Name: Le développement dun anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer lexposition humaine aux agents pathogènes environnementaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez l'immunoessai multiplex salivaire basé sur des billes pour mesurer simultanément les anticorps IgG contre plusieurs agents pathogènes environnementaux. Cette méthode permet d'identifier rapidement les sources d'exposition alimentaire, hydrique et aérienne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Clarissa Curioso a été soutenue par une nomination au programme de participation à la recherche de l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, administré par l’Institut Oak Ridge pour la science et l’éducation dans le cadre d’un accord interagences entre le département de l’Énergie des États-Unis et l’EPA des États-Unis.

L&#39;approbation a été obtenue à partir de l&#39;Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) pour la collecte des échantillons de salive créviculaire stimulés de baigneurs à Boquerón Beach, Puerto Rico, dans le cadre des États-Unis Environmental protection Agency (EPA) nationale épidémiologique et évaluation environnementale des loisirs (NEEAR) étude sur l&#39; eau 23 pour évaluer les expositions et les maladies de natation associée. Les sujets ont donné leur consentement éclairé et ont été informés sur l&#39;utilisation du dispositif de collecte de salive par des entrepreneurs USEPA formés. Les échantillons de salive ont été expédiés sur de la glace et, à la réception, ils ont été centrifugés et conservés à -80 ° C comme décrit 4. 1. Bead Activation <ol><li> Remettre en suspension les stocks de billes par vortex et sonication pendant 20 s et le transfert d&#39; environ 5,0 x 10 6 des perles de stock (400 pi) à des tubes de microcentrifugation. Remarque: Til billes sont fournies à une concentration de 12,5 x 10 6 billes / ml. </li><li> Sédimenter les billes de licence par centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes sous forme de granulés dans 100 ul d&#39; eau distillée (dH 2 O) par vortex et sonication pendant 20 secondes. Répétez l&#39;étape 1.2. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes lavées dans 80 ul d&#39;mM de phosphate de sodium monobasique 100, pH 6,2 par vortex et sonication pendant 20 secondes. </li><li> Immédiatement avant utilisation, faire un 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution en ajoutant 200 pi de dH 2 O à 10 mg Sulfo-NHS aliquote. Mélanger par vortex. </li><li> Ajouter 10 ul de 50 mg / ml Sulfo-NHS à billes. Mélanger par vortex. </li><li> Immédiatement avant utilisation, faire un / ml 1-éthyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide 50 mg (EDC) de la solution par addition de 200 pi d&#39; eau distillée (dH 2 O) à 10 mg EDC aliquote. Mélanger par vortex. </li><li> Ajouter 10 ul de 50mg / ml solution EDC aux billes. Mélanger par vortex. Incuber les billes pendant 20 minutes à la température ambiante, dans l&#39;obscurité, avec un mélange par tourbillon à des intervalles de 10 min. Pellet les billes activées par microcentrifugation à 10 000 g pendant 2 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 250 pl d&#39;mM d&#39; acide 2- [N - morpholino] éthanesulfonique acide 50 (MES), pH 5,0 par vortex et sonication pendant 20 secondes. </li><li> Pellet les billes activées par microcentrifugation à 10 000 g pendant 2 min. </li><li> Répétez les étapes 1.9 et 1.10. Note: Ceci permet d&#39;obtenir un total de deux lavages avec du MES 50 mM, pH 5,0. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 100 pl d&#39;mM de MES, pH 5,0 50 par vortex et sonication pendant 20 secondes. </li></ol> 2. Perle Couplage <ol><li> Coupler les antigènes vers les ensembles de billes en utilisant les concentrations indiquées dans le tableau 1. </li><li> Ajouter chaque antigène aux billes activées et amener le volume total à 500 ul dans du MES 50 mM, pH 5,0. Mélanger les antigènes d&#39;perles d par vortex. </li><li> Incuber les antigènes et les billes pendant 2 h avec un mélange par rotation (~ 15 min) à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Sédimenter les billes couplées par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 500 pl de tampon phosphate salin (PBS), l&#39;albumine de sérum -bovine (BSA), le monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium azoture (PBS-TBN), pH 7,4 par vortex et sonication. Pellet les billes par microcentrifugation à 10 000 xg pendant 2 minutes et retirer le surnageant. Attention: L&#39;azoture de sodium est un produit chimique extrêmement toxique. Il est mortel en cas d&#39;ingestion ou prend contact avec la peau. Ne pas respirer les poussières / fumées / gaz / brouillards / vapeurs ou aérosols. Porter un équipement de protection individuelle approprié (EPP) lors de la manipulation et de l&#39;éliminer conformément aux lois appropriées. </li><li> Resuspendre les billes dans 1 ml de PBS-TBN par vortex et sonication pendant 20 secondes. </li><li> Sédimenter les billes par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min. </li><li>Répétez les étapes 2.5 et 2.6. Note: Ceci permet d&#39;obtenir un total de deux lavages avec du PBS-TBN. </li><li> Remettre en suspension les billes couplées et lavées dans 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% d&#39;azoture, pH 7,4. Stocker les billes couplées dans un réfrigérateur C 2-8 ° dans l&#39;obscurité. </li></ol> 3. Count Bead <ol><li> Préparer une dilution 1:10 des billes couplées à de l&#39;eau ou du tampon PBS. </li><li> Charge 10 pi de la dilution de talon sur un hémocytomètre au point d&#39;introduction d&#39;échantillon. </li><li> Comptez les perles vu dans l&#39;une des grilles 4 x 4 de coin. Calculer le nombre total de billes couplées à l&#39; aide de la formule suivante: Décompte (1 coin de la grille 4 x 4) x (1 x 10 4) x (facteur de dilution) x resuspension volume en millilitres. </li></ol> 4. Confirmation de l&#39;antigène de couplage <ol><li> Remettre en suspension le mélange des stocks de billes couplées à des antigènes d&#39;intérêt par vortex et sonication pendant 20 sec. </li><li> Préparer un mélange de travail de perles en diluant les stocks de billes couplées à une finaleconcentration de 100 perles / ul de chaque perle unique situé dans PBS-1% de tampon BSA (PBS-BSA 1%, pH 7,4). </li><li> Préparer au moins 7 à deux dilutions d&#39;anti-espèces anticorps primaire IgG selon les recommandations du fabricant en plaque de 96 puits à fond rond avec du tampon PBS-BSA 1%. </li><li> Pré-humidifier une colonne de 8 puits séparés (8 rangées) d&#39;un filtre plaque de fond de 96 puits pour chaque test de confirmation de couplage de l&#39;antigène avec 100 pi de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Ajouter 50 pi de mélange de perles de travail (billes d&#39;antigène couplé) aux puits pré-mouillées. </li><li> Ajouter 50 ul de dilutions d&#39; anticorps à des lignes 1-7 de chaque colonne de la plaque filtrante à 96 puits et 50 ul de tampon PBS-BSA 1% à la ligne 8 à la place d&#39;anticorps dilué à servir de puits de fond. Mélanger avec une pipette multi-canaux par pipetage de haut en bas 5 fois. Effectuez la même procédure pour chaque perle ensemble de l&#39;antigène couplé à confirmer. </li><li> Couvrir et laisser incuber dans l&#39;obscurité à la température ambianterature pendant 1 h sur un agitateur de microplaque à 500 tours par minute. Retirer le surnageant par le vide. </li><li> Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répéter 1x. Remettre en suspension les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal. </li><li> Diluer anti-espèce anticorps de détection biotinylé secondaire IgG spécifique à 16 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%. </li><li> Ajouter 50 pi d&#39;anticorps secondaire dilué dans chaque puits par pipetage de haut en bas 5 fois. </li><li> Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal. </li><li> Diluer la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE) à 24 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%. </li><li> Ajouter 50 ul de reporter à chaque puits et mélanger par pipetage de haut en bas 5 fois. </li><li> Cau-dessus de la plaque filtrante et laisser incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x. </li><li> Resuspendre les billes dans 100 pl de PBS-BSA à 1% et à analyser 50 ul en utilisant l&#39;analyseur 29. Note: Les résultats de l&#39;analyse immunologique multiplex à base de perles sont mesurées en intensité de fluorescence médiane (MFI). Toujours se référer à la dernière version du manuel du logiciel, si disponible pour éviter les erreurs. </li></ol> 5. salivaire Multiplex Immunoassay <ol><li> Retirer la salive du congélateur à -80 ° C et laisser décongeler à température ambiante. </li><li> un antigène couplé resuspendre les stocks de billes par vortex et sonication pendant 20 secondes. </li><li> Préparer un mélange de perles de travail en diluant les stocks de perles couplées à une concentration finale de 100 perles / ul de chaque jeu de billes unique dans un tampon PBS-1% BSA. </li><li> Préparer une dilution 1: 4 en poids de la saliveith PBS-1% de tampon de BSA dans un 96 puits, plaque de puits profonds. </li><li> plaque de filtre pré-humide avec 100 pi de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;un mélange de perles de travail et un volume égal de la salive diluée à 95 puits des plaques à 96 puits de filtre pour un rapport 1: 8 dilution finale. Mélanger les réactions avec un pipetteur multi-canal. Pour une commande bien, ajouter 50 perles d&#39;antigène couplé ul plus 50 pi de tampon PBS-BSA à 1% (en remplacement de la salive). </li><li> Couvrir et laisser incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de microplaque à 500 tours par minute. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x. </li><li> Resuspendre les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal. </li><li> Diluer l&#39;IgG anti-humain de l&#39;anticorps de détection secondaire biotinylé de chèvre à 16 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%. </li><li> Ajouter 50 ul dilué anticorps secondaire à chaque puits et mélanger le contenu avecun pipetteur multi-canal. </li><li> Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x. </li><li> Resuspendre les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal. </li><li> Diluer la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE) à 24 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%. </li><li> Ajouter 50 ul reporter à chaque puits et mélanger avec une pipette multi-canaux. </li><li> Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x. </li><li> Resuspendre les billes dans 100 pl de PBS-BSA à 1% et à analyser 50 ul en utilisant l&#39;analyseur 29. Note: Les résultats de l&#39;analyse immunologique multiplex sont mesurées en Median Fluorescence Intensity (MFI) unités. Toujours se référer àla dernière version du manuel du logiciel, si disponible pour éviter les erreurs. </li></ol>

<ol><li>Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPr%C3%BCss-%C3%9Cst%C3%BCn%2C+A+%22Safer+water%2C+better+health%3A+costs%2C+benefits+and+sustainability+of+interventions+to+protect+and+promote+health%22">Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health</a>. , World Health Organization. Geneva. (2008).</li>
<li>Augustine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+to+developing+a+multiplex+immunoassay+for+determining+human+exposure+to+environmental+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens.</a> J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).</li>
<li>Griffin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+salivary+antibody+immunoassays+for+the+detection+of+incident+infections+with+Norwalk+virus+in+a+group+of+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers.</a> J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).</li>
<li>Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+for+the+quantitation+of+salivary+antibody+responses+to+selected+waterborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens.</a> J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).</li>
<li>Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Current diagnostic uses of saliva.</a> J Dent Res. 66, 420-424 (1987).</li>
<li>Mandel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">The diagnostic uses of saliva.</a> J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).</li>
<li>Malamud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+as+a+Diagnostic+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+J%22%5BJournal%5D)">Saliva as a Diagnostic Fluid.</a> Brit Med J. 305, 207-208 (1992).</li>
<li>Ballam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+useful+in+the+salivary+diagnosis+of+Helicobacter+pylori+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection.</a> J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).</li>
<li>Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+as+a+source+of+anti-malarial+antibodies+to+examine+population+exposure+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 10, 104(2011).</li>
<li>Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+invasive+amebiasis+by+enzyme-linked+immunosorbent+assay+of+saliva+to+detect+amebic+lectin+antigen+and+anti-lectin+immunoglobulin+G+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies.</a> J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Toyoguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reactivity+to+Cryptosporidium+parvum+in+saliva+of+calves+after+experimental+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection.</a> J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).</li>
<li>Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+and+booster+salivary+antibody+responses+to+a+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants.</a> J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).</li>
<li>Tourinho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+cutoff+ratio+for+detecting+antibodies+against+hepatitis+A+virus+in+oral+fluids+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay.</a> J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).</li>
