Name: Lisolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez l'isolement sélectif des complexes ARN-protéine par immunoprécipitation et élution oligonucléotide-dirigée dans les cellules eucaryotes. Cette méthode permet d'étudier la régulation post-transcriptionnelle des rétrovirus et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Les auteurs remercient le soutien par le NIH P50GM103297, P30CA100730 et Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Buffer Compositions </td></tr><tr><td> Wash Buffer: </td></tr><tr><td> 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mM de NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> Tampon à faible sel: </td></tr><tr><td> 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 10 mM de NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 1x cocktail inhibiteur de protease EDTA-free </td></tr><tr><td> RNase Out 5 pl / ml (inhibiteur de RNase) </td></tr><tr><td> Cytoplasmique Lysis Buffer: </td></tr><tr><td> 0,2 M Saccharose </td></tr><tr><td> 1,2% de Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 Wash Buffer: </td></tr><tr><td> 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% de NP-40 </td></tr><tr><td> 3 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 10% Glycérine </td></tr><tr><td> Binding Buffer: </td></tr><tr><td> 10 mM d&#39;HEPES pH 7,6 </td></tr><tr><td> 40 mM KCI </td></tr><tr><td> 3 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 5% de glycérol </td></tr></tbody></table> Tableau 2: compositions tampons. 1. Préparation des cellules et la matrice d&#39;affinité <ol><li> La culture d&#39;une lignée de cellules d&#39;intérêt à la sous-confluence (80%) dans une boîte de 10 cm. Utilisez plaques de 10 cm pour les immunoprécipitations indépendants (IP) d&#39;une NLS-MS2 protéine d&#39;enveloppe étiquetée FLAG. Effectuer l&#39;IP en utilisant des antiserums à l&#39;étiquette FLAG-épitope. Lors de l&#39; expression de la protéine d&#39;enveloppe MS2 plasmide FLAG-marqué, les cellules transfecter 24-48 h avant la récolte 20. NOTE: Un RNP particulier peut être enrichi du nucléaire ou le cytoplasmelysats ic ou une préparation biochimiquement-fractionnés, tels que des fractions d&#39;un gradient de saccharose. Il est recommandé de récolter le lysat à partir de cellules non transfectées en parallèle à instituer un contrôle négatif supplémentaire. </li><li> Transfert de 60 ul par IP de la protéine G bille magnétique suspension à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation. </li><li> Placer le tube sur un support magnétique pour microtubes pour séparer les billes de la solution de stockage. </li><li> Retirer la solution de stockage en tirant doucement vers le haut avec une micropipette. </li><li> Retirer le tube du porte-aimant. </li><li> Laver et équilibrer les billes avec 600 ul ( environ 10 fois le volume utilisé de perles) de 1 x tampon de lavage (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 3 mM et NaCl 150 mM) et l&#39; extrémité sur l&#39;autre extrémité rotation 3 min à température ambiante. </li><li> Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage. </li><li> Ajouter 10 volumes (600 pi) de tampon de lavage 1x et immunoprécipitation anticorps FLAG à la pr équilibréebilles magnétiques otein G (selon la quantité recommandée par le fabricant pour une immunoprécipitation) et rotation de bout en bout sur à la température ambiante pendant au moins 30 min pour conjuguer l&#39;anticorps immunoprécipitation. Utiliser les IgG d&#39;isotype correspondant en tant que témoin négatif d&#39;anticorps convenable. </li><li> Placer le tube sur le porte-aimant pour collecter les perles et à enlever le surnageant. </li><li> Retirer le tube du porte-aimant et laver les billes d&#39;anticorps conjugués avec des 10 volumes (600 ul) de tampon de lavage 1x et à la rotation pendant 3 min à température ambiante. