Le concept Terroir Interprété par Grape Berry métabolomique et transcriptomique

L'objectif général de ces procédures expérimentales est d'observer les différentes signatures du terroir dans le métabolome et le transcriptome du baie du cépage de vigne Corvina. L'étude de cas décrite ici a impliqué la collecte et l'analyse d'échantillons à trois stades de maturation provenant de sept vignobles répartis dans trois zones macroclimatiques, et ce sur trois campagnes culturales. Les techniques décrites révèlent la prédominance de l'effet millésime sur le métabolome de la baie.

Des signatures chimiques spécifiques représentant les trois zones macroclimatiques ont également été identifiées dans les baies mûres. La signature du terroir au niveau des zones macroclimatiques a été révélée à l’aide de techniques statistiques appropriées telles que l’ACP, soit l’analyse en composantes principales, et l’auto BLSDA, soit l’analyse discrète par projection orthogonale bidirectionnelle vers des structures inertes, afin d’analyser à la fois la matrice de données transcriptomiques et métabolomiques. En revanche, les différences entre les vignobles individuels sont plus subtiles et nécessitent également des approches statistiques plus sophistiquées et sensibles.

Commencez l'expérience en élaborant un plan d'échantillonnage approprié. Assurez-vous que le plan d'échantillonnage précise les lieux, les horaires et la procédure d'échantillonnage exacte. Après avoir récolté 30 grappes provenant de différentes positions le long de deux rangs de vigne, sélectionnez au hasard trois baies dans chaque grappe, en évitant celles présentant des dommages visibles ou des signes d'infection.

Répétez ce processus pour obtenir trois pools indépendants pour chaque stade de maturation. Désépépinez les baies et congélez immédiatement le péricarpe dans de l'azote liquide. Réduisez toutes les baies congelées de chaque pool en poudre à l’aide d’un broyeur automatique.

Divisez chaque échantillon en poudre en deux parties égales, l'une destinée à l'analyse transcriptomique et l'autre à l'analyse métabolomique. Ensuite, refermez et retirez le duer, puis conservez les poudres à moins 80 degrés Celsius. Préparez les extraits métaboliques des échantillons de baies à température ambiante dans trois volumes de méthanol, acidifié avec 0,1 % d'acide formique, dans un bain ultrasonique à 40 kilohertz pendant 15 minutes.

Centrifuger les extraits à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Diluer le surnageant dans deux volumes d'eau déionisée, puis filtrer à travers un filtre de 0,2 micron. Mettre en place la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse, en utilisant une source d'ionisation par électrospray ou un système HPLC-ESI-MS, comme décrit dans le protocole du texte.

Effectuez la séparation par HPLC avec un gradient linéaire des solvants A et B à un débit constant de 0,2 millilitre par minute, en utilisant un volume d'injection d'échantillon de 30 microlitres. Enregistrez les spectres de masse en modes d'ionisation négatif et positif alternés, avec les paramètres indiqués dans le protocole textuel. Pour traiter les données LC-MS, mettez en œuvre les procédures d'alignement de détection des pics, de comblement des lacunes et de filtration des pics à l'aide d'un logiciel approprié, tel que le logiciel open source M Zeta Mine, version 2.14.

Importer les fichiers texte résultants dans un tableur. Cela produit une matrice de données dans laquelle tous les métabolites détectés, reconnus par un numéro d'identification, une valeur du rapport masse/charge et un temps de rétention, sont quantifiés dans tous les échantillons en fonction de leurs valeurs d'aire de pic. Préparer l'assemblage d'hybridation selon les spécifications du format à quatre cartouches, en déposant 1,65 microgramme d'ARN complémentaire marqué au cyanine, dans un volume final de 41,8 microlitres d'eau désionisée sans RNase.

Ajouter 11 microlitres d'agent bloquant 10X et 2,2 microlitres de tampon de fragmentation 25X. Incuber à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un bain thermostaté, afin de fragmenter l'ARN. Au bout de 30 minutes, refroidir immédiatement sur de la glace pendant une minute.

Enfin, ajoutez 55 microlitres de tampon d'hybridation 2X et mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette. Après une centrifugation d'une minute à 15 500 ×g à température ambiante, placez immédiatement le tube micro-centrifuge sur de la glace. Pour charger la matrice micro-panachée personnalisée, insérez une lame avec joint intégré en positionnant l'étiquette vers le haut, dans la base d'une chambre d'hybridation.

Chargez lentement 100 microlitres d'échantillon d'hybridation dans chaque puits du joint, en dispensant le liquide à l'aide de la pointe d'une pipette, en évitant les bulles. Placez lentement la matrice microsur mesure, face vers le bas, en veillant à ce que le code-barres numérique soit orienté vers le haut. Assurez-vous que la paire en sandwich est correctement alignée.

Enfin, placez le couvercle de la chambre d'hybridation sur les lames superposées et serrez la pince à la main sur la chambre. Faites pivoter la chambre assemblée afin d'évaluer la mobilité des bulles. Placez la chambre à lames assemblée dans une rotissoire équilibrée, à l'intérieur d'un four d'hybridation réglé à 65 degrés Celsius.

Régler le rotateur pour qu'il tourne à 10 tr/min. Laisser l'hybridation se dérouler pendant 17 heures. Pour procéder au lavage de la lame de micro-réseau, préparer trois boîtes de coloration pour lames et les remplir avec les tampons de lavage appropriés.

Remplissez deux boîtes avec le tampon de lavage un, à température ambiante, et une boîte avec le tampon de lavage deux préchauffé. Démontez la chambre d'hybridation et retirez le sandwich. Avec la microplaque à puces orientée de manière à ce que le code-barres numérique soit face vers le haut, immergez le sandwich dans la première boîte de coloration remplie du tampon de lavage un à température ambiante, puis, à l’aide de pinces propres, séparez le joint de la microplaque à puces.