<li>Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+saliva+as+an+alternative+to+plasma+for+the+detection+of+hepatitis+C+virus+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies.</a> Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).</li>
<li>Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+norwalk+virus+infection+by+indirect+enzyme+immunoassay+detection+of+salivary+antibodies+to+recombinant+norwalk+virus+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).</li>
<li>Yap, G., Sil, B., Ng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saliva+for+early+dengue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of saliva for early dengue diagnosis.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).</li>
<li>Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+saliva-based+test+for+detecting+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).</li>
<li>Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+saliva+for+antibodies+to+the+LPS+of+Escherichia+coli+O157+in+patients+with+serum+antibodies+to+E.+coli+O157+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS.</a> J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).</li>
<li>Ashbolt, N., Bruno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+refinement+of+the+WHO+risk+framework+for+recreational+waters+in+Sydney%2C+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia.</a> J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).</li>
<li>Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QMRA+%28quantitative+microbial+risk+assessment%29+and+HACCP+%28hazard+analysis+and+critical+control+points%29+for+management+of+pathogens+in+wastewater+and+sewage+sludge+treatment+and+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse.</a> Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).</li>
<li>Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+drinking+water+and+disease+outcomes+in+developing+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions.</a> Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).</li>
<li>Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+model+to+assess+microbial+health+risks+associated+with+beneficial+uses+of+biosolids%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids.</a> Risk Anal. 24, 221-236 (2004).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWade%2C+TJ+%22Report+on+2009+National+Epidemiologic+and+Environmental+Assessment+of+Recreational+Water+Epidemiology+Studies%2C+US+EPA.+US+EPA+Report+Number%3A+EPA%2F600%2FR-10%2F168%3A+US+EPA2011%22">Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011</a>. , (2011).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+surveillance+development+for+tropical+infectious+diseases+using+simultaneous+microsphere-based+multiplex+assays+and+finite+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).</li>
<li>Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+serological+survey+in+the+Italian+population%3A+interpretation+of+results+using+mixture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model.</a> Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).</li>
<li>Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+serological+surveys+using+mixture+models%3A+the+seroepidemiology+of+measles%2C+mumps+and+rubella+in+England+and+Wales+at+the+beginning+of+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century.</a> Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).</li>
<li>Baughman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+diagnostic+cutoff+points+for+levels+of+serum+antibodies+to+pertussis+toxin%2C+filamentous+hemagglutinin%2C+and+fimbriae+in+adolescents+and+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).</li>
<li>Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead-based+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+Shiga+toxins+and+isolation+of+Escherichia+coli+O157+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods.</a> J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Luminex+User+Software+Manual+%28RUO%29+xPONENT+3.1+Rev.+2%22">Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2</a>. 3, 6-102 (2014).</li>
<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

L&#39;Agence américaine pour la protection de l&#39;environnement par le biais de son Bureau de recherche et de développement financé et géré la recherche décrite ici. Il a été soumis à l&#39;examen administratif de l&#39;Agence et approuvé pour publication. La mention d&#39;appellations commerciales ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation pour l&#39;utilisation.