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage. </li></ol> 2. La récolte de la RNP NOTE: Préparer les RNP au cours de la période d&#39;incubation après l&#39;étape 1.8. <ol><li> Éliminer le milieu de culture des cellules par aspiration et laver les cellules deux fois avec 1-5 ml de glace froide 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Utilisez un grattoir cellulaire pour déloger humide,cellules adhérentes avant la collecte par centrifugation à 226 g pendant 4 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 375 ul de tampon pauvre en sel glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 3 mM, NaCl 10 mM, DTT 2 mM, 1 x inhibiteur de la protéase cocktail, exempt d&#39; EDTA et 5 pl / ml RNase Inhibitor) au culot de cellules et de permettre le gonflement en le plaçant sur de la glace pendant 5 min. REMARQUE: mesure du volume d&#39;un tampon pauvre en sel, selon la taille du culot cellulaire. Pour 1,2 x 10 6 cellules d&#39;une plaque de 10 cm, 375 pi de tampon est suffisante. </li><li> Pour recueillir le lysat cellulaire cytoplasmique, ajouter 125 pi de tampon de lyse glacé (0,2 M de saccharose / 1,2% de Triton X-100), puis effectuer 10 coups avec un homogénéisateur Dounce qui était pré-refroidie dans un seau à glace. NOTE: Pour recueillir l&#39;extrait total de cellules, tampon standard de lyse RIPA est recommandé pour solubiliser le nucléoplasme / chromatine. </li><li> Spin dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale (16.000 xg) pendant 1 min; cela va effacer le surnageant des débris d&#39;unnoyaux nd. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,7 ml qui a été sur la glace. Déterminer la concentration totale des protéines par une méthode normalisée de laboratoire préféré, tel que le 23 dosage de Bradford. Réserver une fraction aliquote d&#39;au moins 10% pour une analyse par transfert de Western, pour être utilisé comme un contrôle d&#39;entrée. Utilisez le lysat de cellules récoltées immédiatement pour immunoprécipitation ou stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure. NOTE: Dans notre expérience, ces échantillons peuvent être conservés et utilisés quelques mois plus tard pour l&#39;analyse d&#39;immunoprécipitation sans compromis de l&#39;intégrité. </li></ol> 3. Immunoprécipitation <ol><li> Ajouter le volume désiré du lysat cellulaire récoltée, en fonction de la concentration en protéine déterminée à l&#39;étape 2.5, des billes d&#39;anticorps conjugué cible. À l&#39;aide du tampon de lavage 1x, porter le volume total à 600 ul et de rotation de bout en bout pendant 90 min à température ambiante. NOTE: Ce laps de temps est suffisant pour produireune isolation solide des complexes de RNP à affinité élevée, tout en minimisant la liaison non spécifique. Diluer sources RNP alternatives, telles que des fractions d&#39;un gradient de saccharose, au moins 1: 1 avec le tampon de lavage 1x, puis les incuber avec des complexes de billes-anticorps précédemment préparés, comme mentionné ci-dessus. </li><li> Après 90 min d&#39;incubation, placer le tube IP sur le porte-aimant pour recueillir les perles. Réserver le surnageant comme accréditives. NOTE: Ce premier écoulement est important échantillon de contrôle pour mesurer l&#39;efficacité IP. Un immunotransfert fournira une indication de l&#39;efficacité IP, ainsi que la spécificité des interactions étudiées. Il est recommandé de conserver ce surnageant pour l&#39;analyse en aval. </li><li> Laver les, des billes d&#39;anticorps conjugué à RNP lié avec 10 volumes (600 pi) de NETN-150 de tampon de lavage glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 3 mM, 0,5% de NP40, et 10% de glycerol) en rotation pendant 3 min à température ambiante. Répétez l&#39;étape 3 fois. NOTE: Ce tampon est différent du tampon de lyse et réduit les associations faibles ou non spécifiques, de manière efficace. </li><li> Après le dernier lavage, la remise en suspension des complexes RNP immobilisés dans 60 ul de tampon glacé 1x de liaison (HEPES 10 mM, pH 7,6, 40 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 5% de glycerol, et DTT 2 mM) et de la réserve 10% des billes complexes immobilisés pour le Western blot et 20% pour l&#39;isolement de l&#39;ARN. </li></ol> 4. Elution <ol><li> Ajuster le volume restant à 100 ul avec du tampon de liaison glacé 1x et chauffer le tube à 70 ° C pendant 3 min. </li><li> Pour isoler des complexes ARN-protéine apparentée, ajouter un ~ 30 nt oligonucléotide d&#39;ADN qui est complémentaire à la limite 3 &#39;de la séquence de l&#39;ARN d&#39;intérêt et incuber pendant 30 min