Name: Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez la technique AFLIP pour détecter les récepteurs de facteurs de croissance peu abondants dans les embryons de zebrafish. Cette méthode combine le marquage d'affinité et l'immunoprécipitation pour améliorer la sensibilité.

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Les auteurs remercient Gilberto Morales pour les soins et l’entretien des poissons, ainsi que les Drs Claudia Rivera et Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) pour leur aide dans la vaccination des lapins. Ce travail a été soutenu par des subventions du CONACYT 131226 et du PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Toutes les expériences réalisées chez l&#39;animal ont été approuvés par le Comité de laboratoire soin et l&#39;utilisation de l&#39;Université nationale autonome du Mexique (UNAM) des animaux, sous le numéro CICUAL-Protocole: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México&quot;). 1. Préparation de l&#39;extrait Embryo Protein <ol><li> Recueillir 100 - 200 embryons pour chaque condition de comparer (morphants vs type sauvage) au stade désiré, par exemple 72 heures après la fécondation (HPF). </li><li> La place des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l&#39; eau de poissons (voir tableau 1) et dechorionate manuellement des embryons en utilisant une pince à pointe fine. Éviter d&#39;utiliser pronase pendant cette étape (ou toute autre protéase tout au long du protocole), tel qu&#39;il peut digérer le récepteur ciblé. </li><li> La place des embryons dans un tube de 1,5 ml et laver les embryons twla glace avec une solution tampon de phosphate de 1x (PBS) (voir tableau 1). </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de deyolk (voir le tableau 1). </li><li> Relâchez la plupart de jaune par pipetage de haut en bas (environ 30 - 40 fois) les embryons dans la solution. Pour 72 HPF et 48 embryons HPF utiliser des embouts de pipette bleu et jaune, respectivement. peuvent devoir être légèrement coupé pour éviter la destruction d&#39;embryons pointes jaunes. La libération de jaune réussie peut être vérifiée par l&#39;observation des embryons au microscope. </li><li> Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec. </li><li> Rejeter le surnageant avec précaution à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Embryons laver deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (voir le tableau 1) faisant tourbillonner doucement à la vitesse la plus basse. </li><li> Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec. </li><li> A partir de là, poursuivre la procédure à 4 ° C. </li><li> Rejeter le surnageant avec précaution à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Resuspendre les embryons dans 350 pi de tampon de lyse (voir le tableau 1) et homogénéiser à l&#39; aide d&#39; un pilon en plastique. </li><li> Incuber embryons lysées 30 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C. </li><li> Centrifugeuse lysée embryons à 11.000 xg pendant 15 min pour éliminer les débris insolubles. </li><li> Transfert autorisé surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette dans un tube frais. </li><li> Déterminer la protéine totale par Bradford protéine test 4, ou toute autre procédure appropriée. Si dosage de Bradford est utilisé, effectuer la courbe d&#39;étalonnage en présence de concentrations équivalentes des détergents présents dans le tampon de lyse, car ils provoquent une sous - estimation de la protéine standard 4. </li></ol> 2. Détection de Endogène Receptor Protein <ol><li> Affinity Étiquetage et Immunoprécipitation (toutes ces étapes à 4 o C) <ol><li> Placez 400 - 500 ug de protéine embryonnaire totale dans un tube de 1,5 ml et diluer à 1 ug / ul avec un tampon 1 (voir le tableau 1). Remarque: Pour obtenir 500 ug de protéine d&#39;embryon total, environ 100 - 200 embryons doivent être d&#39;abord traitées. 72 HPF embryons produisent couramment ~ 5 pg de protéine totale d&#39;embryons, ce qui est suffisant pour la détection bêtaglycan. </li><li> Ajouter un volume suffisant de marqué TGF-β2 stocks pour atteindre une concentration finale de 150 pM et incuber avec agitation sur un tube à essai culbuteur 2 h à 4 ° C. Le TGF-β2 doit être marqué avant aflip est démarré, avec 125I par la méthode à la chloramine T comme décrit par Cheifetz et al. , 5. ATTENTION: L&#39; utilisation de blindage pour minimiser l&#39; exposition lors de la manipulation 125 I ligand marqué. </li><li> Ajouter un volume suffisant d&#39;anticorps non dilué contre le récepteur d&#39;intérêt afin de parvenir à une dilution de 1: 100 et continuer l&#39;incubation pendant 2 heures à 4 ° C (incubation peut être O / N). Ceci est la dilution optimale de l&#39; antisérum # 31, utilisé dans cette étude et décrit par ailleurs 3, mais en fonction de la qualité de l&#39;tibody, une dilution plus ou moins grande peut être optimal. </li><li> Ajouter 50 ul de billes de liaison d&#39;immunoglobuline appropriée (par exemple, la protéine G-Sepharose, qui a été préalablement équilibrée en TNTE et remis en suspension 1: 5 de son volume initial en TNTE) et incuber pendant 50 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C. </li><li> Récupérer les billes par microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 sec. </li><li> Rejeter le surnageant dans une poubelle radioactive appropriée. </li><li> Laver les IP-billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage IP (voir le tableau 1), par tourbillonnement et microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 secondes à chaque fois. </li><li> Resuspendre IP-billes dans 250 pi de tampon de lavage IP. </li><li> Ajouter 1,5 ul de subérate de disuccinimidyle (DSS, dissous dans du DMSO à 10 mg / ml). Préparer la solution DSS juste avant son utilisation dans cette étape. </li><li> Incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation. </li><li> Pour arrêter la réaction de réticulation, ajouter 500 pi otampon de lavage f IP, complété avec suffisamment de Tris-Cl pH 7,4 actions pour atteindre 25 mM Tris-Cl. Les groupes amino libres dans Tris capturer DSS n&#39;a pas réagi. </li><li> Centrifugeuse à 11.000 xg pendant 20 secondes pour recueillir IP perles et éliminer le surnageant. </li><li> Resuspendre IP billes dans 30 pl de tampon réducteur de Laemmli. </li><li> échantillons Faire bouillir 5 min à 94 ° C. </li><li> Le cas échéant, analyser les échantillons dans un compteur gamma en utilisant le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Analyse des échantillons <ol><li> échantillons soumis à une dénaturation SDS-PAGE. Utilisez polyacrylamide le pourcentage correspondant à la masse du récepteur et exécuter un gel selon la procédure standard. </li><li> Immergez gel dans la solution de fixation (voir le tableau 1) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver le gel avec de l&#39;eau distillée pendant 15 min. </li><li> Placer le gel dans du papier filtre préalablement hydratée et couvrir avec un film de saran wrap. </li><li> gel sec à 80 ° C pendant 1 heure. </li><li> Exposer gel sur une phosphorimager scre blancfr à TA O / N. </li><li> Numérisation écran exposé en utilisant un phosphorimager en utilisant le protocole du fabricant. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;utilisation de Western blots avec un anticorps spécifique contre une protéine d&#39;intérêt est un outil précieux pour étudier son expression 7 au cours de l&#39; embryogenèse. Cependant, immunotransfert de protéines hautement glycosylées n&#39;a pas eu beaucoup de succès en raison de leur transfert inefficace et faible liaison à nitrocellulose ou PVDF membranes 8,9. Les protéoglycanes sont un bon exemple de cette lacune, en raison de leurs chaînes de glycosaminog...

