Préparation des échantillons MALDI homogènes pour les applications quantitatives

L'objectif général de cette méthode de préparation d'échantillon pour la spectrométrie de masse MALDI est de réduire l'hétérogénéité spatiale des signaux ioniques durant la MALDI MS. Un environnement de séchage bien contrôlé a été mis en place afin d'optimiser la méthode conventionnelle de goutte séchée, en manipulant les flux hydrodynamiques à l'intérieur de la goutte d'échantillon pendant le processus de séchage. Le principal avantage de cette technique réside dans la réduction efficace de l'hétérogénéité spatiale des signaux ioniques pour les échantillons préparés par la méthode de goutte séchée optimisée. Bien que cette méthode puisse fournir des échantillons homogènes pour le système métrique THAP.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes métriques, tels que l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il n'est pas facile de contrôler les conditions de séchage. Pour commencer cette procédure, ouvrez la porte d'une chambre de séchage et placez immédiatement une plaque d'échantillon préalablement nettoyée sur le bloc en cuivre.

Ensuite, fermez la porte. Réglez manuellement le débitmètre de gaz pour ajuster le débit d'azote à 10 pieds cubes normaux par heure. Après cela, affinez le réglage du débitmètre de gaz afin de garantir que l'humidité relative reste toujours inférieure à 25 % dans la chambre de séchage, mesurée à l'aide d'un hygromètre.

À l'aide de thermocouples de type K pour surveiller la température, régler manuellement la température du circulateur d'eau jusqu'à ce que la plaque d'échantillon atteigne 5 degrés Celsius pour l'expérience. S'assurer que les températures requises et l'humidité relative sont atteintes avant le dépôt de l'échantillon. Mélanger 0,25 microlitre de solution de THAP 0,1 Molaire et 0,25 microlitre de l'analyte souhaité dans un tube de microcentrifugation.

Vortexez l'échantillon pendant trois secondes. Ensuite, centrifugez l'échantillon pendant deux secondes afin de rassembler la solution au fond du tube de microcentrifugation. Après la centrifugation, ouvrez la porte de la chambre de séchage et déposez soigneusement 0,1 microlitre de la solution sur la plaque d'échantillonnage à l’aide d’une pipette.

Fermez immédiatement la porte et attendez que la goutte d'échantillon s'évapore complètement. Lorsque la température de la plaque d'échantillon est maintenue inférieure à celle de l'environnement, la vitesse moyenne des flux de recirculation à l'intérieur de la goutte augmente considérablement, favorisant la redistribution des molécules. Le dépôt de l'échantillon constitue l'étape la plus critique, déterminant la qualité des données et la reproductibilité.

La solution échantillon prémélangée doit être déposée immédiatement sur la plaque d'échantillonnage pour garantir que l'échantillon cristallise dans des conditions contrôlées. Après séchage, ouvrez la porte de la chambre de séchage.

Ensuite, régler la température du circulateur d'eau à 25 degrés Celsius. Une fois que la température de la plaque d'échantillon est revenue à 25 degrés Celsius, retirer la plaque d'échantillon de la chambre de séchage. Examiner la morphologie de l'échantillon au microscope stéréo avec un grossissement de cinq fois et prendre une image en champ clair.

À ce stade, insérez la plaque d'échantillons dans un spectromètre de masse MALDI. Ensuite, effectuez une analyse de spectrométrie de masse en imagerie. Sélectionnez un pic de masse caractéristique dans la liste des masses affichée dans la fenêtre des résultats et cliquez sur 2D pour tracer une image ionique bidimensionnelle.

Ensuite, cliquez sur les boutons de réglage dans la fenêtre contextuelle pour déterminer les limites supérieure et inférieure de l'intensité du signal, augmenter la résolution de l'image, puis cliquez sur enregistrer une image. Observez et comparez l'image ionique avec l'image en champ clair acquise précédemment afin d'obtenir la région essentielle de l'échantillon. Cliquez maintenant sur les points nuls et les régions fissurées dans l'image ionique affichée dans la fenêtre des résultats pour affiner la région à analyser.

Cliquez sur le bouton « trouver le bord » pour identifier la couche la plus externe de l'image ionique. Ensuite, cliquez sur « déduire » pour enregistrer les informations d'abondance ionique de la couche la plus externe dans une base de données, tout en supprimant cette couche de l'image ionique simultanément. Après avoir répété ces étapes précédentes jusqu'à ce que le centre de l'image ionique soit défini, cliquez et sélectionnez toutes les cases à cocher dans la liste des données de sortie, puis cliquez sur « exporter » pour exporter les données.

Enfin, ouvrez les données exportées à l’aide d’un logiciel de feuille de calcul pour calculer l’abondance ionique moyenne de chaque couche et obtenir ainsi les informations sur la distribution spatiale des ions. Sur les images en champ clair et MALDI du maltotriose, le signal ionique de la forme sodiée se localise principalement en périphérie de la zone d’échantillon lorsqu’il est préparé avec une température de plateau d’échantillon de 25 degrés Celsius. En abaissant la température à cinq degrés Celsius, le signal se répartit de manière homogène sur toute la surface de l’échantillon, ce qui suggère que la préparation des échantillons à une température de plateau plus basse peut redistribuer significativement les molécules et réduire l’hétérogénéité.

L'image de l'ion fragment de bradykinine protonée montre une tendance similaire à celle du maltotriose sodiée. Les analyses statistiques montrent que l'hétérogénéité des signaux ioniques obtenus avec une température de plateau d'échantillonnage de 5 degrés Celsius diminue de 60 à 80 pour cent par rapport à celle obtenue à 25 degrés Celsius. Dans le cas du maltotriose sodié, avec une température de plateau d'échantillonnage de 25 degrés Celsius, les intensités du signal au centre sont nettement inférieures à celles obtenues à une température de 5 degrés Celsius.

Le fragment protoné de la bradykinine montre moins de variation lorsque la température de la plaque d'échantillonnage diminue de 25 à 5 degrés Celsius. Lors de l'utilisation de cette méthode de séchage, il est nécessaire de contrôler et de surveiller attentivement la température et l'humidité relative dans la chambre de séchage. Une fois maîtrisée, une préparation d'échantillon selon cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.

Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la spectrométrie de masse MALDI pour explorer l'analyse quantitative des échantillons en goutte sèche. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'échantillons homogènes en goutte sèche pour l'analyse par spectrométrie de masse MALDI.