à température ambiante avec une légère oscillation (100 nM d&#39;oligonucléotide est suffisant). NOTE: L&#39;oligonucléotide est antisens par rapport aux résidus de nucléotides adjacents au début de traduction du site de la construction PCE utilisé comme example dans ce protocole. la complémentarité de la séquence appropriée est fournie par le ~ 40% de teneur en GC. Concevoir l&#39;oligonucléotide anti-sens pour une hybridation efficace de la région complémentaire minimale de l&#39;ARN cible. </li><li> Ajouter 5-10 unités de RNase H dans le tube et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour cliver l&#39;ARN de l&#39;ARN: ADN hybride. Transférer le surnageant dans un tube de 1,7 ml de microcentrifugation stérile; cet échantillon contient les complexes RNP capturés d&#39;intérêt. NOTE: En fonction de l&#39;accessibilité de l&#39;ARN apparenté, deux ou plusieurs cycles de traitement RNase H peuvent être utiles pour augmenter l&#39;abondance de l&#39;échantillon pour les analyses en aval. </li><li> En utilisant 20% de l&#39;éluat dans un Western blot des protéines associées connus et 20% de l&#39;éluat pour l&#39;isolement de l&#39;ARN, suivie par RT PCR quantitative. Les 60% restants peuvent être utilisés pour la spectrométrie de masse ou d&#39;identifier les composants protéiques. </li><li> En parallèle, soumettre une partie aliquote du lysat cellulaire réservé à l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;analyse par RT-PCR. Cette assessment fournit une indication de l&#39;enrichissement de l&#39;ARN dans un complexe RNP. NOTE: Utiliser la préparation de protéine isolée dans un western blot de contrôle pour vérifier que le clivage RNase H était efficace pour libérer le RNP du complexe immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Protein Analyse Electrophorèse et Western Blot <ol><li> Objet environ 10 à 20% de l&#39;échantillon total à SDS-PAGE et analyse par immunotransfert selon le protocole standard de laboratoire. REMARQUE: Cette étape permet de valider l&#39;efficacité et la spécificité IP avant l&#39;analyse de l&#39;ARN en aval. Il peut également être utilisé pour évaluer la composition protéique du complexe RNP isolée. </li></ol> 6. Collection de l&#39;ARN immunoprécipité REMARQUE: l&#39;isolement d&#39;ARN peut être effectuée par la méthode Trizol ou suivant le protocole décrit. <ol><li> la moitié Resuspendre de l&#39;échantillon total dans 750 pi d&#39;acide réactif guanidinium thiocyanate et incuber à la salle tEMPÉRATURE pendant 5 minutes avant l&#39;extraction de l&#39;ARN à partir des complexes PCE-RNP capturés. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme dans le tube, agiter vigoureusement pendant 10 sec, et incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Après centrifugation à 16 000 xg pendant 15 min à 4 ° C, la collecte de la phase aqueuse dans le tube à nouveau et ajouter un volume égal d&#39;isopropanol. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant au moins 10 min. Ajouter 1 pi de bleu de glycol à l&#39;échantillon et le stocker à -20 ° C dans le congélateur pour la précipitation ou un traitement efficace à une date ultérieure. </li><li> Centrifuger le tube à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. recueillir soigneusement et jeter le surnageant de manière à ne pas perturber le culot d&#39;ARN; l&#39;utilisation d&#39;une pointe p-200 micropipette est recommandé pour faciliter ce processus. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 75% à chaque tube, vortexer et centrifuger les tubes à 16 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir soigneusement et jeter le surnageant comme dans l&#39;étape 6.4. Air-sécher la pastille pendant 2-3 min et remettre en suspension dans 100 pi d&#39;eau sans RNase. REMARQUE: Ne pas prolonger le temps les sèche à l&#39;air à granulés afin d&#39;éviter un problème avec resuspension. </li><li> Appliquer 100 pi d&#39;échantillon d&#39;ARN à une colonne de nettoyage d&#39;ARN. Processus en utilisant le protocole du fabricant. Eluer l&#39;ARN dans 30 pi d&#39;eau sans RNase et conserver à -80 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. NOTE: Cet ARN isolé est adapté à l&#39;analyse en aval par RT-PCR