La détection spécifique des protéines exprimées au cours du développement embryonnaire est nécessaire pour valider les profils d’expression obtenus en mesurant leurs ARNm apparentés par RT-PCR ou hybridation in situ (ISH). Ceci est généralement réalisé par un western blot d’extraits d’embryons suivi d’une détection avec des anticorps spécifiques. Cependant, cette approche est difficile à appliquer aux protéines qui sont en très faible abondance, ou qui ont des propriétés qui entravent leur transfert quantitatif lors de leur transfert. Le bêtaglycane, également connu sous le nom de récepteur du facteur de croissance transformant β de type III (TGF-β) (TGFBR3), est un exemple de ces difficultés. TGFBR3 est un protéoglycane membranaire à temps partiel qui se lie au TGF-β par le biais de sa protéinecentrale 1, avec une affinité nettement plus élevée pour l’isoforme TGF-β2, une propriété qui le distingue de toute autre protéinede liaison du TGF-β 2. Le TGFBR3 chez le poisson zèbre est exprimé à partir de 8 hpf, atteignant un maximum à 72 hpf, tel que détecté par RT-PCR de son ARNm3. 
Cependant, malgré la disponibilité d’un anticorps3 très spécifique, toutes les tentatives de détection de son produit traduit par western blot se sont avérées infructueuses. Estimant que la nature protéoglycane de TGFBR3, ainsi que sa faible abondance présumée, peuvent être responsables de cet échec, une méthode de détection, AFLIP, qui tire parti de la haute affinité de TGFBR3 pour TGF-β2 a été conçue. Dans cette méthode, un extrait protéique d’embryons regroupés peut se lier spécifiquement à 125TGF-β2 marqués I et les complexes récepteur-ligand sont purifiés par immunoprécipitation et réticulés avant d’être séparés par SDS-PAGE. Les schémas de migration observés par autoradiographie des gels ont révélé la présence et la nature des espèces réceptrices marquées. Cette approche combine la spécificité du ligand du marquage d’affinité avec l’immunoprécipitation par des anticorps spécifiques, augmentant la portée de détection, évitant le transfert inefficace de TGFBR3. En raison de ses propriétés inhérentes, le test AFLIP n’est pas un test quantitatif, mais peut être utilisé pour évaluer avec confiance les différences expérimentales relatives dans le récepteur analysé.

