Name: Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez une méthode microarray haut-débit pour identifier des polymères synthétiques répulsifs aux bactéries sur dispositifs médicaux. Cette technique accélère la découverte de biomatériaux efficaces.

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Les auteurs remercient EASTBIO (le partenariat de formation doctorale en biosciences de l’Est de l’Écosse financé par le BBSRC) (S. V.) et le Medical Research Council (P.J.G) pour le financement.

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à déclarer.

Fixation des bactéries à une surface est un processus complexe déterminé par un large éventail de facteurs dépendants de l&#39;espèce bactérienne, les propriétés de la surface, le milieu environnant et l&#39;environnement physique. Bien que certains groupes chimiques sont connus pour affecter la liaison des bactéries (polyglycols, par exemple, typiquement résister fixation 11), en corrélation l&#39;impact biologique des polymères avec leurs structures chimiques , il est difficile, ce qui rend la conception rationnelle de polymères pour des fonctions spécifiques complexes. En l&#39;absence de mécanismes de fixation détaillés, d&#39; autres études ont tenté d&#39;imiter naturels répulsifs surfaces, avec une longue et vaste optimisation traite 21. La méthode à haut débit miniaturisé présenté ici surmonte ces défis en facilitant le dépistage parallèle des centaines de polymères pour identifier des pistes pour une étude plus approfondie. Les résultats de la méthode des microréseaux servent principalement à identifier probables candidats de plomb. La figure 2 illustre 22 candidats ayant une faible liaison d&#39;au moins une espèce, tandis que la figure 3 montre la nette diminution de la capacité de liaison. Les 22 polymères de faible liaison représentés sur la figure 2 ont été prises avant dans des expériences de l&#39; échelle, au cours de laquelle le meilleur (en termes de répulsion et de revêtement des propriétés) ont été jugées PU83, PA13 et PA515 (figures 4 et 5). Polyacrylates offrent une plus grande flexibilité en termes de procédés de polymérisation et donc le polyacrylate le plus bas de liaison, PA13, a été choisi pour les études de revêtement de cathéter (figures 6 et 7). De plus amples travaux supplémentaires sur d&#39; autres candidats a été effectuée et a été rapporté ailleurs 6. Grâce à un certain nombre d&#39;itérations expérimentales nous avons trouvé un certain nombre d&#39;étapes mineures ont été la clé de la réussite et de la reproductibilité. En plus de faciliter l&#39;adhésion dudes polymères sur les lames de verre, en utilisant un agarose sous-revêtement présente un fond propre, que l&#39;agarose est très résistant à la colonisation bactérienne. De même la cohérence dans le polymère se voit, à la fois dans le même tableau et entre les tableaux, est vital et donc l&#39;impression des tableaux doit être soigneusement contrôlée. Le réglage précis des broches dans la tête d&#39;impression et le remplissage aussi uniforme de la plaque 384 puits sont nécessaires pour assurer spotting uniforme. Comme certains des polymères, nous avons utilisé présentait un degré de autofluorescence, en prenant les données de fond de fluorescence pour chaque diapositive avant incubation avec des bactéries était vitale. Pour tenir compte des variations et obtenir de solides répétitions de données de microarrays sont conseillés. La tache employée ici (DAPI) n&#39;a pas la sélectivité pour les espèces bactériennes, la liaison non spécifique à l&#39;ADN. Par conséquent, une bonne technique aseptique est essentiel une fois les cultures bactériennes sont introduites en tant que contaminants peuvent passer inaperçus, confondant l&#39;interprétatation des résultats. La même chose est vraie des expériences ultérieures en utilisant la microscopie électronique à balayage, où il est possible de distinguer les tiges et les cocci mais pas du genre ou espèce. Après le criblage de microréseau, polymères prometteurs devraient être choisis pour une validation