en temps réel (qPCR), microarray, et le séquençage de l&#39;ARN. En fonction de l&#39;abondance du RNP et l&#39;efficacité avec laquelle le RNP d&#39;intérêt est isolée, le même lysat peut être soumis à deux ou plusieurs séries de propriété intellectuelle pour générer suffisamment d&#39;ARN applicable pour l&#39;analyse en aval. </li></ol> 7. ARN transcription inverse et amplification de l&#39;ADNc par PCR <ol><li> Soumettre l&#39;ARN isolé à une transcription inverse par une amorce aléatoire avec une inversion de haute qualité transcriptase (RT), selon la Manufales instructions cturer. </li><li> Pour amplifier l&#39;ARN d&#39;intérêt, de concevoir une amorce anti-sens spécifique du gène dans la séquence de clivage par la RNase H. Utiliser des quantités similaires de l&#39;oligonucléotide anti - sens, une amorce aléatoire ou une amorce oligo-dT (voir le tableau Materials). REMARQUE: L&#39;amorce oligo-dT et de l&#39;ARNm polyadénylé de fournir des réactions témoins positifs pour les réactions de RT-PCR. </li><li> Reserve 5% de la réaction RT (1 pi) pour une qPCR préparative fait en tandem avec contrôle négatif lysat IP et des échantillons d&#39;ADN positifs de contrôle pour définir la fréquence de coupure et de produire une courbe standard. Si la valeur CT de l&#39;qPCR préparative est hors de portée de la courbe standard, diluer la réaction RT à 1 consécutifs: 5 dilutions et répétez l&#39;étape 7.2. NOTE: Pour un séquençage de l&#39;ARN et la technique de spectrométrie de masse, s&#39;il vous plaît voir le fichier de méthode supplémentaire. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici t</a>o voir ce fichier Méthode supplémentaire. (Faites un clic droit pour télécharger.) </li></ol>

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<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li>
<li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;isolement de RNP et de la stratégie d&#39;identification de l&#39;ARN apparenté décrit ici est un moyen sélectif d&#39;enquêter sur une interaction spécifique ARN-protéine et de la découverte des protéines candidats co-régulation d&#39;un RNP spécifique dans les cellules. L&#39;avantage d&#39;utiliser oligonucléotide clivage par RNase H d&#39;isoler RNP est la capacité de capturer et analyser plus précisément l&#39;élément d&#39;ARN agissant en cis sur la RNP RNP hétérogènes en aval li...

l&#39;expression génique post-transcriptionnelle est régulée avec précision, en commençant par transcription de l&#39;ADN dans le noyau. Contrôlée par des protéines de liaison d&#39; ARN (RBP), l&#39; ARNm de la biogenèse et le métabolisme se produisent dans les particules de ribonucléoprotéine hautement dynamiques (RNP), qui se dissocient et associé à un ARNm de précurseur de substrat au cours de la progression de l&#39; ARN métabolisme 1-3. Les changements dynamiques dans les composants de RNP affectent le sort post-transcriptionnelle d&#39;un ARNm et de fournir l&#39;assurance de la qualité lors du traitement des transcrits primaires, leur trafic nucléaire et de la localisation, leur activité en tant que modèles d&#39;ARNm pour la traduction, et le chiffre d&#39;affaires éventuelle des ARNm matures. De nombreuses protéines sont désignées comme RBP en raison de leurs domaines d&#39;acides aminés conservés, y compris le motif de reconnaissance de l&#39; ARN (RRM), l&#39;ARN double brin domaine de liaison (RBD), et les portions de résidus basiques (par exemple, l&#39; arginine, la lysine et la glycine) 4. RBP sont régulièrementisolé par des stratégies d&#39;immunoprécipitation et sont criblées pour identifier leurs ARNs parentes. Certaines pratiques commerciales restrictives co-régulent pré-ARNm qui sont liées au plan fonctionnel, désignés comme régulons d&#39;ARN 5-8. Ces pratiques commerciales restrictives, leurs ARNm parentes, et parfois non codant l&#39;ARN, forment RNP catalytiques qui varient dans la composition; leur spécificité est due à différentes combinaisons de facteurs associés, ainsi que la séquence temporelle, l&#39; emplacement et la durée de leurs interactions 9. ARN immunoprécipitation (RIP) est une technique puissante pour isoler RNP à partir de cellules et d&#39;identifier les transcriptions