<table><tbody><tr><td>Sous-impôt de disuccinimidyle (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel séchoir Modèle 583&nbsp ;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Compteur gamma automatique</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

affinity Étiquetage détection de endogène receptors de zebrafish embryons

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

En combinant les puissances de l’abeling Affinity Let de la récipitation Immunop(AFLIP), une technique de détection des récepteurs de faible abondance dans les embryons de poisson-zèbre a été mise en œuvre. Cette technique tire parti de la sélectivité et de la sensibilité conférées par le marquage d’affinité d’un récepteur donné par son ligand avec la spécificité de l’immunoprécipitation. Nous avons utilisé AFLIP pour détecter le récepteur TGF-β de type III (TGFBR3), également connu sous le nom de bêtaglycane, au cours du développement précoce du poisson-zèbre. L’AFLIP a joué un rôle déterminant dans la validation de l’efficacité du phénotype d’un poisson-zèbre morphant TGFBR3. Dans un premier temps, des extraits de protéines embryonnaires sont préparés et utilisés pour générer 125complexes I-TGF-β2-TGFBR3 qui sont purifiés par immunoprécipitation. Plus tard, ces complexes sont réticulés de manière covalente et révélés à l’aide de la séparation SDS-PAGE et de la détection par autoradiographie. Cette technique nécessite la disponibilité d’un ligand marqué et d’un anticorps spécifique contre le récepteur à détecter, et doit être facilement adaptée pour identifier tout facteur de croissance ou récepteur de cytokines qui répond à ces exigences.

La figure 1 montre un résultat représentatif obtenu avec aflip. Les signaux dans la piste 1 proviennent de la I-ligand 125 lié de manière covalente soit à la protéine de poisson zèbre bêtaglycan noyau (core BG, au- dessous du marqueur 150 kDa) ou le noyau BG qui a été traité à sa forme de protéoglycanes par l&#39; attachement des glycosaminoglycanes (GAG, frottis allant de 170 kDa à la partie supérieure du gel). Ce modèle de la migration, une protéine de base ...