supplémentaire. Dans l&#39;exemple présenté ici, sept polymères d&#39;intérêt ont été identifiés par leur nette diminution de la fluorescence sur la puce à ADN , et leur inhibition de la fixation a été confirmée par enrobage sur des surfaces plus grandes. Les figures 4 et 5 montrent la réduction de la liaison réalisée sur des lamelles de verre, d&#39; un des moyens pratiques pour tester le comportement des polymères en tant que revêtements en vrac plutôt que comme des taches de microréseaux. Par la suite, ces polymères ont été revêtus sur les dispositifs médicaux pour quantifier entièrement la réduction de la fixation des bactéries. Il est important que le solvant choisi (voir la section de protocole 8) pour ces études de revêtement est bénigne au substrat souhaité (ici, le cathéter) en conservement la capacité de dissoudre le polymère d&#39;intérêt, afin de permettre le revêtement. Ici, nous avons utilisé de l&#39;acétone qui, ainsi que les propriétés mentionnées ci, a un point d&#39;ébullition bas et évapore rapidement pour laisser un revêtement uniforme. Les moyens de validation choisie dépendra de l&#39;application spécifique en cours d&#39;étude. L&#39;observation des cellules par microscopie électronique et par fluorescence permet une quantification directe de l&#39;attachement des cellules individuelles, on a choisi ces techniques comme complément à l&#39;essai de coloration de puces à ADN en vrac. Les résultats sont présentés dans les figures 6 et 7, qui démontrent l&#39;importance des méthodes de validation gratuits. Les images confocales sur la figure 6 , d&#39; obtenir des images très nettes des cellules individuelles, tandis que le SEM a l&#39;avantage supplémentaire de permettre une évaluation de la surface du polymère, qui est ici lisse et uniforme. Ces méthodes sont limitées par le champ de vision des microscopes utilisés, et il est donc important de prendre une série de clichés d&#39;avoir confiance dans les résultats. Le procédé décrit ci-dessus ne peut quantifier l&#39;adhérence des bactéries sur toute la surface, seulement en déduire la couverture à partir d&#39;un certain nombre de petites régions. Nous pensons que cela est suffisant pour l&#39;application décrite. Réduction de la liaison bactérienne pouvait être évalué en dénombrant les bactéries adhérant à la surface sur l&#39;ensemble de morceaux de cathéters enduits et non enduits en utilisant des procédés tels que décrits ailleurs 22. Cependant, ces procédés exigent des surfaces biomatériau criblés pour avoir une surface uniforme, ce qui est difficile à maintenir lorsque les essais sont effectués avec des dispositifs médicaux, qui ont souvent une géométrie complexe. De toute évidence, tout dispositif destiné à un usage clinique doit passer par des tests supplémentaires importants pour assurer la sécurité et l&#39;efficacité chez les humains. La méthode présentée ici représente le début de ce processus et d&#39; autres travaux doivent inclure la confirmation de l&#39; activité in vivo. Dans ce cas, l&#39;étude c veineuseatheters, travail initial pourrait enquêter sur la liaison des composants sanguins et des cellules entières au polymère. L&#39;effet des composants sanguins sur la liaison bactérienne devrait également être envisagée, éventuellement en répétant les essais de liaison en présence de sérum inactivé ou de sang de-fibrinated 23. Le test définitif de la technologie sera dans un modèle in vivo, comme un modèle d&#39;infection de l&#39; implant sous - cutané 24. Nous démontrons le potentiel de la méthode des microréseaux de polymère pour le criblage de polymères surface altérant. De tels polymères (à la fois résistant et la promotion de la liaison bactérienne) ont un grand nombre d&#39;applications dans la médecine, l&#39;industrie alimentaire et de la biotechnologie, ce qui signifie que cette méthode peut être utile dans de nombreux domaines de recherche. Bien que le travail ici utilise des bactéries, la méthode pourrait être adaptée à d&#39;autres types de cellules et même d&#39;autres microarrays chimiques.