associées à l&#39; aide de l&#39; analyse de la séquence 10-13. Passer de la candidate à l&#39; échelle du génome de dépistage est possible par le biais RIP combiné avec une analyse des microréseaux 14 ou séquençage à haut débit (RNA-seq) 15. De même, les protéines de coprécipitation peuvent être identifiées par spectrométrie de masse, si elles sont suffisamment abondantes et séparable de l&#39;anticorps co-précipitation 16,17. Ici, nous examinons la méthode pour isoler les composants de RNP d&#39;un ARN spécifique apparenté à partir de cellules humaines en culture, bien que l&#39;approche peut être modifiée pour lysats solubles dans des cellules végétales, des champignons, des virus et des bactéries. Les analyses en aval du matériau comprennent l&#39; identification des candidats et validation par immunotransfert, spectrométrie de masse, dosage enzymatique biochimique, la RT-PCR quantitative, puces à ADN et RNA-seq, comme le résume la figure 1. Étant donné le rôle fondamental de la RNP dans le contrôle de l&#39; expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, des altérations de l&#39;expression de RBP composants ou leur accessibilité aux Apparenté ARNs peuvent être préjudiciables pour la cellule et sont associés à plusieurs types de troubles, y compris la maladie neurologique 18. DHX9 / ARN hélicase A (RHA) est nécessaire pour la traduction des ARNm sélectionnés d&#39;origines cellulaires et rétroviraux 6. Ces ARN parentes présentent des éléments agissant en cis structurellement apparentés au sein de leur5 &#39;UTR, qui est désigné comme l&#39;élément de contrôle post-transcriptionnel (PCE) 19. Activité RHA-PCE est nécessaire pour la traduction cap-dépendante efficace de nombreux retrovirus, y compris le VIH-1, et des gènes régulateurs de croissance, y compris junD 6,20,21. Encodée par un gène essentiel (de dhx9), ORS est essentielle à la prolifération cellulaire et la régulation vers le bas élimine la viabilité des cellules 22. L&#39;analyse moléculaire de l&#39;ORS-PCE RNP est une étape essentielle pour comprendre pourquoi l&#39;activité RHA-PCE est nécessaire de contrôler la prolifération des cellules. La caractérisation précise des composants de RNP RHA-PCE à l&#39;état stationnaire ou sur la perturbation physiologique de la cellule nécessite l&#39;enrichissement sélectif et la capture des RNP RHA-PCE en abondance suffisante pour l&#39;analyse en aval. Ici, rétroviral PCEgag ARN a été marqué avec 6 copies du site de liaison d&#39;ARN agissant en cis pour la protéine d&#39;enveloppe MS2 (CP) dans le cadre de lecture ouvert. La protéine de capside MS2 a été exogenously co-exprimée avec PCEgag ARN par transfection du plasmide pour faciliter l&#39;assemblage RNP dans les cellules en croissance. RNP contenant la protéine de capside MS2 avec PCEgag ARN MS2 cognât marqués ont été immunoprécipités à partir de l&#39;extrait cellulaire et capturé sur des billes magnétiques (Figure 2a). Pour capturer de manière sélective les composants de RNP liés au PCE, RNP immobilisé a été mis en incubation avec un oligonucléotide complémentaire à des séquences distales de PCE, la formation d&#39;un hybride ARN-ADN qui est le substrat pour l&#39;activité RNase H. Etant donné que le PCE est positionné dans la région 5 &#39;terminale de la région 5&#39; non traduite, l&#39;oligonucléotide est complémentaire des séquences d&#39;ARN adjacentes au site d&#39;initiation de traduction rétroviraux (codon de départ gag). RNase H clivage près du début de gag codon libéré complexe 5 &#39;UTR du RNP immobilisé, qui a été recueilli comme éluant. Ensuite, l&#39;échantillon a été évaluée par RT-PCR pour confirmer la prise de PCEgag et par SDS-PAGE et immunotransfert pour confirmer la capture de la protéine d&#39;enveloppe cible MS2. Une validation de la protéine de liaison d&#39;ARN PCE associée, DHX9 / ARN hélicase A, a ensuite été réalisée.