Le tri de flux et le séquençage Exome des cellules de Reed-Sternberg du lymphome de Hodgkin classique

L’objectif global de cette procédure est de séparer et de concentrer les cellules de Hodgkin, de Reed-Sternberg ou HRS viables des tumeurs lymphoïdes de Hodgkin classiques inflammatoires ou CHL pour la génération et l’analyse de données de séquençage de nouvelle génération de l’exome entier de haute qualité. Cette méthode peut répondre à des questions clés en biologie CHR, notamment l’identification des mutations clés du moteur, des mutations d’échappement immunitaire, ainsi que l’examen de la diversité génique au sein de la classification. Cette technique produit de l’ADN dérivé de la tumeur qui est de très haute qualité et pureté.

Faciliter la génération de banques de séquençage de nouvelle génération sans avoir besoin d’une étape de préamplification. Cette technique peut avoir des implications importantes pour le diagnostic du lymphome hodgkinien, car elle peut aider à une sous-classification et à un pronostic. Cela peut également influencer le choix du traitement, car certaines altérations peuvent indiquer une sensibilité ou une résistance à des médicaments spécifiques.

Jonathan From a d’abord eu cette idée lorsqu’il a découvert comment visualiser les cellules HRS par cytométrie en flux et effectuer les premières expériences de tri avec ces cellules. Avant de préparer les cellules, mélangez les anticorps pré-titrés dans un flacon en verre foncé. Ensuite, ajoutez du PBS et du BSA pour porter le cocktail d’anticorps à un volume de 100 microlitres.

Et transférez le flacon d’azote liquide dans un seau à glace ou de la glace sèche. Ensuite, décongelez rapidement les cellules d’intérêt dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Lorsqu’il ne reste qu’une petite portion congelée, versez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres contenant 45 millilitres de milieu de décongélation à 37 degrés Celsius, et rincez le flacon cryogénique deux fois avec un millilitre de milieu de décongélation frais.

Après avoir accumulé les deux rinçages, laissez les cellules digérer à température ambiante pendant 15 minutes. Lorsque les cellules se sont rééquilibrées, récupérez-les par centrifugation. Aspirez tous les surnageants, sauf les 200 derniers microlitres.

Suspendez à nouveau les cellules dans le milieu de décongélation restant et laissez reposer les cellules pendant encore deux à trois minutes. Ensuite, incubez les cellules dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps pendant 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans trois millilitres de milieu de tri, en remettant le granulé en suspension dans un millilitre de milieu de tri frais.

Ensuite, filtrez les cellules à travers une crépine supérieure à tube d’écoulement de cinq millilitres. Rincez le tube et la passoire avec un millilitre supplémentaire de milieu de tri et maintenez les cellules sur de la glace. Avant de commencer le tri des cellules, dans le logiciel de cytomètre en flux, dans le menu des expériences, sélectionnez nouvelle expérience et ouvrez la fenêtre d’état de l’instrument.

Dans l’onglet Paramètres, supprimez tous les paramètres inutilisés. Ensuite, rouvrez l’onglet Expérience et sélectionnez la configuration de compensation pour créer les commandes de compensation. Dans la fenêtre du navigateur, cliquez sur le signe plus pour développer l’échantillon de contrôle de compensation et exécutez les tubes de contrôle de compensation sans enregistrer les données.

Ajustez les tensions du détecteur si nécessaire de sorte que les populations de billes colorées positivement pour chaque chrome de la flore soient comprises entre 10 000 et 100 000 canaux. Et des plus brillants dans leur canal de détection principal. Enregistrez les tensions nécessaires pour chaque paramètre pour chaque tube.

Ensuite, sous l’échantillon de contrôle de compensation, cliquez un clic gauche simple pour mettre en surbrillance le tube de contrôle non coloré et chargez le tube de contrôle non coloré sur l’étage d’échantillon. Dans la fenêtre de contrôle d’acquisition, cliquez sur charger et exécutez les commandes de compensation individuelles dans les champs de tension du détecteur pour tous les paramètres afin de saisir manuellement les tensions déterminées. Cliquez sur enregistrer pour obtenir les données de contrôle non tachées.

Exécutez ensuite toutes les commandes de compensation restantes, en enregistrant les données sans modifier les paramètres du détecteur. Lorsque tous les contrôles ont été analysés, faites fonctionner un tube d’eau déminéralisée stérile pendant cinq minutes pour débarrasser l’instrument de toute matière résiduelle avant de continuer. Pour bloquer les cellules pour le tri HRS, chargez le tube expérimental et enregistrez au moins 100 000 événements tout en ajustant le débit pour acquérir 3 000 à 4 000 événements par seconde.

Assurez-vous d’enregistrer suffisamment d’événements pour visualiser une population qui peut être aussi faible qu’une cellule sur 1 000. Pour identifier les témoins somatiques des lymphocytes B et T, il faut rechercher les cellules CD20 et CD5 positives respectivement. Lorsque toutes les vannes ont été réglées, triez les cellules dans des tubes coniques pré-refroidis de 15 millilitres contenant sept à huit millilitres de milieu de collecte.

À la fin du tri, transférez les populations cellulaires isolées dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Et granulez les cellules par centrifugation. Ensuite, lavez les cellules dans un millilitre de PBS frais et retirez les surnageants de chaque tube, en prenant soin de ne pas déranger les minuscules granulés.

Après l’amplification de la bibliothèque et le nettoyage des billes du point 8X, une distribution lumineuse normale de la taille des fragments dans la plage souhaitée doit être observée. Les banques qui présentent des écarts par rapport à cette forme indiquent la présence d’un artefact de poids moléculaire élevé ou faible et, idéalement, ne doivent pas être séquencées. Par exemple, un dimère d’adaptateur peut parfois être reporté lors du premier nettoyage de perle X pointue, apparaissant comme un pic net centré autour de 125 à 130 paires de bases.

Dans ce cas, un nettoyage supplémentaire du cordon X pointu doit être effectué, suivi d’une visualisation répétée de la distribution granulométrique pour assurer l’élimination réussie du dimère. Après le séquençage multiplexé de quatre échantillons par voie, une profondeur de couverture médiane de 50 à 100 X sur la cible est réalisable. Bien que les tracés du nombre de copies générés à partir d’une bibliothèque d’un nanogramme puissent entraîner des gains et des pertes de nombre de copies parasites.

Environ 70 % des cas de lymphome hodgkinien classique sont porteurs de mutations B2M et 820, et/ou de délétions qui semblent être clonales, et qui peuvent être utilisées pour estimer le contenu relatif de la tumeur. Si les lymphocytes T sont utilisés comme témoins somatiques, le séquençage HRS montrera des gains significatifs de nombre de copies dans les positions correspondant aux positions alpha, delta et bêta du récepteur des lymphocytes T. Ainsi que des pertes significatives dans les positions lourdes et kappa des chaînes légères du récepteur des lymphocytes B avec une charge mutationnelle globale de 100 à 400 mutations somatiques par cas d’exome.

Une fois maîtrisée, cette technique, y compris le tri cellulaire et la construction de la bibliothèque de séquençage, peut être réalisée en trois à quatre jours si elle est effectuée correctement. À la suite de cette procédure, nous pouvons effectuer des études prospectives plus importantes et d’autres méthodes, comme l’épigénétique, la protéomique et la métabalomique, afin d’acquérir plus de connaissances sur le lymphome hodgkinien et de progresser vers des thérapies personnalisées plus spécifiques. Après son développement, la méthode nous a permis d’étudier des cellules HRS de haute pureté en nombre relativement important.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules HRS et de lancer leur analyse génomique.