<html> Microarrays polymères sont miniaturisés plates - formes à haut débit dans lequel jusqu&#39;à 7.000 polymères 1 sont imprimés sur des lames de verre pour analyse parallèle avec des cellules procaryotes ou eucaryotes 2. La méthode présentée ici se fonde sur ce que nous avons décrit la première en 2010 3. Ce système de contrôle a été appliqué à de nombreux types de cellules , y compris les hépatocytes humains 4, des cellules souches 5, les cellules épithéliales des tubules rénaux 2, les bactéries 3,6 et protozoaires pathogènes 7. Dans chaque cas, les polymères qui favorisent ou résistent à la liaison des cellules à l&#39;étude ont été identifiés 8. Complexes d&#39;ADN avec des polymères polycationiques synthétiques ont également été utilisés sous la forme de puces à ADN pour le criblage à haut débit des candidats de transfection du gène 9. Ainsi que le dépistage des interactions cellule-substrat, des microréseaux de polymères ont également été utilisés pour l&#39; évaluation des propriétés des matériaux 10. &quot;&gt; La capacité des polymères synthétiques pour moduler la fixation des bactéries à une surface est bien nombreux facteurs , y compris la charge, le caractère hydrophobe et la rugosité de surface de la surface du polymère sont connus pour affecter. Les approches conventionnelles de liaison bactériennes de la découverte biomatériaux établie 3,6,11. qui résistent à la liaison de bactéries par séquentiellement ou empiriquement concevoir et tester un matériau à la fois sont de main-d&#39;œuvre, coûteux et processus de temps. microarrays polymères offrent une alternative intéressante pour contourner ces limitations. les bactéries de surface associée à grandir comme une population complexe appelé un biofilm - ces biofilms sont très résistants à de nombreuses contraintes et des antibiotiques environnementaux. Ceci est en partie en raison de leur matrice extracellulaire dense (composé de protéines, des polysaccharides et des acides nucléiques) 12 et en partie en raison de la présence accrue de robustes &quot;persistor&quot; cellules dans les biofilms 13. although les mécanismes précis de l&#39; association de surface et la formation de biofilm ultérieure sont difficiles à caractériser, il est généralement admis qu&#39;il existe trois différents stades de croissance de la surface 14 - 16. , La fixation réversible initiale est suivie d&#39;une adhérence plus forte des cellules, la mise en place d&#39;un biofilm par la production d&#39;une protéine extracellulaire et de la matrice de polysaccharide et de la prolifération cellulaire. Enfin, les biofilms matures libère les cellules planctoniques, qui peuvent initier de nouvelles infections ailleurs vivant en liberté. polymères qui empêchent la fixation initiale des bactéries, et donc empêchent premières étapes de la formation de biofilm de bactéries repoussant, représentent potentiellement une excellente solution pour minimiser les infections. Compte tenu de l&#39;augmentation de la résistance aux antibiotiques (et aussi la plus grande résistance intrinsèque des bactéries associées à la surface 12), un moyen sans antibiotique pour réduire les infections sont particulièrement intéressantes. Dans un milieu hospitalier, polymère bactéries repoussantrevêtements peuvent avoir une application médicale directe dans la réduction des infections nosocomiales, qui forment généralement des dispositifs implantés autour de 17. Ici, une méthode à haut débit pour le criblage de 381 polymères pour l&#39; activité répulsive contre une gamme de bactéries pathogènes associés aux infections nosocomiales, suivie de la validation de succès et revêtement ultérieur et le dosage des matériaux centraux de cathéter veineux, est décrit (Figure 1). En bref, les polymères ont été repérés sur agarose revêtu des lames de verre par l&#39;impression de contact et, après le séchage et la stérilisation, les réseaux miniaturisés ont été incubées avec des cultures bactériennes cliniquement importantes. Après incubation, les puces à ADN ont été doucement lavées et les cellules bactériennes adhérentes ont été colorées et visualisés par fluorescence. Par la suite, des polymères qui inhibent la liaison des bactéries ont été étudiées sur une plus grande échelle par enduction sur des lamelles de verre et visualisés par microscopie électronique. repel sélectionnépolymères prêtés ont ensuite été appliqués sur des cathéters commerciaux et montrés pour réduire l&#39;attachement des bactéries de près de 100 fois.