Une nouvelle technique de détection des récepteurs endogènes de faible abondance présents dans les embryons de poisson-zèbre est décrite. Nous l’avons nommé AFLIP car il consiste en un marquage par affinité du récepteur par son ligand lié à l’immunoprécipitation.

Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter des récepteurs de facteurs de croissance peu abondants dans des embryons de poisson zèbre en combinant la sélectivité et la sensibilité du marquage d'affinité du récepteur choisi par son ligand radioactif. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la biologie du développement, telles que les niveaux d'expression des récepteurs et leurs propriétés biochimiques. Cette méthode, que nous avons surnommée AFLIP, étend les qualités descriptives puissantes du marquage d'affinité, une technique bien établie de biologie cellulaire, aux études du développement chez le poisson zèbre.Pour commencer cette procédure, collectez 100 à 200 embryons pour chaque condition et placez-les dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau pour poissons. Ensuite, déchorionatez manuellement les embryons à l’aide de pinces fines et évitez d’utiliser la pronase ou toute autre protéase au cours du protocole, car elles pourraient digérer les récepteurs ciblés. Puis, placez les embryons dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et rincez-les deux fois avec du PBS 1X.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de déyolkage. Libérez la majeure partie du vitellus en pipetant doucement les embryons dans la solution de haut en bas environ 30 à 40 fois. Pour les embryons à 72 HPF et 48 HPF, utilisez respectivement des embouts de pipette bleus et jaunes.Les embouts jaunes peuvent nécessiter une légère coupe afin d'éviter d'endommager les embryons. Un relâchement réussi du vitellus peut être vérifié en observant les embryons au microscope. Le retrait du vitellus doit être aussi complet que possible, car les lipides et protéines du vitellus pourraient interférer avec les étapes ultérieures de liaison de ligands ou d'anticorps.Après cela, récupérez les embryons par centrifugation à 600 x g pendant 15 secondes. Éliminez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez les embryons deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage en les vortexant doucement à la vitesse la plus basse.Ensuite, recueillir les embryons par centrifugation à 600 x g pendant 15 secondes. À partir de ce point, poursuivre la procédure à quatre degrés Celsius. Éliminer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.Ensuite, nous suspendons les embryons dans 350 microlitres de tampon de lyse et les homogénéisons à l’aide d’un pilon en plastique. Incubez ensuite les embryons lysés pendant 30 minutes avec agitation sur un agitateur pour tubes à essai à quatre degrés Celsius. Puis, centrifugez les embryons lysés à 11 000 x g pendant 15 minutes afin d’éliminer les débris insolubles.Ensuite, transférez le surnageant clarifié dans un tube neuf. Déterminez la quantité totale de protéines par le dosage des protéines de Bradford et tracez la courbe de calibration. À cette étape, placez 400 à 500 microgrammes de protéines totales d'embryon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et diluez-les à une concentration d'un microgramme par microlitre avec le tampon 1.Ensuite, ajoutez le stock de TGF-bêta II marqué à l'iode-125 afin d'obtenir une concentration finale de 150 picomolaire, puis incubez sous agitation sur un agitateur pour tubes à essai pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Par la suite, ajoutez l'anticorps non dilué dirigé contre le récepteur d'intérêt afin d'obtenir une dilution de 1:100. Poursuivez ensuite l'incubation à quatre degrés Celsius pendant deux heures supplémentaires ou toute la nuit.Après l'incubation, ajouter 50 microlitres de billes de liaison aux immunoglobulines appropriées et incuber 50 minutes avec agitation sur un agitateur pour tubes à essai à quatre degrés Celsius. Ensuite, récupérer les billes par microcentrifugation à 11 000 x g pendant 20 secondes et éliminer le surnageant dans un contenant approprié pour déchets radioactifs. Par la suite, laver les billes d'immunoprécipitation trois fois avec un millilitre de tampon de lavage pour immunoprécipitation en vortexant et en microcentrifugant à 11 000 x g pendant 20 secondes à chaque fois.Ensuite, resuspendre les billes d'IP dans 250 microlitres de tampon de lavage d'IP. Préparer une solution fraîche de DSS