Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

L’objectif global de cette technique de microréseau de polymères est d’identifier des polymères synthétiques capables de moduler la fixation des bactéries sur des surfaces abiotiques. Cette méthode peut contribuer à accélérer les progrès dans la découverte de biomatériaux simples et rentables qui inhibent la fixation bactérienne aux dispositifs médicaux. Le principal avantage de cette technique par rapport à la recherche conventionnelle sur les biomatériaux qui consiste à tester un matériau à la fois est sa capacité à cribler des centaines de polymères simultanément dans un seul actif.

Pour commencer, préparez des solutions de polymères et ajoutez-les dans les puits d’une plaque de 384 puits, selon le protocole de texte. Créez une routine pour imprimer des polymères en quatre exemplaires composée de 1536 points, disposés en 48 rangées et 32 colonnes, en imprimant 32 solutions de polymères à la fois afin que l’imprimante puisse être arrêtée après l’impression de chaque section pour permettre le nettoyage des broches. Placez maintenant les lames revêtues d’agarose sur la plate-forme et assurez-vous d’une bonne étanchéité sous vide pour maintenir les lames en position.

Pour régler la tête d’impression de manière à ce que toutes les broches soient à la même hauteur, abaissez manuellement la tête sur une glissière en verre et vérifiez que les broches se déplacent vers le haut en même temps. Placez la plaque de puits sur le support de plaque avec le puits A1 en haut à droite du support et assurez-vous que la plaque de puits est solidement fixée. Confirmez que la glissière et la plaque de puits sont en place lorsque vous y êtes invité.

Imprimez une section à la fois, ce qui permet de nettoyer les broches entre les sections. Utilisez ensuite une serviette en papier trempée dans de l’acétone pour nettoyer soigneusement les épingles. Suivi d’un papier de soie sec pour s’assurer que les épingles sont complètement sèches.

Lorsque les microréseaux sont complètement imprimés, placez-les dans un porte-diapositives et transférez-les dans un four à vide, réglé à 40 degrés Celsius pour sécher, afin d’éliminer le N&P dans les taches de polymère. Utilisez ensuite la lumière UV pour stériliser les plaques pendant 30 minutes. Avant d’inoculer des lames avec des bactéries, prenez une mesure de la fluorescence de fond conformément au protocole de texte.

Après la culture et la préparation de l’inoculum pour les microréseaux, conformément au protocole de texte, placez les microréseaux de polymères stérilisés aux UV dans des plaques rectangulaires à quatre puits et ajoutez six millilitres de cultures bactériennes mixtes. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius en agitant doucement pendant cinq jours. Après l’incubation, utilisez du PBS pour rincer doucement les microréseaux deux fois.

Ajoutez ensuite un microgramme par millilitre de DAPI dans du PBS et incubez pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les microréseaux dans une nouvelle plaque à quatre puits, couvrez les microréseaux de PBS puis agitez doucement. Ensuite, changez le PBS une fois et répétez le lavage.

Après le rinçage, séchez les microréseaux sous un courant d’air, puis appliquez un film d’étanchéité et fixez des lamelles en verre sur les lames des microréseaux. Lorsque la colle est sèche, utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la surface extérieure. À l’aide d’un microscope à fluorescence, équipé d’un microscope subjectif 20x, capturez des images uniques pour chaque point polymère en fond clair et dans les canaux à bandes.

Pour enduire les lamelles de polymères, préparer des solutions de polymères HIT dans du tétrahydrofurane ou un autre solvant approprié. À l’aide d’une machine à revêtir par centrifugation des lamelles de verre circulaires de taille appropriée avec les solutions polymères à 2000 tr/min pendant dix secondes. Séchez les lamelles revêtues dans un four à convection à 40 degrés Celsius pendant la nuit.

Et utilisez la lumière UV pour stériliser les lamelles pendant 30 minutes avant d’inoculer avec des bactéries. Placez les lamelles de recouvrement stérilisées aux UV dans une plaque standard de 12 ou 24 puits et incubez avec des bactéries comme démontré précédemment dans cette vidéo. Après l’incubation, utiliser un tampon cacodylate de 0,1 molaire pour laver deux fois les lamelles de recouvrement revêtues, puis avec 2,5 % de glutaraldéhyde par volume et un tampon de cacodylate de 0,1 molaire, fixer les échantillons pendant deux heures.

Post-fixez les lamelles avec 1 % de tétroxyde d’osmium pendant une heure à température ambiante. Avant de les déshydrater en série d’éthanol pendant 30 minutes à chaque concentration. Ensuite, à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique et d’un mélange d’alliage d’or à platine de 60 à 40 %, enduire les échantillons à l’aide d’un courant de 30 milliampères et d’un vide de 0,75 torr.

