Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

L’objectif global de cette procédure est de détecter les récepteurs de facteur de croissance de faible abondance dans les embryons de poisson-zèbre en combinant la sélectivité et la sensibilité du marquage d’affinité du récepteur choisi par son ligand radioactif. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines de la biologie du développement, tels que les niveaux d’expression des récepteurs et leurs propriétés biochimiques. Cette méthode, que nous avons surnommée AFLIP, étend une puissante qualité descriptive de marquage d’affinité, une technique de biologie cellulaire bien établie, aux études de développement du poisson-zèbre.

Pour commencer cette procédure, collectez 100 à 200 embryons pour chaque condition et placez-les dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau de poisson. Ensuite, déchiffonnez manuellement les embryons à l’aide d’une pince à pointe fine et évitez d’utiliser la pronase ou toute autre protéase tout au long du protocole car elle pourrait digérer les récepteurs ciblés. Ensuite, placez les embryons dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et lavez-les deux fois avec 1X PBS.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de déjauneur. Libérez la majeure partie du jaune en pipetant doucement les embryons dans la solution de haut en bas environ 30 à 40 fois. Pour les embryons de 72 HPF et 48 HPF, utilisez respectivement des pointes de pipette bleues et jaunes.

Il peut être nécessaire de couper légèrement les pointes jaunes pour éviter de détruire les embryons. Une libération réussie du vitellus peut être vérifiée en observant les embryons au microscope. L’élimination du vitellus doit être aussi complète que possible, car les lipides et les protéines du vitellus peuvent interférer avec les étapes ultérieures de liaison des ligands ou des anticorps.

Après cela, collectez les embryons par centrifugation à 600 x g pendant 15 secondes. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez les embryons deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage en les faisant doucement tourbillonner à la vitesse la plus basse.

Récupérez ensuite les embryons par centrifugation à 600 x g pendant 15 secondes. À partir de là, continuez la procédure à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.

Ensuite, nous suspendons les embryons dans 350 microlitres de tampon de lyse et les homogénéisons à l’aide d’un pilon en plastique. Ensuite, incubez les embryons lysés pendant 30 minutes en les agitant sur une bascule en éprouvette à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les embryons lysés à 11 000 x g pendant 15 minutes afin d’éliminer les débris insolubles.

Ensuite, transférez le surnageant éliminé dans un tube frais. Déterminez la protéine totale à l’aide du test de protéines de Bradford et de la courbe d’étalonnage du tracé. Dans cette étape, placez 400 à 500 microgrammes de protéines embryonnaires totales dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre et diluez-le à un microgramme par microlitre avec le tampon 1.

Ensuite, ajoutez du stock de TGF-bêta II marqué à l’iode 125 pour atteindre une concentration finale de 150 picomolaires et incubez avec agitation sur une bascule en éprouvette pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après cela, ajoutez des anticorps non dilués contre le récepteur d’intérêt afin d’obtenir une dilution de 1:100. Continuez ensuite l’incubation à quatre degrés Celsius pendant encore deux heures ou toute la nuit.

Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de billes de liaison d’immunoglobulines appropriées et incubez pendant 50 minutes en agitant sur une bascule en éprouvette à quatre degrés Celsius. Récupérez ensuite les billes par microcentrifugation à 11 000 x g pendant 20 secondes et jetez le surnageant dans une poubelle radioactive appropriée. Par la suite, lavez les billes IP trois fois avec un millilitre de tampon de lavage IP par vortex à la microcentrifugation à 11 000 x g pendant 20 secondes à chaque fois.

Ensuite, mettez les billes IP en suspension dans 250 microlitres de tampon de lavage IP. Préparez une solution fraîche de DSS et ajoutez-en 1,5 microlitre à l’échantillon. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius en agitant.

Afin d’éteindre la réaction de réticulation, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage IP complété par suffisamment de chlorure de rendez-vous à pH 7,4 pour atteindre 25 millimolaires de chlorure de rendez-vous. Ensuite, centrifugez à 11, 00 x g pendant 20 secondes pour collecter les billes IP. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension les billes IP dans 30 microlitres de tampon réducteur.

Ensuite, faites bouillir l’échantillon à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes avant l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis analysez les gels séchés dans un phosphorimètre ou par autoradiographie conventionnelle. Cette figure montre les résultats représentatifs obtenus avec l’AFLIP. Les protéines totales extraites des embryons à 72 hpf et 48 hpf ont été soumises à un marquage d’affinité Iode-125 TGF-bêta II suivi d’une IP avec un BG anti-poisson-zèbre de lapin ou un BG anti-rat de lapin comme témoin.

Dans l’autoradiographie, la BG peut être détectée sans GAG ou sous la forme d’une BG modifiée par des glycosaminoglycanes. Cette figure montre comment AFLIP peut être utilisé pour évaluer les niveaux d’expression d’un récepteur donné dans des embryons soumis à une manipulation expérimentale, dans ce cas, la diminution du bêtaglycane à l’injection de morpholino. La première voie montre le niveau du récepteur bêta III du TGF dans un embryon de type sauvage de 72 hpf, tandis que la deuxième voie montre l’effet de l’administration de sept nanogrammes d’un morpholino dirigé vers la limite de l’exon 2-intron 2 du transcrit primaire ZFPG. A noter que la régulation descendante de la BG obtenue avec ce morpholino n’est pas reproduite par son contrôle inadapté.

Ces résultats ont confirmé que le phénotype obtenu avec ce morpholino était spécifique à l’inactivation du récepteur bêta III du TGF comme décrit précédemment. Le succès d’AFLIP dans la détection d’un facteur de croissance ou de récepteurs de cytokines dépend de la disponibilité d’un ligand radiomarqué qui peut être lié et réticulé à son récepteur. Un bon anticorps pour l’immunoprécipitation est également nécessaire.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. Comme AFLIP évite l’étape de transfert du western blot, il permet une meilleure détection des récepteurs fortement glycosylés. Et nous avons vu ici pour le protéoglycane bêtaglycane qui se transfère très inefficacement dans le western blot Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la digestion enzymatique peuvent être effectuées afin de décrire une modification post-traductionnelle supplémentaire tant qu’elles sont révélées par des techniques électrophorétiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont AFLIP peut vous aider à détecter des récepteurs peu abondants dans plusieurs embryons de poissons par marquage d’affinité lié à l’immunoprécipitation. Enfin, n’oubliez pas que le travail avec l’iode-125 doit être effectué avec soin et une protection adéquate. Bonne chance dans vos expériences.