et ajouter 1,5 microlitre de celle-ci à l'échantillon. Puis, incuber l'échantillon pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avec agitation.Afin de bloquer la réaction de réticulation, ajouter 500 microlitres de tampon de lavage IP supplémenté avec suffisamment de solution mère de chlorure de tryst à pH 7,4 pour obtenir une concentration finale de 25 millimolaire en chlorure de tryst. Ensuite, centrifuger à 11 00 x g pendant 20 secondes afin de récupérer les billes d'IP. Puis, éliminer le surnageant et resuspendre les billes d'IP dans 30 microlitres de tampon laemmli réducteur.Ensuite, faire bouillir l'échantillon à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes avant l'électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis analyser les gels séchés à l'aide d'un phosphorimètre ou par autoradiographie classique. Cette figure montre les résultats représentatifs obtenus avec AFLIP. Les protéines totales extraites des embryons à 72 hpf et 48 hpf ont été soumises à un marquage d'affinité au TGF-bêta II marqué à l'iode-125, suivi d'une immunoprécipitation avec un anticorps de lapin anti-BG de poisson zèbre ou un anticorps de lapin anti-BG de rat en tant que témoin.Dans l'autoradiographie, le BG peut être détecté sans GAG ou sous forme de BG modifié par un glycosaminoglycane. Cette figure montre comment AFLIP peut être utilisée pour évaluer les niveaux d'expression d'un récepteur donné chez des embryons soumis à une manipulation expérimentale, dans ce cas précis, la réduction du betaglycan suite à l'injection d'un morpholino. La voie un illustre le niveau du récepteur TGF bêta III chez un embryon sauvage de 72 hpf, tandis que la voie deux montre l'effet de l'administration de sept nanogrammes d'un morpholino ciblant la limite entre l'exon 2 et l'intron 2 du transcrit primaire ZFPG. Remarquez que la diminution du BG obtenue avec ce morpholino n'est pas reproduite par son contrôle apparié incorrect.Ces résultats ont confirmé que le phénotype obtenu avec ce morpholino était spécifique à l'extinction du récepteur TGF bêta III, comme décrit précédemment. La réussite de la méthode AFLIP pour détecter un facteur de croissance ou des récepteurs de cytokines dépend de la disponibilité d'un ligand radiomarqué pouvant se lier et s'associer de façon covalente à son récepteur. Un bon anticorps pour l'immunoprécipitation est également requis.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Étant donné que l'AFLIP évite l'étape de transfert du western blot, elle permet une détection améliorée des récepteurs fortement glycosylés. Nous avons ainsi pu observer ici le cas du protéoglycane bétaglycan, qui se transfère très inefficacement en western blot. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la digestion enzymatique, peuvent être réalisées afin de caractériser d'autres modifications post-traductionnelles, à condition qu'elles soient révélées par des techniques électrophorétiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont AFLIP peut vous aider à détecter des récepteurs peu abondants dans plusieurs embryons de poisson par marquage d'affinité associé à une immunoprécipitation. Enfin, n'oubliez pas que le travail avec l'iode-125 doit être effectué avec précaution et une protection adéquate. Bonne chance dans vos expériences.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Ce protocole définit un moyen d'étiqueter et de tracer le destin de petits groupes de cellules du poisson zèbre en utilisant UV-uncaging de fluorescéine en cage, suivi par l'ensemble de montage immunomarquage pour amplifier le signal de la fluorescéine Uncaged.

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Un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie de la signalisation Notch/DeltaD chez les progéniteurs de la glie radiale du poisson-zèbre

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

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Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

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In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

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Découvrez la technique AFLIP pour détecter les récepteurs de facteurs de croissance peu abondants dans les embryons de zebrafish. Cette méthode combine le marquage d'affinité et l'immunoprécipitation pour améliorer la sensibilité.

Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

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