêmes conditions, et aspirer le surnageant. </li></ol></li></ol> 2. Formation de cellule ensemencée alginate Disques <ol><li> Remettre en suspension le culot de cellules avec 1 ml de la solution d&#39; alginate / support stérile pour obtenir une densité cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml. Le mélange de cellules alginate sera homogène aspect trouble lorsque les cellules sont mélangés dans de manière appropriée. </li><li> Introduire à la pipette 130 ul du mélange de cellules-alginate dans six 6 mm de diamètre x 3 mm de hauteur des puits dans la moitié inférieure du moule,construire goutte à goutte, afin de ne pas créer de bulles. Un léger ménisque convexe doit être visible au-dessus du bord de chaque puits. </li><li> lisser soigneusement la moitié supérieure de la construction de moule à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile et retournez-le, de sorte que la membrane microtamis cellulaire est au-dessus des puits. Placer le moule construire au-dessus des puits, en veillant à couvrir les puits contenant la cellule et le mélange alginate complètement. </li><li> Soulever la construction du moule chargé et, tout en appuyant fermement sur le centre, Pince les deux côtés restants (haut et bas) pour fixer les moitiés supérieure et inférieure de la construction du moule. Les solutions de cellules alginate doivent être solidement niché dans les puits à l&#39;heure actuelle. </li><li> Immerger le produit d&#39;assemblage de moule fixé dans le bain de chlorure de calcium 102 mM, en veillant à ce que l&#39;ensemble de la structure est submergée. Incuber dans la hotte de culture cellulaire à la température ambiante pendant 90 min. </li><li> A la fin des 90 minutes, enlever le produit d&#39;assemblage de moule à partir du chlorure de calcium 102 mMsalle de bain et le placer sur une pile de serviettes en papier dans la hotte de culture cellulaire. Retirez tous les quatre clips de liant et de séparer les deux moitiés de la construction du moule. Les hydrogels formés dans les puits ne doivent pas avoir de bulles et doivent remplir les puits complètement. </li><li> Avec une spatule, tracer soigneusement le bord des puits contenant les hydrogels pour desserrer soigneusement et caler les hydrogels. Après avoir enlevé les hydrogels de la construction du moule, laisser tomber les hydrogels directement dans un bain de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1x avec du chlorure de calcium et chlorure de magnésium. Couvrir les gels complètement pour laver la solution de chlorure de calcium en excès pendant 1 - 5 min. </li><li> Transférer les hydrogels dans la solution de base de milieu de croissance dans le plat désiré (par exemple., Des plaques de 6 puits) qui couvre complètement les hydrogels. Laisser incuber pendant au moins 1 h dans l&#39;incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 avant de procéder à l&#39;étape de stratification. Note: Les hydrogels contenant des cellules peuvent être conservées dansl&#39;incubateur de culture cellulaire indéfiniment à ce moment jusqu&#39;à ce que la superposition de gels avec une autre population cellulaire est souhaité, à condition que les changements de médias sont remplis tous les 2 - 3 jours. </li></ol> 3. Superposition des disques alginate <ol><li> Au cours de la dernière demi-heure de l&#39;incubation de 1 h, recueillir et préparer des moules stériles et solution pour le recuit des gels. <ol><li> Préparer le &quot;moule de coupe&quot; par la fixation d&#39;un moule qui comporte des puits de la moitié de la hauteur de la &quot;formation de gel moule&quot; (6 mm de diamètre x 1,5 mm de haut de puits dans un 3 x 3 en tôle d&#39;aluminium) à une plaque d&#39;extrémité (3 pouces x 3 dans la plaque d&#39;aluminium) en utilisant des clips liant sur les côtés gauche et droit. </li><li> Préparer le &quot;moule de recuisson&quot; par la fixation d&#39;un moule qui est à 3 mm de diamètre plus grand que la «formation moule de gel&quot; (diamètre 9 mm x 3 mm de haut de puits dans un 3 in x 3 in plaque d&#39;aluminium) à une plaque d&#39;extrémité (3 pouces x 3 dans la plaque d&#39;aluminium) en utilisant des clips liant sur les côtés gauche et droit. </li><li> Préparer une solution decitrate de sodium mM 100/30 mM EDTA (citrate de sodium dihydraté, éthylènediaminetétraacétique tétrasodique d&#39;acide sel dihydrate) dans de l&#39;eau stérile. </li></ol></li><li> Retirer gels de populations cellulaires désirées (dans cet exemple, deux disques avec CSMh) des médias dans le plat, et la placer dans le &quot;moule de coupe&quot; puits. Chaque gel doit être bien ajusté dans les puits avec la moitié du gel en saillie au-dessus du moule. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un scalpel, découper le gel le long de la surface du moule (ce qui coupe l&#39;hydrogel dans la moitié). Retournez la moitié supérieure du gel et le placer dans un puits de moule ouvert. La moitié du gel devrait également être bien ajusté dans le moule bien, mais maintenant les deux gels demi devrait être la hauteur du moule avec la surface intérieure coupée visible. Répétez avec le deuxième gel. Note: Attention: Seules les surfaces intérieures coupées formeront des disques en couches. En utilisant les surfaces extérieures entraînera la séparation des moitiés. On soupçonne que la texture de la membrane micro-tamis transférée sur la surface du gel empêchents succès du processus de recuit. </li><li> Placer un morceau de membrane de micro-tamis de la pile sèche au-dessus des puits, en veillant à ce que la membrane micro-tamis est en contact avec toutes les demi-gel à recuire et en les recouvrant complètement. Placez du papier filtre épais sur le dessus de la membrane microtamis, en veillant à couvrir les gels complètement. </li><li> Pipeter une solution de citrate de sodium 100 mM / EDTA 30 mM (citrate de sodium dihydraté, l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique tétrasodique dihydraté du sel) sur le papier filtre épais jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit saturé. Environ 750 ul est suffisant pour quatre puits. </li><li> Incuber les gels pendant 1 min à température ambiante. Ensuite, retirez la membrane cellulaire et microtamis papier filtre épais et jetez-les. Retirez les clips de liant et ouvrir le moule. </li><li> Pour chaque gel recuite, le transfert d&#39;un citrate de sodium / EDTA demi-traitée de l&#39;hydrogel préparé à l&#39; &quot;moule de recuit&quot; à la surface de coupe tournée vers le haut. Ce sera une moitié de la const recuiteruct. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une spatule, soulever et placer un citrate deuxième de sodium / demi-gel traité à l&#39;EDTA (peut contenir un type de cellule différent) sur le gel déjà dans le &quot;moule de recuit», le retournement de cette seconde moitié du gel de telle sorte que la surface de coupe est en contact avec la surface du gel de coupe déjà dans le &quot;moule de recuit». </li><li> Appuyez doucement sur les deux gels à l&#39;aide d&#39;une spatule pour éliminer les bulles entre les deux gels. En outre, repositionner les gels au besoin pour faire en sorte qu&#39;ils sont directement sur le dessus les uns des autres. </li><li> Soulevez doucement le «moule de recuit&quot; et le plonger dans le bain de chlorure de calcium 102 mM pendant 30 min. Ne pas couvrir les puits avec une plaque d&#39;extrémité. </li><li> Après l&#39;incubation de 30min, retirez le «moule de recuit&quot; et placez-le sur du papier absorbant. Retirez les clips de liant et de séparer le moule du plateau vertébral. </li><li> Avec une spatule, recueillir les gels recuites et les placer dans un 1x Dulbecco saline tamponnée au phosphate avec du chlorure de calcium et mbain de chlorure agnesium pour laver les gels. Par la suite, le transfert hydrogels recuits à des milieux de culture cellulaire dans un plat désiré (par exemple., Plaque de 6 puits) pour la culture. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation de disques d&#39;hydrogel d&#39; alginate pour l&#39; étude des couches co-cultures de populations cellulaires multiples, tels que ceux dans les tissus physiologiquement stratifiés, par exemple, le cartilage. des structures en couches, telles que la plate-forme de culture décrit, peuvent être utilisés pour examiner l&#39;interaction entre les deux populations cellulaires distinctes soumises au même milieu de culture ou sous charge. ...