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>05066&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lames de préparation au silane</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>Polymères</td><td>synthétisés en interne</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sigma</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>(3- aminopropyle) lames de verre revêtues de triéthoxysilane</td><td>Sigma</td><td>Silane-prep</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>Sigma</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter 1</td><td>Arrow International</td><td>CS12123E</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 2</td><td>Baxter Healthcare</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>Sigma</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contact imprimante</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à microréseaux</td><td>IMSTAR</td><td>Pathfinder</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Speedline Technologies</td><td>6708D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Média Cybernétique</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Philips</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement par pulvérisation cathodique</td><td>Bal-Tec</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

haut-débit identification des bactéries polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Les dispositifs médicaux sont souvent associés à des infections nosocomiales, qui exercent une pression énorme sur les patients et le système de santé et contribuent à la résistance aux antimicrobiens. Une voie possible pour réduire les infections associées aux dispositifs est l’identification de revêtements polymères antibactériens pour ces dispositifs, ce qui empêcherait la liaison bactérienne à l’étape de fixation initiale. Une méthode d’identification de ces polymères répulsifs, basée sur le criblage parallèle de centaines de polymères à l’aide d’une puce à ADN, est décrite ici. Cette méthode à haut débit a permis d’identifier une gamme de polymères prometteurs qui résistaient à la liaison de diverses espèces bactériennes cliniquement pertinentes, individuellement et également en tant que communautés multi-espèces. Un polymère, le PA13 (poly(méthacrylate de méthyle-co-diméthylacrylamide)), a démontré une réduction significative de la fixation d’un certain nombre d’isolats hospitaliers lorsqu’il était appliqué sur deux cathéters veineux centraux disponibles dans le commerce. La méthode décrite pourrait être appliquée pour identifier les polymères destinés à un large éventail d’applications dans lesquelles la modification de la fixation bactérienne est importante.

La figure 2 montre la fixation des bactéries (intensité de fluorescence normalisée) à un certain nombre de polymères tels que déterminés par analyse par microréseau. Spots imprimés sans polymère (NMP seulement) sont le contrôle négatif, que l&#39; agarose résiste fortement la liaison 6 bactérienne - fluorescence enregistrée est très faible. Les polymères affichés sont tous à faible liaison, bien que dans la plupart des cas, les propriétés répulsives d&#39;un polymère varie considérablement entre les espèces bactériennes testées. Cela reflète les grandes différences entre les mécanismes de fixation à travers les différentes espèces. La sélection d&#39;un polymère approprié est donc fonction de l&#39;application, mais les polymères de faible liaison sont facilement identifiés par comparaison avec d&#39;agarose. polymères de haute liaison sont susceptibles d&#39;être identifiés dans un tableau, et peuvent être utilisés comme témoins positifs pour les expériences ultérieures. Pour les polymères qui ne présentent pas d&#39;auto-fluorescence dans le canal DAPI, co qualitativemparison des images spot peut être fait visuellement (comme le montre la figure 3, mettant en évidence un polymère de haute liaison représentant et trois par exemple des polymères à faible liaison). Une telle comparaison, tout en fournissant moins d&#39;informations que l&#39;analyse statistique peut être une validation visuelle utile des valeurs d&#39;intensité calculées. Avec 22 polymères appropriés identifiés par micropuce, expériences à l&#39;échelle-up sont effectuées pour confirmer leur propriété bactéries repoussant lorsqu&#39;il est utilisé pour le revêtement de surfaces plus grandes. Montré sont les exemples les plus performants, utilisés pour des lamelles de verre de revêtement (analysées par SEM (figures 4 et 5)) et les tranches de cathéter (analysées par microscopie confocale (figure 6) et SEM (figure 7)). Les deux méthodes microscopiques ont l&#39;avantage de permettre la numération des cellules directes sur la surface, fournissant des données sans ambiguïté; réduction de la fixation des cellules est facilement visible. Ces revêtements qui conservaient le mieux à leurs propriétés répulsives sur l&#39;échelle, tout en étant prête à des techniques de revêtement à grande échelle, ont été étudiées plus loin. Les résultats présentés illustrent les polymères les plus performants de chaque étape. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" /> Figure 1: ETM = microscopie électronique Les étapes impliquées dans l&#39;identification de bactéries polymères hydrophobes par des microréseaux de polymères pour des applications biomédicales de numérisation.. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" /> Figure 2:. Liaison bactérienne sur une série de polymères, déterminée par l&#39; analyse des microréseaux faible liaison bactérienne est vu sur un certain nombre de polyacrylates / acrylamides (PA) et polyuréthanes (PU). Les résultats des microréseaux polymères sondées avec plusieurs s bactériens<html> Les espèces (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, et deux consortiums; BacMix-1 et BacMix-2) sont présentés. Bactérienne liaison exprimée en fond corrigée moyenne DAPI intensité de fluorescence (normalisée). Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type. Adapté de la référence 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" /> Figure 3:. Images Exemples de spots polymères Fluorescence (DAPI) et microscopie en fond clair images de BacMix-2 montrant la fixation des bactéries sur des polymères représentatifs. Un polymère fortement contraignant est inclus à titre de comparaison à plusieurs polymères non contraignants (PU-20, PA-336 et PU-179). Barre d&#39;échelle = 100 um. Adapté de la référence 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" /> Figure 4: expériences d&#39;échelle-up avec des lamelles de verre images MEB montrant la fixation des bactéries sur le verre non couché et le verre revêtu de polymères «hit» (exemples choisis dans le tableau 1).. Les barres d&#39;échelle = 20 pm. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" /> Figure 5:. Liaison bactérienne quantifiée par le nombre de cellules à partir d&#39; images MEB Comparaison des cellules fixées par unité de surface des surfaces revêtues avec les meilleurs polymères «hit». Agarose a été utilisé comme «non contraignant» surface d&#39;un contrôle, avec le verre comme surface de liaison de contrôle. Les barres d&#39;erreur représententécart-type. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" /> Figure 6: Comparaison de la fixation des bactéries sur des tranches de cathéters revêtus et non revêtus de comparaison d&#39; images confocales cathéter non traité (Cath-1) (A) et le cathéter revêtu de PA13 (B) après incubation avec BacMix-2.. Les images prises avec un objectif 40X (barre d&#39;échelle = 20 pm). Adapté de la référence 6. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" /> Figure 7:. La comparaison de la liaison bactérienne sur des tranches de cathéter revêtues et non revêtues images MEB montrent la comparaison d&#39; un cathéter non traité (Cath-1) (A) et le cathéter revêtu de PA13 (B) après incubation avec un cocktail de bactéries consistant en BacMix-2 Scale. barres = 101; m. Adapté de la référence 6. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Polymère </td><td> monomère 1 </td><td> monomère 2 </td><td> monomère 3 </td><td colspan="3"> Ratio de Monomères </td></tr><tr><td> PA465 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> IL A </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA475 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> HEMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA513 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> MMA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA515 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> MMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA13 </td><td&gt; MMA </td><td> DMAA </td><td> - </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU1 </td><td> PEG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU16 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU161 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU7 </td><td> PEG900 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU83 </td><td> PEG900 </td><td> HMDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU227 </td><td> PPG-PEG-1900 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU129</td><td> PPG425 </td><td> BICH </td><td> DMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU10 </td><td> PTMG2000 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU179 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> NMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU20 </td><td> PTMG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU5 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Composition des bactéries non-binding &quot;frappé&quot; polymères à la figure 2.