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protéine A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protéine G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-RHA</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS réactif</td><td>Technologie</td> <td>de vie10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy Clean-up</td><td>column Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse Omniscript</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Amorces hexamères aléatoires</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Amorces Oligo-dT</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>amorces PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Amorces spécifiques au gène pour&nbsp ; Amplification par PCR</td></tr><tr><td>Oligonucléotide pour clivage médié par la RNase H</td><td>IDT</td><td></td><td>Amorce antisens pour l’ARN cible</td></tr><tr><td>Trypsine Technologie</td><td>Gibco Life</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture tissulaire DMEM</td><td>Technologie Gibco Life</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Technologie Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Tris Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de nitrocellulose</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Pied magnétique</td><td></td><td></td><td>Porte-tube de micro-centrifugeuse de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Capot</td><td></td><td></td> laminaire <td>Pour la culture de tissus animaux</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td> de CO2 <td>Pour la culture de tissus animaux</td></tr><tr><td>Appareil</td><td></td><td></td> de gel de protéines <td>Séparation d’échantillons de protéines</td></tr><tr><td>Appareil</td><td></td><td></td> de transfert de protéines <td>Transfert d’échantillons de protéines</td></tr><tr><td>Prêt à l’emploi gels protéiques (4-15 %)</td><td></td><td></td><td>Séparation des échantillons de protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td> de table <td>Granule dans l’échantillon</td></tr><tr><td>Rotateur</td><td></td><td></td> de table <td>Mélanger l’échantillon bout à bout</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Mélanger les échantillons</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement des cognate complexes arn-protéine à partir des cellules en utilisant une élution oligonucleotide-directed

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Les particules de ribonucléoprotéines dirigent la biogenèse et la régulation post-transcriptionnelle de tous les ARNm par des combinaisons distinctes de protéines de liaison à l’ARN. Ils sont composés d’éléments d’ARN cis-dépendants de la position et de combinaisons uniques de protéines de liaison à l’ARN. La définition de la composition d’un RNP spécifique est essentielle pour parvenir à une compréhension fondamentale de la régulation des gènes. L’isolement d’un RNP sélectionné s’apparente à la recherche d’une aiguille dans une botte de foin. Ici, nous démontrons une approche pour isoler les RNP associés à la région 5' non traduite d’un ARNm sélectionné dans des cellules asynchrones et transfectées. Il a été démontré que ce RNP apparenté est nécessaire pour la traduction de certains virus et gènes de réponse au stress cellulaire.
Le protocole de co-précipitation ARN-protéine démontré convient à l’analyse en aval des composants protéiques par le biais d’analyses protéomiques, d’immunotransferts ou de tests d’identification biochimique appropriés. Ce protocole expérimental démontre que DHX9/RNA helicase A est enrichi à l’extrémité 5' de l’ARN rétroviral apparenté et fournit des informations préliminaires pour l’identification de son association avec les ARNm associés au stress cellulaire huR et junD.

Résultats RIP antérieurs identifiés ARNs gag rétrovirales et sélectionnés ARN cellulaires qui co-précipité avec DHX9 / RHA, y compris le VIH-1 6, junD 6 et HUR (Fritz et Boris-Lawrie, non publié). Rétroviral 5 'UTR a été démontré que la co-précipité avec DHX9 / ORS dans le noyau et à co-isoler dans le cytoplasme sur polyribosomes. Elle est définie uniquement comme post-transcriptionnelle élément de commande de cis (PCE) 6. À isoler les complexes ...

Ce manuscrit décrit une approche permettant d’isoler certains RNP apparentés formés dans des cellules eucaryotes via un enrichissement spécifique dirigé par des oligonucléotides. Nous démontrons l’applicabilité de cette approche en isolant un RNP apparenté lié à la région rétrovirale 5' non traduite qui est composée de DHX9/ARN hélicase A.