Après avoir pris des images avec MEB, comparez visuellement les images des lamelles de recouvrement non revêtues et de celles recouvertes d’agarose ou des polymères HIT pour confirmer les capacités de liaison ou de répulsion bactériennes des polymères. Pour évaluer la compatibilité de divers solvants avec la partie de puits d’extrémité du cathéter, ainsi que leur capacité à dissoudre le polymère HIT, immergez les pièces du cathéter dans les solvants et incubez pendant 12 heures avant d’évaluer visuellement l’intégrité du cathéter et la clarté du solvant. Pour analyser la fixation bactérienne sur les cathéters par MEB, préparez une solution de polymère à 10 % dans de l’acétone.

Appuyez sur une pointe de micropipette de 200 microlitres dans la partie médiane du morceau coupé du cathéter pour le maintenir et collez le morceau dans la solution polymère pendant environ 30 secondes. Séchez la pièce revêtue dans des conditions ambiantes pendant 30 minutes, puis appliquez une deuxième couche en immergeant à nouveau la pièce de cathéter dans la solution polymère et séchez-la pendant une nuit dans des conditions ambiantes. Après avoir incubé des morceaux de cathéter revêtus et non revêtus dans du LB inoculé, selon le protocole de texte, utilisez un millilitre de PBS pour laver les cathéters.

Utilisez ensuite 10 % de paraformaldéhyde dans du PBS pour fixer les bactéries pendant 30 minutes. Après un lavage avec du PBS, utilisez du DAPI pour colorer les bactéries sur les morceaux du cathéter pendant 20 minutes. Avant de laver avec un millilitre de PBS.

Observez la disposition des échantillons dans la chambre. À l’aide des paramètres suivants, prenez des images confocales des pièces du cathéter. Complétez l’imagerie confocale en empilant 50 images sur une longueur de 100 micromètres du cathéter.

Après le traitement UV et l’incubation avec des bactéries, utilisez un millilitre de PBS pour laver les pièces deux fois et transférez-les dans des plaques de 48 puits contenant 10 % de formaldéhyde dans du PBS pendant 30 minutes. Après avoir fixé les échantillons, effectuez un autre lavage avec du PBS et séchez-les pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, montez sur des embouts avec des disques en carbone conducteurs et utilisez une coucheuse à pulvérisation cathodique pour enduire l’or.

Avant l’imagerie, à l’aide d’un microscope électronique à balayage. Cette figure montre l’attachement bactérien à un certain nombre de polymères, tel que déterminé par l’analyse des microréseaux. Les taches imprimées sans polymère agissent comme un contrôle négatif car l’agarose résiste fortement à la liaison bactérienne et la fluorescence est donc très faible.

Les polymères présentés sont liés à un alliage, bien que dans la plupart des cas, les propriétés répulsives d’un polymère varient considérablement entre les espèces bactériennes testées. Cela reflète les grandes différences entre les mécanismes d’attachement entre les différentes espèces. Les polymères à faible liaison sont facilement identifiables par comparaison avec l’agarose.

Les polymères à haute liaison sont susceptibles d’être identifiés dans un réseau et peuvent être utilisés comme témoins positifs pour des expériences ultérieures. Pour les polymères qui ne présentent pas d’auto-fluorescence dans le canal DAPI, une comparaison qualitative des images ponctuelles peut être effectuée visuellement. Des expériences à grande échelle ont été réalisées pour tester le revêtement de surfaces plus grandes afin de confirmer les propriétés antibactériennes de 22 polymères appropriés identifiés.

Vous trouverez ici les échantillons les plus performants utilisés pour revêtir les lamelles de recouvrement en verre, tels qu’analysés par MEB. Ces figures montrent des coupes de cathéter analysées par microscopie confocale et MEB. Les deux méthodes microscopiques ont l’avantage de permettre un comptage direct des cellules en surface, fournissant des données sans ambiguïté, car la réduction de l’attachement des cellules est facilement visible.

À la suite de cette procédure, des composants sériques ou sanguins pourraient être testés pour déterminer leur impact sur la liaison bactérienne. Un modèle animal pourrait être utilisé afin d’évaluer le potentiel des revêtements polymères pour une utilisation clinique. N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques et des organismes pathogènes peut être dangereux.

De plus, les contrôles nécessaires doivent être mis en place lors de la manipulation et de l’élimination afin d’atténuer les risques personnels et environnementaux.