Une méthode de microréseau à haut débit pour l’identification de polymères qui réduisent la liaison bactérienne de surface sur les dispositifs médicaux est décrite.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

L'objectif général de cette technique de microarray de polymères est d'identifier des polymères synthétiques capables de moduler l'attachement des bactéries aux surfaces abiotiques. Cette méthode peut contribuer à accélérer les progrès dans la découverte de biomatériaux simples et rentables qui inhibent l'attachement bactérien aux dispositifs médicaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux recherches conventionnelles sur les biomatériaux, qui testent un matériau à la fois, réside dans sa capacité à analyser simultanément des centaines de polymères dans un seul essai.Pour commencer, préparez des solutions polymériques et ajoutez-les dans les puits d'une plaque à 384 puits, conformément au protocole décrit. Établissez une procédure pour imprimer les polymères en quadruplé, composée de 1536 points, organisés en 48 lignes et 32 colonnes, en imprimant 32 solutions polymériques à la fois, de sorte que l'imprimante puisse être arrêtée après chaque section afin de permettre le nettoyage des pointes. Placez maintenant les lames recouvertes d'agarose sur la plateforme et assurez un bon joint sous vide pour maintenir les lames en position. Pour régler la tête d'impression afin que toutes les broches soient à la même hauteur, abaissez manuellement la tête sur une lame de verre et vérifiez que les broches remontent simultanément. Placez la plaque de puits sur le support avec le puits A1 en haut à droite du support, et assurez-vous que la plaque de puits est bien fixée. Confirmez que la lame et la plaque de puits sont en position lorsque vous y êtes invité.Imprimez une section à la fois, en prévoyant le nettoyage des broches entre chaque section. Ensuite, utilisez une serviette en papier imprégnée d'acétone pour nettoyer soigneusement les broches, suivie d'un essuyage avec du papier absorbant sec afin de s'assurer que les broches sont parfaitement sèches.Lorsque les puces à ADN sont entièrement imprimées, placez-les dans un porte-lame et transférez-les dans une étuve sous vide, réglée à 40 degrés celsius, pour les sécher et éliminer le N&P présent dans les taches de polymère. Ensuite, utilisez une lumière UV pour stériliser les plaques pendant 30 minutes. Avant d'ensemencer les lames avec des bactéries, effectuez une mesure de la fluorescence de fond conformément au protocole indiqué.Après la culture et la préparation des inoculums pour les puces à ADN, conformément au protocole décrit, placer les puces polymères stérilisées par rayonnement UV dans des plaques rectangulaires à quatre puits et ajouter six millilitres de cultures bactériennes mélangées. Incuber les plaques à 37 degrés celsius avec agitation douce pendant cinq jours. À l'issue de l'incubation, rincer délicatement les puces deux fois à l'aide de PBS.Ensuite, ajouter un microgramme par millilitre de DAPI dans du PBS et incuber pendant 30 minutes. Puis, transférer les puces à microarrays dans une nouvelle plaque à quatre puits, recouvrir les puces de PBS, puis agiter doucement. Changer ensuite le PBS une fois et répéter le lavage.Après le rinçage, séchez les puces à ADN sous un flux d'air, puis appliquez un film d'étanchéité et fixez des lamelles en verre sur les lames de puces. Une fois la colle sèche, stérilisez la surface externe à l'aide d'éthanol à 70 %. À l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif 20x, capturez une image unique pour chaque point de polymère en champ clair et en canaux fluorescents.Pour recouvrir les lamelles de polymères, préparez des solutions de polymères HIT dans du tétrahydrofuranne ou un autre solvant approprié. À l’aide d’un dispositif de dépôt par centrifugation, appliquez par rotation des lamelles circulaires en verre de taille adaptée avec les solutions de polymère à 2000 tr/min pendant dix secondes. Séchez les lamelles recouvertes dans une étuve à convection à 40 degrés celsius pendant toute la nuit.Et utilisez une lumière UV pour stériliser les lamelles pendant 30 minutes avant l'ensemencement avec des bactéries. Placez les lamelles stérilisées par UV dans une plaque standard de 12 ou 24 puits et incubez-les avec les bactéries comme démontré précédemment dans cette vidéo. Après l'incubation, lavez les lamelles recouvertes deux fois avec un tampon de cacodylate 0,1 molaire, puis fixez les échantillons pendant deux heures avec du glutaraldéhyde à 2,5 % poids par volume et du tampon de cacodylate 0,1 molaire.Post-fixez les lamelles avec du tétraoxyde d'osmium à 1 % pendant une heure à température ambiante. Avant de les déshydrater dans une série d'éthanol pendant 30 minutes à chaque concentration. Ensuite, recouvrez les