Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

L’objectif global de cette expérience est d’effectuer un génotypage rapide et précis des poissons-globes toxiques en analysant de petits amplicons PCR. La partie comestible du poisson-globe qui est utilisée pour préparer le plat de poisson-globe varie selon son espèce et certaines espèces contiennent des toxines dans tout le corps. Ce muscle, la base de données et le masu, les nageoires et la peau de naissance du poisson-globe peut aider au génotypage du poisson-globe du point de vue de la sécurité alimentaire totale pour tous et pour l’enquête.

Pour effectuer l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit, placez d’abord 30 à 50 milligrammes de tissu de poisson dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ou 1,5 millilitre. Écrasez le tissu sans nageoire ni peau, à l’aide d’une microspatule. Ajoutez brièvement 180 microlitres de tampon de lyse des tissus animaux et 40 microlitres de protéinase k et de vortex.

Incuber à 56 degrés Celsius sur un chauffe-moteur pendant deux heures ou toute la nuit. Centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 13000xg. Après avoir transféré le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, ajoutez 200 microlitres du tampon chaotrope contenant du chlorhydrate de guanidine du kit.

Ajoutez ensuite 200 microlitres d’éthanol à 99,5 % et mélangez par vortex. Transférez le mélange, y compris tout précipité, dans la colonne d’essorage placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Après une centrifugation d’une minute à 13000xg, jeter le flux.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage, contenant du chlorhydrate de guanidine du kit, et centrifugez comme précédemment. Jetez le flux et le tube de collecte. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres fourni avec le kit.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage deux et centrifugez pendant trois minutes à 20 000xg. Après avoir jeté le tube d’écoulement et le tube de collecte, transférez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Pipette 200 microlitres du tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne de spin.

Après une minute, centrifugez pendant une minute à 6000xg. Ensuite, pipetez 50 microlitres de l’aluette dans une cuvette ultraviolette jetable. Mesurer le spectre ultraviolet de l’aluette à 220 à 300 nanomètres et l’absorbance à 260 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre.

L’utilisation d’un réactif sans détergent est essentielle pour le succès de la chromatographie liquide, car le réactif peut effectivement endommager la colonne d’analyse. En travaillant sur un banc propre pour éviter la contamination, mettez en place une PCR de 25 microlitres pour chaque échantillon d’ADN extrait, un contrôle positif et un contrôle négatif, sur glace comme décrit dans le protocole textuel. Pour faciliter l’utilisation, préparez une quantité suffisante de cocktail contenant tous les réactifs sans ADN matriciel et distribuez-le.

Utilisez de l’ADN polymérase ayant une activité de relecture pour éviter l’ajout de trois surplombs d’adénine au produit PCR. Effectuer une amplification PCR sur un thermocycleur à l’aide du programme de cycle indiqué dans le protocole texte. Pour effectuer la digestion enzymatique, ajoutez deux microlitres du tampon de digestion enzymatique à la solution PCR.

Ajoutez un microlitre de chaque enzyme de restriction et mélangez doucement. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans le thermocycleur, puis cinq minutes à 72 degrés Celsius. Filtrez la solution réactionnelle à l’aide d’un dispositif de filtration centrifuge de 0,2 à 0,5 micron pour éviter le colmatage et éviter d’endommager la colonne d’analyse.

Transférez le filtrat dans un flacon conique en polypropylène et conservez-le à 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Préparez une solution d’hexafluoroisopropanol et de triéthylamine dans une bouteille d’un litre comme décrit dans le protocole de texte. Connectez la bouteille à la ligne A de l’instrument de chromatographie liquide, en refroidissant la bouteille à l’aide d’un réfrigérateur portable à refroidissement direct pour éviter la vaporisation.

Connectez une autre bouteille remplie de méthanol à la ligne B.Connectez la colonne de garde et la colonne analytique à l’instrument. Lancez la phase mobile initiale pour équilibrer les colonnes. Si vous utilisez un spectromètre de masse sans logiciel pour contrôler la pression du C-Trap, vous devez réduire la pression du C-Trap en contrôlant manuellement la barre.

Pour ce faire, tirez sur le bouton pour déverrouiller et tournez très lentement le bouton dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour réduire la pression de vide élevée à 1/3. La pression indiquée doit changer progressivement de manière différée. Ignorez le message d’avertissement concernant la basse pression.

Appuyez sur le bouton pour verrouiller. Après la configuration de l’étalonnage, comme décrit dans le protocole texte, rapprochez la sonde d’ionisation par électronébulisation chauffée de l’interface du spectromètre de masse à la position B.Connectez-vous à la sonde et à une seringue avec un tube. Perfusez le calibrateur en permanence à un débit de 10 microlitres par minute à l’aide de la pompe à seringue intégrée.

Cochez uniquement les six ions de masse inférieure dans le tableau d’étalonnage personnalisé. Procédez à l’étalonnage une fois l’intensité des signaux stabilisée. Après l’étalonnage, vérifiez uniquement les six ions de masse supérieure et procédez à l’étalonnage.

Évitez d’étalonner en utilisant tous les ions à la fois pour éviter les défaillances. Déplacez la sonde en position D pour un débit de 0,4 millilitre par minute et connectez-la à l’instrument avec un tube métallique inerte. Après avoir configuré les paramètres comme décrit dans le protocole texte, purgez les bulles en tapotant le fond des flacons.

Placez les flacons d’échantillons sur le support d’échantillons et injectez un microlitre d’un échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique pour commencer l’analyse. Ouvrez les fichiers de données brutes à l’aide d’un logiciel de navigation et confirmez que toutes les acquisitions sont terminées avec succès, y compris les contrôles positifs et négatifs. Configurez une méthode comme décrit dans le protocole texte, puis cliquez sur le bouton Exécuter dans l’onglet Exécuter le repère pour démarrer le logiciel de déconvolution.

Une fois le repère terminé, sélectionnez une ligne et cliquez sur ouvrir le résultat dans la légende supérieure pour obtenir les résultats de la déconvolution. Voici un chromatogramme typique du courant ionique total obtenu à partir d’un témoin négatif et d’un échantillon de poisson-globe. Chaque pic représente un duplex d’ADN qui est séparé en fonction de sa longueur.

Dans cet exemple, trois pics de l’échantillon de poisson-globe sont observés. Ces pics sont le résultat de la digestion des amplicons à l’aide de deux endonucléases. Aucun pic n’est observé dans l’échantillon témoin négatif.

Chaque pic représente un spectre de masse qui comprend des ions chargés multiples. L’élargissement du spectre de masse permet de remarquer des dizaines de pics isotopiquement résolus. Cette résolution est une condition préalable à la détermination de la masse monoisotopique et n’est réalisable qu’à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution.

Dans cet exemple, les masses monoisotopiques du troisième pic sont de 16296,7656 et 16468,6616 Daltons. Si l’on considère une tolérance de masse de trois ppm, les valeurs mesurées sont identiques aux valeurs théoriques des roubles takifugu comme indiqué ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée à l’aide d’instruments et d’appareils courants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser de petits amplicons par chromatographie liquide, spectrométrie de masse à haute résolution pour le génotypage. La technique peut être appliquée à l’analyse d’autres polymorphismes de l’ADN à condition que la variation de la séquence soit reflétée dans les petits amplicons à analyser. Cependant, cette technique n’identifie que les compositions de base, la substitution de base au sein d’un même mercure ne peut pas être distinguée.