tissus porteurs de charge de compression tels que le cartilage articulaire ou les disques intervertébraux sont constitués de régions de tissus hétérogènes qui sont essentiels à la fois pour fonction biomécanique et mécano-transduction appropriée dans le tissu. Non seulement est l&#39;organisation cellulaire et la fonction distincte dans différentes régions, mais les matrices extracellulaires (ECM) sont également variés dans la composition et de l&#39;organisation. Par exemple, le cartilage articulaire est constituée de trois zones principales variant avec la morphologie cellulaire, la fonction mécanique, et l&#39;ECM. Les différences dans leur ECM conduisent à une différence de charge portant des responsabilités; la couche superficielle est principalement impliquée dans la réponse à la traction à charger, tandis que les zones intermédiaires et profondes sont principalement responsables de la réponse à la compression 1. De même, dans le disque intervertébral, un noyau pulpeux de type gel est entourée par une fibrose lamellaire annulaire et les cellules dans ces deux domaines distincts ont présenté différents types de stimuli biophysiques2. Dans ces types de tissus, des cellules et des matrices extracellulaires au sein des couches de tissu interagissent les unes avec les autres que le tissu est soumis et réagit à des forces mécaniques. Récapitulation de telles structures de tissus hétérogènes reste un défi dans l&#39;ingénierie tissulaire et la médecine régénérative, et notre compréhension de leur signification biologique est limitée. Il existe un besoin pour cultiver des plates-formes d&#39;analyse des tissus stratifiés, ainsi que des co-cultures de différentes populations de cellules au sein d&#39;une construction. Dans le cartilage articulaire génie tissulaire, les constructions d&#39;échafaudage moins couches ont été construits en exploitant la capacité des chondrocytes zonales pour déposer ECM varié pour imiter les différentes couches de ce tissu 3,4. Cependant, les constructions d&#39;hydrogel en couches offrent une occasion pour étudier l&#39;interaction de divers types de populations de cellules qui manquent de la capacité à former un tissu robuste indépendamment. Par exemple, pop différentepopu- des cellules souches mésenchymateuses peuvent être co-cultivés à l&#39;intérieur des constructions en couches. Ces échafaudages stratifiés ont été utilisés avec les chondrocytes et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses pour améliorer 5 l&#39; ingénierie tissulaire. Non seulement les populations de cellules différentes peuvent être co-cultivées dans des couches d&#39;hydrogel similaires, mais un seul type de cellule peuvent également être mises en culture dans des couches qui ont été manipulées pour faire varier la raideur ou le contenu biochimique pour obtenir des réponses différentes à partir de cellules 6,7. De nombreux hydrogels différents biomatériaux ont été utilisés pour superposer des populations cellulaires pour l&#39; ingénierie tissulaire du cartilage tels que ceux utilisant du polyethylene glycol ou des bases d&#39;alcool vinylique poly 7-9. Toutefois, les hydrogels d&#39;alginate sont l&#39;une des plus simples biomatériaux à partir duquel créer des échafaudages en couches pour l&#39;étude de populations de cellules hétérogènes en co-culture. Alors que hydrogels agarose sont également facilement formés, les hydrogels d&#39;alginate ont l&#39;avantage supplémentaire de permettre facile estolation de cellules provenant de la construction en 3-D pour l&#39; analyse des cellules individuelles comme cela a été 10 précédemment décrit. Dans des études précédentes, les hydrogels d&#39;alginate bi-couches ont été formées en feuilles minces et à partir de ces feuilles, les sections ont été tranchés (par exemple., En utilisant un poinçon de biopsie) pour des applications particulières telles que l&#39; analyse du contenu biochimique ou des propriétés de cisaillement interfaciale 11,12. Un autre procédé pour former des feuilles minces à base d&#39;alginate a été décrit en relation avec le potentiel de la stratification en plusieurs couches, mais nécessiterait la modification de l&#39;hydrogel pour utilisation dans les essais mécaniques 13. Ici, nous présentons une méthode pour créer des disques de manière reproductible d&#39;hydrogel d&#39;alginate bi-couches pour une utilisation dans des co-culture de différentes populations de cellules. Cette plate-forme de disque d&#39;alginate possède plusieurs avantages. Principalement, la forme reproductible et de petite taille est propice à la stimulation mécanique des cellules embarquées sans nécessiter une biopsie puNCH ​​ou toute autre altération physique de l&#39;hydrogel pour de nombreuses applications. En outre, la viabilité cellulaire reste élevée pendant le processus de stratification, et après la formation de gel une séparation claire des deux populations de cellules dans le gel est visible sans zone de chevauchement initial.

