L'isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

L’objectif global de cette technique d’immunoprécipitation d’ARN est d’isoler et de caractériser sélectivement des complexes protéiques d’ARN endogènes formés dans des cellules eucaryotes via un enrichissement spécifique dirigé vers les oligonucléotides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du contrôle post-transcriptionnel, telles que la composition des protéines de liaison à l’ARN qui définissent les cinq premiers UTR d’un transcrit rétroviral pour réguler son expression génique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à un chercheur d’isoler et de caractériser sélectivement un complexe protéique d’ARN spécifique d’intérêt tout en conservant la possibilité de mener une analyse plus globale de la RNP en aval.

Eh bien, les implications de cette technique s’étendent à la compréhension fondamentale des infections virales et de nombreuses maladies cellulaires. Et fournit des informations significatives sur les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel de l’expression des gènes. Cela pourrait signifier de nouvelles cibles médicamenteuses viables.

Après la culture de cellules et l’immunoprécipitation d’une protéine marquée FLAG conformément au protocole de texte, transférez 60 microlitres par IP de boue de billes magnétiques pro-TG dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre. Placez le tube sur une grille magnétique et retirez la solution de stockage en le pipetant soigneusement. Retirez ensuite le tube du support.

Ajouter 600 microlitres de 1x tampon de lavage. Et placez le tube sur un rotateur d’extrémité à bout à température ambiante pendant trois minutes, pour laver et équilibrer les billes. Placez le tube sur la grille magnétique et retirez le tampon de lavage.

Ajoutez ensuite 10 volumes de 1x tampon de lavage frais. Ajoutez l’anticorps immunoprécipitant FLAG aux billes magnétiques pro-TG équilibrées. Ensuite, faites pivoter le tube à température ambiante pendant au moins 30 minutes, pour conjuguer l’anticorps immunoprécipitant.

Placez le tube sur l’aimant et retirez le surnageant. Retirez ensuite le tube de l’aimant et ajoutez 1x tampon de lavage aux perles et tournez à température ambiante pendant trois minutes. Répétez l’étape de lavage deux fois et retirez le tampon final.

Retirez le milieu de culture des cellules par aspiration et utilisez 1,5 millilitre de PBS glacé pour laver les cellules deux fois. À l’aide d’un grattoir à cellules, délogez les cellules humides et adhérentes. Pipetez la suspension cellulaire dans des tubes frais, puis centrifugez la culture à 226 fois G à quatre degrés Celsius, pendant quatre minutes.

Ajoutez 375 microlitres de tampon glacé à faible teneur en sel à la pastille cellulaire et incubez l’échantillon sur de la glace pendant cinq minutes pour permettre le gonflement. Il est important de faire attention lors de l’ajout et de la remise en suspension de la pastille cellulaire dans le tampon de lyse à faible teneur en sel, afin d’assurer une immersion et un gonflement complets sans perturbation mécanique prématurée. Pour recueillir le lysat de cellules cytoplasmiques, ajoutez 125 microlitres de tampon de lyse glacé, puis utilisez un homogénéisateur Dounce pré-réfrigéré pour effectuer dix passages.

Homogénéiser avec suffisamment de force pour permettre la lyse de la membrane plasmique et les contaminants du lysat cytoplasmique libéré. Mais veillez à ne pas trop étendre la perturbation mécanique et à risquer des contaminations nucléaires, une perturbation du complexe ARN-protéine ou une perte de Spin libéré de l’homogénat dans un microfuge à grande vitesse pendant une minute. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de 1,7 millilitre qui a été sur de la glace.

Déterminez la concentration totale en protéines. Réserver 10 % pour l’analyse par transfert Western, à utiliser comme contrôle d’entrée. Pour effectuer une immunoprécipitation, ajoutez le volume souhaité de lysat cellulaire récolté aux billes conjuguées d’anticorps cibles.

À l’aide de 1x tampon de lavage, portez le volume total à 600 microlitres et faites pivoter l’échantillon à température ambiante. Après 90 minutes d’incubation, placez le tube IP sur le support magnétique pour recueillir les billes. Ensuite, récupérez le surnageant et réservez-le sous forme d’écoulement.

Ensuite, ajoutez 10 volumes de tampon de lavage NETN 150 glacé à la RNP liée, billes conjuguées d’anticorps, et faites pivoter l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes. Après avoir remis en suspension les complexes RNP immobilisés dans 1x tampon de liaison selon le protocole de texte, ajustez le volume restant dans 100 microlitres de 1x tampon de liaison glacé. Et chauffez le tube à 70 degrés Celsius pendant trois minutes.

