Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

L'objectif général de cette expérience est de réaliser un génotypage rapide et précis de poissons-globes toxiques en analysant de petits amplicons PCR. La partie comestible du poisson-globe utilisée pour préparer le plat varie selon l'espèce, et certaines espèces contiennent des toxines dans tout le corps. Le muscle, la base, la nageoire et la peau du poisson-globe peuvent contribuer au génotypage du poisson-globe du point de vue de la sécurité alimentaire totale pour tous et pour les investigations.

Pour effectuer une extraction d'ADN à l'aide d'un kit, placez d'abord 30 à 50 milligrammes de tissu de poisson dans un tube microcentrifuge de 0,5 ou 1,5 millilitre. Écrasez le tissu sans nageoire ni peau à l’aide d’une microspatule. Ajoutez 180 microlitres de tampon de lyse pour tissu animal et 40 microlitres de protéinase K, puis vortexez brièvement.

Incuber à 56 degrés Celsius sur un bloc chauffant pendant deux heures ou toute la nuit. Centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à 13000×g. Après avoir transféré le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, ajouter 200 microlitres du tampon chaotrope contenant de la chlorure de guanidinium provenant du kit.

Ensuite, ajouter 200 microlitres d'éthanol à 99,5 % et mélanger par vortexage. Transférer le mélange, y compris tout précipité, dans la colonne de centrifugation placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Après centrifugation pendant une minute à 13000xg, jeter le filtrat.

Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage un, contenant de la guanidine hydrochlorure provenant du kit, et centrifuger comme précédemment. Jeter le flux filtrant et le tube de collecte. Placer la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres fourni avec le kit.

Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage deux et centrifuger pendant trois minutes à 20 000xg. Après avoir éliminé le flux filtrant et le tube de collecte, transférer la colonne de centrifugation vers un nouveau tube centrifuge de 1,5 millilitre. Pipeter 200 microlitres du tampon d'élution au centre de la membrane de la colonne de centrifugation.

Après une minute, centrifuger pendant une minute à 6000xg. Ensuite, prélever 50 microlitres de l’aluette à l’aide d’une pipette et transférer dans une cuvette ultraviolette jetable. Mesurer le spectre ultraviolet de l’aluette entre 220 et 300 nanomètres ainsi que l’absorbance à 260 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre.

L'utilisation d'un réactif sans détergent est essentielle pour la réussite de la chromatographie liquide, car le réactif peut endommager la colonne analytique. Sur un banc propre afin d'éviter toute contamination, préparer une PCR de 25 microlitres pour chaque échantillon d'ADN extrait, ainsi qu'un contrôle positif et un contrôle négatif, sur de la glace comme décrit dans le protocole. Pour faciliter les manipulations, préparer une quantité suffisante de mélange contenant tous les réactifs sauf l'ADN matrice, puis le distribuer.

Utilisez une ADN polymérase possédant une activité de relecture afin d'éviter l'ajout d'extensions d'adénine en position trois prime aux produits de PCR. Réalisez l'amplification par PCR sur un thermocycleur en utilisant le programme de cycles indiqué dans le protocole écrit. Pour effectuer la digestion enzymatique, ajoutez deux microlitres de tampon de digestion enzymatique à la solution de PCR.

Ajouter un microlitre de chaque enzyme de restriction et mélanger délicatement. Incuber l'échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans le thermocycleur, puis pendant cinq minutes à 72 degrés Celsius. Filtrer la solution réactionnelle à l’aide d’un dispositif de filtration centrifuge de 0,2 à 0,5 micron afin de prévenir l’obstruction et d’éviter d’endommager la colonne analytique.

Transférez le filtrat dans un flacon conique en polypropylène et conservez-le à 20 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Préparez une solution d'hexafluoroisopropanol et de triéthylamine dans un flacon d'un litre, comme décrit dans le protocole écrit. Connectez le flacon à la ligne A de l'appareil de chromatographie liquide, en refroidissant le flacon à l'aide d'un réfrigérateur portable direct pour éviter la vaporisation.