échantillons avec un courant de 30 milliampères et un vide de 0,75 torr à l'aide d'un pulvérisateur cathodique et d'un mélange d'alliage or à platine de 60 à 40 %.Après avoir pris des images au MEB, comparer visuellement les images des lamelles non revêtues et de celles recouvertes d'agarose ou des polymères HIT afin de confirmer les capacités des polymères à fixer ou à repousser les bactéries. Pour évaluer la compatibilité de divers solvants avec la partie distale du cathéter, ainsi que leur capacité à dissoudre le polymère HIT, plonger les morceaux de cathéter dans les solvants et incuber pendant 12 heures, puis évaluer visuellement l'intégrité du cathéter et la clarté du solvant. Pour analyser l'attachement bactérien sur les cathéters par MEB, préparer une solution de polymère à 10 % dans l'acétone.Appuyez la pointe d'une micropipette de 200 microlitres sur la partie médiane du morceau découpé du cathéter pour le maintenir, puis plongez le morceau dans la solution polymère pendant environ 30 secondes. Laissez sécher le morceau recouvert à température ambiante pendant 30 minutes, puis appliquez un second revêtement en immergeant à nouveau le morceau de cathéter dans la solution polymère et laissez sécher toute la nuit dans des conditions ambiantes. Après avoir incubé les morceaux de cathéter revêtus et non revêtus dans du LB inoculé, selon le protocole décrit, utilisez un millilitre de PBS pour rincer les cathéters.Ensuite, utilisez du paraformaldéhyde à 10 % dans du PBS pour fixer les bactéries pendant 30 minutes. Après un lavage avec du PBS, utilisez le DAPI pour colorer les bactéries sur les fragments de cathéter pendant 20 minutes. Avant de laver avec un millilitre de PBS.Observer l'arrangement des échantillons dans la chambre. À l'aide des paramètres suivants, acquérir des images en microscopie confocale des fragments de cathéter. Réaliser l'imagerie confocale en effectuant un empilement z de 50 images sur une longueur de 100 micromètres du cathéter.Après le traitement UV et l'incubation avec des bactéries, utilisez un millilitre de PBS pour laver les fragments deux fois, puis transférez-les dans des plaques de 48 puits contenant du formaldéhyde à 10 % dans le PBS pendant 30 minutes. Après la fixation des échantillons, effectuez un autre lavage avec le PBS et laissez sécher toute la nuit à température ambiante. Ensuite, montez-les sur des supports à l’aide de disques de carbone conducteur et recouvrez-les d’or à l’aide d’un pulvérisateur cathodique.Avant l’imagerie, à l’aide d’un microscope électronique à balayage. Cette figure montre l’attachement bactérien à plusieurs polymères tel qu’évalué par analyse de puces à ADN. Les taches imprimées sans polymère servent de contrôle négatif, car l’agarose s’oppose fortement à la liaison bactérienne et la fluorescence est donc très faible.Les polymères affichés présentent une liaison d'alliage, bien que dans la plupart des cas, les propriétés répulsives d'un polymère varient considérablement entre les espèces bactériennes testées. Cela reflète les grandes différences entre les mécanismes d'attachement d'une espèce à l'autre. Les polymères à faible liaison sont facilement identifiables par comparaison avec l'agarose.Les polymères à forte affinité sont susceptibles d'être identifiés dans un réseau et peuvent être utilisés comme témoins positifs pour les expériences ultérieures. Pour les polymères qui ne présentent pas de fluorescence autofluorescente dans le canal DAPI, une comparaison qualitative des images de taches peut être effectuée visuellement. Des expériences à plus grande échelle visant à tester l'application de revêtements sur de plus grandes surfaces ont été réalisées afin de confirmer les propriétés répulsives bactériennes des 22 polymères appropriés identifiés.Présentés ici, les échantillons les plus performants utilisés pour recouvrir des lamelles de verre, tels qu'analysés par MEB. Ces figures montrent des tranches de cathéter analysées par microscopie confocale et MEB. Les deux méthodes microscopiques présentent l'avantage de permettre des décomptes cellulaires directs à la surface, fournissant des données sans ambiguïté, puisque la réduction de l'attachement cellulaire est facilement visible.Après avoir suivi cette procédure, les composants sériques ou sanguins peuvent être analysés afin d'évaluer leur impact sur la liaison bactérienne. Un modèle animal pourrait être utilisé afin d'évaluer le potentiel des revêtements polymères pour une utilisation clinique. N'oubliez pas que le travail avec des produits chimiques et des organismes pathogènes peut présenter des risques.Des contrôles appropriés doivent être mis en place lors de la manipulation et de l'élimination afin de réduire les risques pour la santé et l'environnement.

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