Pour isoler des complexes protéiques d’ARN apparentés, ajoutez un oligo d’ADN nucléotidique d’environ 30 nucléotides, complémentaire à la limite des trois séquences premières de l’ARN d’intérêt. Et incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec un léger balancement. Ajoutez cinq à dix unités de RNase H dans le tube et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure pour cliver l’ARN de l’hybride d’ARN ADN.

Transférez ensuite le surnageant contenant les complexes RNP d’intérêt capturés dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,7 millilitre. Pour collecter l’ARN immunoprécipité, remettre en suspension la moitié de l’échantillon total de complexes d’ARN capturés dans 750 microlitres de réactif de thiocyanate de guanidinium acide. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme dans le tube, agitez vigoureusement pendant 10 secondes et incubez à température ambiante pendant trois minutes.

Après la centrifugation, récupérez la phase aqueuse dans un tube frais et ajoutez un volume égal d’isopropanol. Mélangez bien et incubez l’échantillon à température ambiante pendant au moins dix minutes. Ajoutez un microlitre de bleu de glycol à l’échantillon et stockez-le à moins 20 degrés Celsius pour une précipitation ou un traitement efficace à une date ultérieure.

Centrifugez le tube à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant dix minutes. À l’aide d’une micropipette P200, on recueille et jette soigneusement le surnageant afin de ne pas perturber la pastille d’ARN. Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 75 % dans chaque tube.

Vortex et centrifugez les tubes pendant cinq minutes. Récupérez soigneusement et jetez le surnageant comme il vient d’être démontré. Faites sécher le granulé à l’air libre pendant deux à trois minutes et utilisez 100 microlitres d’eau libre de RNase pour le remettre en suspension.

Appliquez 100 microlitres de l’échantillon d’ARN dans une colonne de nettoyage d’ARN. Et traitez-le selon le protocole du fabricant. Enfin, éluez l’ARN dans 30 microlitres d’eau libre de RNase et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à trois mois.

Pour isoler des éléments de contrôle post-transcriptionnels, ou des complexes ribonucléoprotéiques PCE, GAG, ARN, RHA formés dans des cellules en prolifération. L’immunoprécipitation de FLAG-MS2 RNP a été réalisée dans des lysats de cellules HECK293 transfectés. Les résultats montrent une précipitation efficace de la protéine FLAG-MS2.

Comme DHX9/RHA se trouve dans le complexe RNP et non dans le contrôle isotopique IgG, ni dans le contrôle négatif. On voit ici des transferts Western de complexes d’ADN ARN digérés par la RNase H. La RNase H a clivé l’ARN gag PCE, libérant le complexe RNP spécifiquement lié aux cinq premiers UTR.

Les RNP associés à DHX9/RHA ont été enrichis dans les éluants. Il est important de noter que les RNP liées à FLAG-MS2 sont restées avec les billes conjuguées de l’anticorps. Dans cette expérience, l’immunoprécipitation HO de la boucle souche MS2, contenant l’ARN gag PCE rétroviral dans les cellules et dans les éluants, a été validée par RT-PCR et QRT-PCR.

Les résultats ont confirmé une association sélective entre DHX9/RHA et le RTU rétroviral à cinq primes, qui a été mis en évidence comme un RNP unique, important pour le contrôle ciblé de la traduction. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures, si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer toutes les étapes efficacement et avec soin, afin d’assurer le maintien des complexes RNP intacts et l’isolement du complexe RNP spécifique d’intérêt.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectrométrie de masse et le RNA-Seq, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l’association globale des protéines avec l’ARN cible. Et l’analyse régionale ou complète de tous les transcrits engagés dans un RNP particulier. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du contrôle génique post-transcriptionnel pour explorer les complexes protéiques ARN distincts régissant l’expiration des gènes viraux pathogènes et le mécanisme général du contrôle de l’expression génique cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récolter des complexes RNP cellulaires intacts et de déterminer leur composition à l’aide d’un enrichissement sélectif dirigé par oligonucléotides. N’oubliez pas non plus que travailler avec des virus pathogènes et des échantillons biologiques et des produits chimiques dangereux comme l’acide ou le phénol peut être extrêmement dangereux. Toutes les précautions, telles qu’un équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.