Transférez rapidement la lame de micro-réseau dans un porte-lame, puis placez-la dans le deuxième bac de coloration rempli du tampon de lavage un à température ambiante. Placez le bac de coloration sur un agitateur magnétique et effectuez un lavage pendant une minute avec une agitation modérée. Transférez rapidement le porte-lame dans le troisième bac de coloration, rempli du tampon de lavage deux préchauffé, et lavez pendant une minute avec une agitation modérée.

Retirez lentement le porte-lame du bac de coloration et sortez délicatement la lame du porte-lame, en évitant les gouttelettes. Placez la lame de micro-réseau dans un scanner approprié, puis numérisez chaque réseau en utilisant les paramètres recommandés dans le manuel d'instructions du fabricant du micro-réseau. Pour préparer le logiciel d'analyse statistique, importez d'abord les données de métabolomique et de transcriptomique.

Allez dans Fichier, Nouveau projet régulier, Nouveau projet régulier, pour importer la matrice de données obtenue. Ensuite, cliquez sur Éditer. Transposez toute la matrice, accueil, et attribuez l'identifiant primaire et secondaire approprié. Et terminez.

Pour effectuer l'analyse statistique multivariée, accédez à la fenêtre du jeu de travail, sélectionnez PCAX comme type de modèle, puis cliquez sur AutoFit. Sélectionnez Scores, puis Scatter, afin d'obtenir le graphique montrant le regroupement possible des échantillons. Examinez le graphique des scores de l'ACP.

Si un bon modèle est obtenu, utilisez les mêmes classes d'échantillons pour construire un modèle d'analyse discriminante O2PLS. Pour construire deux modèles d'analyse discriminante O2PLS à l'aide des échantillons classés par MacroZone, attribuez les classes en allant à la fenêtre Accueil, Nouveau Comme, M1, puis Observations. Définissez les classes souhaitées.

Ensuite, modifiez le type de modèle de PCAX à l'analyse discriminante O2PLS. Appuyez sur Autofit. Passez à la sélection de M2 dans la fenêtre du projet, cliquez sur Scores, puis sur Scatter, pour visualiser le graphique et la position des classes d'échantillons.

Allez à Sélectionner le type de données, puis sélectionnez Observations et Contributions. Cliquez ensuite sur Ajouter une série et sélectionnez les éléments corrélation PQ un et corrélation PQ deux, ou d'autres composantes si elles sont présentes. En appuyant sur le bouton droit de la souris sur le graphique, accédez à Propriété, sélectionnez Couleur, puis choisissez Par termes, afin de distinguer les symboles du graphique entre les molécules et les classes.

Allez dans Mise en page, Formater le graphique, Accéder et/ou Styles, pour modifier le graphique avec les caractéristiques souhaitées. Pour observer quels métabolites caractérisent une ou plusieurs classes spécifiques, accédez à la Liste des graphiques, puis Nuage de points. Une analyse exploratoire de la matrice complète de données par ACP a montré que les échantillons s'agrégeaient selon le stade de maturation, incluant la véraison, la maturation intermédiaire et la maturation complète, le long des deux premières composantes principales.

Les échantillons se regroupent selon la saison de croissance le long de la troisième composante principale. L'analyse discriminante O2PLS des baies matures permet d'identifier des signatures spécifiques de terroir, représentant les trois macrozones : Valpolicella, Lac de Garde et Soave. Les graphiques de charges de ces modèles sont exprimés en corrélation PQ, c'est-à-dire la corrélation entre P, la classe des échantillons, et Q, les métabolites.

Dans les graphiques de chargement, les carrés rouges représentent la classe des échantillons ou des macrozones, et les triangles colorés représentent les métabolites individuels. Les métabolites sont codés par couleur selon leur classe chimique, et la distance entre les métabolites et les échantillons reflète leurs relations. La macrozone du lac de Garde était caractérisée par des stilbènes, tandis que Soave et Valpolicella étaient marqués par des flavonoïdes.

Parmi les anthocyanines, la péonidine et ses dérivés étaient plus présents dans la macrozone du lac de Garde, tandis que les autres anthocyanines étaient plus présentes dans la macrozone de Valpolicella. En outre, les anthocyanines trois-O-glucosides étaient plus présentes dans la macrozone de Valpolicella, alors que les dérivés acylés et cumérolés étaient plus présents dans la macrozone de Soave. La transcriptomique, la RA et les méthodes RNA sig permettent de surveiller simultanément des milliers de transcrits de vigne.

Une nouvelle matrice micro-technologique personnalisée a récemment été conçue et représente un nombre encore plus élevé de sondes, couvrant des espèces supplémentaires du genre Vitis récemment découvertes. Compte tenu de l'obsolescence rapide des plateformes transcriptomiques, nous décrivons une procédure alternative utilisant une nouvelle plateforme contenant davantage de sondes que l'ancienne, notamment 249 transcrits prédits de peno en plus, pour 1392 loci peno nouvellement identifiés, ainsi que 179 gènes de corvina prava. L'analyse métabolomique par HPLC-ESI-MS est suffisamment sensible pour détecter simultanément un grand nombre de métabolites.

La capacité de créer un plan d'échantillonnage est essentielle. Le choix d'un seul et unique clone afin de minimiser les différences génétiques, ainsi que la multiplicité des durées d'échantillonnage, ont permis d'identifier les véritables différences entre les terroirs. Il serait intéressant de comparer le même cultivar cultivé dans des zones moins optimales, mais malheureusement, ces vignobles n'étaient pas disponibles.