L&#39;isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

L’objectif global de cette technique d’immunoprécipitation d’ARN est d’isoler et de caractériser sélectivement des complexes protéiques d’ARN endogènes formés dans des cellules eucaryotes via un enrichissement spécifique dirigé vers les oligonucléotides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du contrôle post-transcriptionnel, telles que la composition des protéines de liaison à l’ARN qui définissent les cinq premiers UTR d’un transcrit rétroviral pour réguler son expression génique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à un chercheur d’isoler et de caractériser sélectivement un complexe protéique d’ARN spécifique d’intérêt tout en conservant la possibilité de mener une analyse plus globale de la RNP en aval.Eh bien, les implications de cette technique s’étendent à la compréhension fondamentale des infections virales et de nombreuses maladies cellulaires. Et fournit des informations significatives sur les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel de l’expression des gènes. Cela pourrait signifier de nouvelles cibles médicamenteuses viables.Après la culture de cellules et l’immunoprécipitation d’une protéine marquée FLAG conformément au protocole de texte, transférez 60 microlitres par IP de boue de billes magnétiques pro-TG dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre. Placez le tube sur une grille magnétique et retirez la solution de stockage en le pipetant soigneusement. Retirez ensuite le tube du support.Ajouter 600 microlitres de 1x tampon de lavage. Et placez le tube sur un rotateur d’extrémité à bout à température ambiante pendant trois minutes, pour laver et équilibrer les billes. Placez le tube sur la grille magnétique et retirez le tampon de lavage.Ajoutez ensuite 10 volumes de 1x tampon de lavage frais. Ajoutez l’anticorps immunoprécipitant FLAG aux billes magnétiques pro-TG équilibrées. Ensuite, faites pivoter le tube à température ambiante pendant au moins 30 minutes, pour conjuguer l’anticorps immunoprécipitant.Placez le tube sur l’aimant et retirez le surnageant. Retirez ensuite le tube de l’aimant et ajoutez 1x tampon de lavage aux perles et tournez à température ambiante pendant trois minutes. Répétez l’étape de lavage deux fois et retirez le tampon final.Retirez le milieu de culture des cellules par aspiration et utilisez 1,5 millilitre de PBS glacé pour laver les cellules deux fois. À l’aide d’un grattoir à cellules, délogez les cellules humides et adhérentes. Pipetez la suspension cellulaire dans des tubes frais, puis centrifugez la culture à 226 fois G à quatre degrés Celsius, pendant quatre minutes.Ajoutez 375 microlitres de tampon glacé à faible teneur en sel à la pastille cellulaire et incubez l’échantillon sur de la glace pendant cinq minutes pour permettre le gonflement. Il est important de faire attention lors de l’ajout et de la remise en suspension de la pastille cellulaire dans le tampon de lyse à faible teneur en sel, afin d’assurer une immersion et un gonflement complets sans perturbation mécanique prématurée. Pour recueillir le lysat de cellules cytoplasmiques, ajoutez 125 microlitres de tampon de lyse glacé, puis utilisez un homogénéisateur Dounce pré-réfrigéré pour effectuer dix passages.Homogénéiser avec suffisamment de force pour permettre la lyse de la membrane plasmique et les contaminants du lysat cytoplasmique libéré. Mais veillez à ne pas trop étendre la perturbation mécanique et à risquer des contaminations nucléaires, une perturbation du complexe ARN-protéine ou une perte de Spin libéré de l’homogénat dans un microfuge à grande vitesse pendant une minute. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de 1,7 millilitre qui a été sur de la glace.Déterminez la concentration totale en protéines. Réserver 10 % pour l’analyse par transfert Western, à utiliser comme contrôle d’entrée. Pour effectuer une immunoprécipitation, ajoutez le volume souhaité de lysat cellulaire récolté aux billes conjuguées d’anticorps cibles.À l’aide de 1x tampon de lavage, portez le volume total à 600 microlitres et faites pivoter l’échantillon à température ambiante. Après 90 minutes d’incubation, placez le tube IP sur le support magnétique pour recueillir les billes. Ensuite, récupérez le surnageant et réservez-le sous forme d’écoulement.Ensuite, ajoutez 10 volumes de tampon de lavage NETN 150 glacé à la RNP liée, billes conjuguées d’anticorps, et faites pivoter l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes. Après avoir remis en suspension les complexes RNP immobilisés dans 1x tampon de liaison selon le protocole de texte, ajustez le volume restant dans 100 microlitres de 1x tampon de liaison glacé. Et chauffez le tube à 70 degrés Celsius pendant trois minutes.Pour isoler des complexes protéiques d’ARN apparentés, ajoutez un oligo d’ADN nucléotidique d’environ 30 nucléotides, complémentaire à la limite des trois séquences premières de l’ARN d’intérêt. Et incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec un léger balancement. Ajoutez cinq à dix unités de RNase H dans le tube et incubez l’échantillon à température ambiante pendant une heure pour cliver l’ARN de l’hybride d’ARN ADN.Transférez ensuite le surnageant contenant les complexes RNP d’intérêt capturés dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,7 millilitre. Pour collecter l’ARN immunoprécipité, remettre en suspension la moitié de l’échantillon total de complexes d’ARN capturés dans 750 microlitres de réactif de thiocyanate de guanidinium acide. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme dans le tube, agitez vigoureusement pendant 10 secondes et incubez à température ambiante pendant trois minutes.Après la centrifugation, récupérez la phase aqueuse dans un tube frais et ajoutez un volume égal d’isopropanol. Mélangez bien et incubez l’échantillon à température ambiante pendant au moins dix minutes. Ajoutez un microlitre de bleu de glycol à l’échantillon et stockez-le à moins 20 degrés Celsius pour une précipitation ou un traitement efficace à une date ultérieure.Centrifugez le tube à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant dix minutes. À l’aide d’une micropipette P200, on recueille et jette soigneusement le surnageant afin de ne pas perturber la pastille d’ARN. Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 75 % dans chaque tube.Vortex et centrifugez les tubes pendant cinq minutes. Récupérez soigneusement et jetez le surnageant comme il vient d’être démontré. Faites sécher le granulé à l’air libre pendant deux à trois minutes et utilisez 100 microlitres d’eau libre de RNase pour le remettre en suspension.Appliquez 100 microlitres de l’échantillon d’ARN dans une colonne de nettoyage d’ARN. Et traitez-le selon le protocole du fabricant. Enfin, éluez l’ARN dans 30 microlitres d’eau libre de RNase et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à trois mois.Pour isoler des éléments de contrôle post-transcriptionnels, ou des complexes ribonucléoprotéiques PCE, GAG, ARN, RHA formés dans des cellules en prolifération. L’immunoprécipitation de FLAG-MS2 RNP a été réalisée dans des lysats de cellules HECK293 transfectés. Les résultats montrent une précipitation efficace de la protéine FLAG-MS2.Comme DHX9/RHA se trouve dans le complexe RNP et non dans le contrôle isotopique IgG, ni dans le contrôle négatif. On voit ici des transferts Western de complexes d’ADN ARN digérés par la RNase H. La RNase H a clivé l’ARN gag PCE, libérant le complexe RNP spécifiquement lié aux cinq premiers UTR.Les RNP associés à DHX9/RHA ont été enrichis dans les éluants. Il est important de noter que les RNP liées à FLAG-MS2 sont restées avec les billes conjuguées de l’anticorps. Dans cette expérience, l’immunoprécipitation HO de la boucle souche MS2, contenant l’ARN gag PCE rétroviral dans les cellules et dans les éluants, a été validée par RT-PCR et QRT-PCR.Les résultats ont confirmé une association sélective entre DHX9/RHA et le RTU rétroviral à cinq primes, qui a été mis en évidence comme un RNP unique, important pour le contrôle ciblé de la traduction. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures, si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer toutes les étapes efficacement et avec soin, afin d’assurer le maintien des complexes RNP intacts et l’isolement du complexe RNP spécifique d’intérêt.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectrométrie de masse et le RNA-Seq, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l’association globale des protéines avec l’ARN cible. Et l’analyse régionale ou complète de tous les transcrits engagés dans un RNP particulier. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du contrôle génique post-transcriptionnel pour explorer les complexes protéiques ARN distincts régissant l’expiration des gènes viraux pathogènes et le mécanisme général du contrôle de l’expression génique cellulaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récolter des complexes RNP cellulaires intacts et de déterminer leur composition à l’aide d’un enrichissement sélectif dirigé par oligonucléotides. N’oubliez pas non plus que travailler avec des virus pathogènes et des échantillons biologiques et des produits chimiques dangereux comme l’acide ou le phénol peut être extrêmement dangereux. Toutes les précautions, telles qu’un équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

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Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

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RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

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L'isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

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