Connecter une autre bouteille remplie de méthanol à la ligne B. Connecter la colonne de garde et la colonne analytique à l'appareil. Commencer à faire circuler la phase mobile initiale afin d'équilibrer les colonnes. Si vous utilisez un spectromètre de masse dépourvu d'un logiciel permettant de contrôler la pression du C-Trap, vous devez réduire manuellement la pression du C-Trap en ajustant le barreau de régulation.

Pour ce faire, tirez le bouton pour le déverrouiller, puis tournez-le lentement dans le sens antihoraire afin de réduire la pression de vide élevé à 1/3. La pression indiquée doit évoluer progressivement avec un léger retard. Ignorez le message d'avertissement concernant la basse pression.

Appuyez sur le bouton pour verrouiller. Après avoir effectué les réglages nécessaires à l'étalonnage, comme décrit dans le protocole, approchez la sonde d'ionisation électrospray chauffée de l'interface du spectromètre de masse en la plaçant à la position B. Reliez la sonde à une seringue à l’aide d’un tube. Introduisez le produit d’étalonnage en continu à un débit de 10 microlitres par minute à l’aide de la pompe intégrée pour seringue.

Vérifiez uniquement les six ions de masse inférieure dans le tableau d'étalonnage personnalisé. Poursuivez l'étalonnage une fois que l'intensité des signaux est stabilisée. Après l'étalonnage, vérifiez uniquement les six ions de masse supérieure et poursuivez l'étalonnage.

Éviter l'étalonnage utilisant tous les ions simultanément afin de prévenir les échecs. Déplacer la sonde en position D pour un débit de 0,4 millilitre par minute et la raccorder à l'instrument à l'aide d'un tube en métal inerte. Après avoir configuré les paramètres comme décrit dans le protocole textuel, éliminer les bulles en tapotant le fond des vials.

Placer les flacons d'échantillon sur le porte-échantillons et injecter un microlitre d'échantillon à l'aide du système d'échantillonnage automatique pour commencer l'analyse. Ouvrir les fichiers de données brutes avec un logiciel de navigation et confirmer que toutes les acquisitions sont correctement terminées, y compris les contrôles positifs et négatifs. Configurer une méthode comme décrit dans le protocole textuel, puis cliquer sur le bouton de démarrage dans l'onglet de la file d'exécution pour lancer le logiciel de déconvolution.

Une fois le signal terminé, sélectionnez une ligne et cliquez sur « ouvrir le résultat » dans la légende supérieure pour obtenir les résultats de la déconvolution. Voici un chromatogramme courant ionique total typique obtenu à partir d'un témoin négatif et d'un échantillon de poisson-globe. Chaque pic représente un duplex d'ADN qui est séparé en fonction de sa longueur.

Dans cet exemple, trois pics provenant de l'échantillon de poisson-globe sont observés. Ces pics résultent de la digestion de l'amplicon à l'aide de deux endonucléases. Aucun pic n'est observé dans l'échantillon témoin négatif.

Chaque pic représente un spectre de masse composé d'ions porteurs de multiples charges. En agrandissant le spectre de masse, des dizaines de pics résolus isotopiquement deviennent visibles. Cette résolution est une condition nécessaire à la détermination de la masse monoisotopique et ne peut être obtenue que grâce à un spectromètre de masse à haute résolution.

Dans cet exemple, les masses monoisotopiques du troisième pic sont de 16296,7656 et 16468,6616 daltons. Compte tenu d'une tolérance de masse de trois ppm, les valeurs mesurées sont identiques aux valeurs théoriques de Takifugu rubripes, comme indiqué ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée à l'aide d'instruments et d'appareils courants.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser des petits amplicons par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution pour le génotypage. Cette technique peut être appliquée à l'analyse d'autres polymorphismes de l'ADN, à condition que la variation de séquence se reflète dans les petits amplicons à analyser. Toutefois, cette technique permet uniquement d'identifier les compositions en bases ; les substitutions de bases au sein du même mercure ne peuvent pas être distinguées.