<table><tbody><tr><td>Sel de sodium d’acide alginique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution fabriquée en % en poids à l’aide de DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco’s Phosphate Tamponné Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>11965</td><td>Exemple. Utilisez les filtres à seringue de type moyen souhaité</td></tr><tr><td>(0,02 &#956 ; m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP510</td><td>Préparer la solution dans de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Critère Blotter Papier filtre</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Couper à la taille des plaques d’extrémité pour la formation de moisissures Membrane de</td></tr><tr><td>microtamis cellulaire (10 &#956 ; taille des pores)</td><td>Biodesign Inc de New York</td><td>N10R</td><td>Couper à la taille des plaques d’extrémité pour la formation de moisissures</td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel tétrasodique dihydraté (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>26140</td><td>Utilisé dans l’exemple : milieu de croissance basale de cellules souches mésenchymateuses</td></tr><tr><td>péniciline/streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>15140</td><td>Utilisé dans l’exemple : milieu de croissance basale des cellules souches mésenchymateuses</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>25030081</td><td>Utilisé par exemple : Cellules souches mésenchymateuses : milieux de croissance basale</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp ;</td><td>11140050</td><td>Utilisé par exemple : milieu de croissance basale de cellules souches mésenchymateuses</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

De nombreux tissus porteurs possèdent des régions structurellement et fonctionnellement distinctes, généralement accompagnées de différents phénotypes cellulaires avec des caractéristiques de mécanodétection différentielles. L’ingénierie et l’analyse de ces types de tissus restent un défi. Les constructions d’hydrogel en couches offrent la possibilité d’étudier les interactions entre plusieurs populations cellulaires au sein de constructions uniques. Les hydrogels d’alginate sont à la fois biocompatibles et permettent d’isoler facilement les cellules après l’expérimentation. Ici, nous décrivons une méthode pour le développement de disques d’hydrogel d’alginate à double couche de petite taille. Ce processus maintient une viabilité cellulaire élevée des cellules souches mésenchymateuses humaines pendant le processus de formation et ces disques stratifiés peuvent résister à la compression cyclique non confinée, couramment utilisée pour la stimulation des CSMh en cours de chondrogenèse. Ces constructions en couches peuvent potentiellement être mises à l’échelle pour inclure des niveaux supplémentaires, et également être utilisées pour séparer les populations cellulaires initialement après la superposition. Cette plate-forme de culture d’hydrogel d’alginate à double couche peut être utilisée pour de nombreuses applications différentes, notamment l’ingénierie et l’analyse de cellules de tissus porteurs et les co-cultures d’autres types de cellules.

La figure 1 représente la formation et la stratification des hydrogels d&#39;alginate. Complété gels bi-couches présentent une première séparation complète des populations de cellules comme le montre la figure 2. La viabilité cellulaire des cellules souches mésenchymateuses humaines) incorporés dans ces hydrogels et des couches reste élevée et comparable à celle des hydrogels en vrac comme le montre la figure 3. La viabilité a été évalué...

L’ingénierie et l’analyse des tissus porteurs avec des populations cellulaires hétérogènes restent un défi. Ici, nous décrivons une méthode pour créer des disques d’hydrogel d’alginate bicouches comme plate-forme pour la co-culture de diverses populations cellulaires au sein d’une seule construction.

Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

L'objectif général de cette procédure est de créer de manière reproductible des disques d'hydrogel d'alginate en bi-couche afin d'étudier les relations entre différentes populations cellulaires lors de co-cultures en 3D. Cette méthode facilite l'analyse des interactions entre plusieurs populations cellulaires dans des cultures hétérogènes spatialement en 3D, ce qui peut aider à répondre à des questions clés en ingénierie tissulaire et en physiologie des tissus soumis à des charges mécaniques. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à offrir un moyen simple, économique et reproductible de construire des hydrogels d'alginate multicouches ensemencés avec des cellules, dont la structure favorise la stimulation mécanique.La démonstration de cette procédure sera effectuée par Poonam Sharma, étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour former les disques d'alginate, empilez d'abord un morceau de papier filtre épais sur une plaque terminale de trois pouces sur trois, suivie d'une membrane de microtamis à cellules. Utilisez une spatule stérile pour aplatir la membrane et le papier filtre.Ensuite, retournez l'empilement sur un tas de serviettes en papier et comprimez

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Bioingénierie

Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans la culture à la fois à deux dimensions et en trois dimensions paradigmes.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

Culture de cellules normales dans leurs trois dimensions contexte représente une méthode alternative pour étudier les événements précoces nécessaires pour la transformation cellulaire et la tumorigenèse. Cette méthode est utilisée pour cultiver des cellules ovariennes normales et l'oviducte pour étudier les événements précoces de la formation de cancer de l'ovaire.

Les hydrogels d&#39;alginate de culture d&#39;organe en trois dimensions des ovaires et des trompes

Dans les sections suivantes, nous décrivons les procédures pour la préparation d'alginate de microsphères pour une utilisation dans des applications biomédicales. Nous spécifiquement illustrent une technique pour créer alginate multicouche microsphères dans le double but de la cellule et l'encapsulation de protéines en tant que traitement potentiel pour les diabétiques de type 1.

Génération d&#39;alginate de microsphères pour des applications biomédicales

Aqueuses systèmes biphasiques ont été utilisés pour les populations de motif simultanément de multiples cellules. Cette méthode est simple et rapide pour un patron de cellules tire parti de la séparation de phases de solutions aqueuses de glycol de polyéthylène et de dextrane et la tension interfaciale qui existe entre les deux solutions de polymères.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Nous avons mis au point une méthode d’encapsulation de cellules souches pluripotentes (cellules PS) dans des capsules d’hydrogel d’alginate à l’aide d’une buse coaxiale.  Cela empêche les cellules de s’agréger excessivement et limite le stress de cisaillement subi par les cellules en culture en suspension.  La technique est applicable à la production de masse de cellules PS ainsi qu’à la recherche sur la niche des cellules souches.

Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

Le protocole suivant décrit la procédure d’assemblage de cultures sandwich à utiliser comme étape intermédiaire entre les environnements cellulaires bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D). Les systèmes conçus peuvent avoir des applications en microscopie, en biomécanique, en biochimie et en biologie cellulaire.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Nous décrivons la fabrication de feuilles d’hydrogel à micromotifs à l’aide d’un processus simple, qui peut être assemblé et manipulé sous une forme autonome. À l’aide de ces feuilles d’hydrogel modulaires, un système de culture cellulaire 3D simple à l’échelle macroscopique peut être généré avec un microenvironnement cellulaire contrôlé.

Construction de feuilles d&#39;hydrogel modulaire pour micropatterned macro-échelle 3D Cellular architecture

La culture tridimensionnelle dans des billes d’alginate, en raison de sa simplicité et de sa reproductibilité, a été choisie pour maintenir les cellules de l’adénome hypophysaire. Les procédures comprenaient une digestion enzymatique initiale et une dissociation mécanique du tissu tumoral, et la suspension cellulaire ultérieure a été encapsulée dans des billes d’alginate.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

Les modèles actuels de culture bicouche ne permettent pas des études fonctionnelles in vitro qui imitent en vivo microenvironnements. À l’aide de polyéthylène glycol et une méthode de création de modèles d’oxyde de zinc, ce protocole décrit le développement d’une membrane de sous-sol biomimétique ultra-mince avec rigidité ajustable, la porosité et la composition biochimique qui imite étroitement en vivo matrices extracellulaires.

Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire

Ce travail décrit un protocole pour l’impression 3D intégrée de forme libre de cellules souches neurales à l’intérieur de composites de matrice particule-extracellulaire recuits auto-cicatrisants. Le protocole permet la structuration programmable de constructions de tissus neuraux humains interconnectés avec une haute fidélité.

Support composite à matrice microgel-extracellulaire pour l’impression 3D intégrée de constructions neuronales humaines

Le protocole présente un nouveau modèle expérimental in vitro capable de récapituler la biologie de deux types de lignées cellulaires adhérentes avec un échafaudage imprimé en trois dimensions (3D). La construction de ce modèle et les procédures opératoires, de la préparation et de la culture cellulaires à l’analyse et à l’évaluation, sont décrites.

Modèle de co-culture utilisant deux types de lignées cellulaires adhérentes

Apprenez à créer des hydrogels d'alginate bicouches pour étudier les interactions entre populations cellulaires hétérogènes en co-culture 3D. Cette méthode économique et reproductible facilite la recherche en ingénierie tissulaire et la mécanobiologie.

Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

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