Ces résultats indiquent que la méthode d&#39;immuno-essai multiplex est utile pour établir une discrimination entre des échantillons de salive qui sont immunopositif ou immunonegative. Pour déterminer immunopositivité, un seul point de coupure a été développé par le calcul de la moyenne plus trois écarts-types des journaux transformé IMF réponses des perles découplées de contrôle testés avec tous les échantillons de salive. Le point de coupure a donné la capacité d&#39;évaluer l&#39;exposition et immunoprevalence soit à...

Quatre-vingt-huit pour cent des maladies liées à la diarrhée dans le monde entier est associé à l&#39; exposition humaine à l&#39; eau contaminée, des aliments dangereux et un mauvais assainissement / hygiène, causant environ 1,5 millions de décès, dont la majorité sont des enfants 1. Ceci est une cause majeure de préoccupation pour les responsables de la santé publique et les décideurs politiques. Dans un effort pour enquêter sur les expositions et les maladies associées à l&#39; origine hydrique et d&#39; autres agents pathogènes environnementaux, nous avons développé un dosage immunologique multiplex pour mesurer les anticorps dans les échantillons humains 2-4. Cette méthode peut être appliquée à des études épidémiologiques pour déterminer l&#39;exposition humaine à ces agents pathogènes et de mieux définir les infections de immunoprevalence et incidents. Saliva est très prometteur comme alternative au sérum pour la recherche de biomarqueurs humains. Parmi les avantages de l&#39; utilisation de la salive sont les non-invasivité et la facilité de prélèvement d&#39;échantillons, à faible coût, et les échantillons peuvent être facilement recueillies auprès des enfants 5-7 &lt;/ Sup&gt;. Des échantillons de sérum et de salive ont été largement étudiés pour les anticorps contre H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonie 12, hépatite virus A et C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, le virus de la dengue 16, le virus de l&#39; immunodéficience humaine (VIH) 17 et Escherichia coli O157: H7 18. Un dosage immunologique multiplex permet l&#39;analyse de plusieurs analytes simultanément dans un volume d&#39;échantillon unique et dans un seul cycle ou courir. Antigènes multiplexés de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, l&#39; hépatite A virus, et deux norovirus ont été utilisés pour mesurer la salive humaine IgG et IgA 2-4 3,4 et plasma IgG 2,3 réponses d&#39;anticorps à ces agents pathogènes en utilisant unà base de billes de dosage immunologique multiplexage. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec des études épidémiologiques de l&#39;exposition aux microbes dans l&#39;eau, le sol et la nourriture, le type de dosage décrit dans cette étude peut fournir des informations précieuses pour améliorer la compréhension des infections causées par des pathogènes environnementaux. En outre, les données d&#39; anticorps salivaires obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour améliorer les modèles d&#39;évaluation des risques 19-22.

<table><tbody><tr><td>Equipment and Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>Utilisé pour centrifuger des échantillons</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Utilisé pour mélanger des échantillons</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Utilisé pour séparer les perles</td></tr><tr><td>Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. </td><td>Capp</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre (Bright Line)</td><td>Housser Scientific&nbsp ;</td><td>3200</td><td>Utilisé pour compter les billes couplées</td></tr><tr><td>Collecteur à vide multi-écrans</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Utilisé dans les étapes de lavage pour éliminer le surnageant</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Utilisé pour agiter les billes pendant les incubations</td></tr><tr><td>Rack de tubes (1,5 ml et 0,5 ml) (assortis)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettleuse ou autre</td><td></td><td>Utilisé pour mesurer les réactifs de lavage pour la fabrication de tampons</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Utilisé lors de l’étape d’incubation de couplage</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Utilisé pour analyser les données de réponse des anticorps</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Utilisé pour analyser les données de réponse des anticorps</td></tr><tr><td>Analyseur Luminex avec le logiciel xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Instrument et logiciel utilisés pour exécuter des tests</td></tr> <tr><td><antigènes forts></forts>GI.1</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Virus de Norwalk : p-particule</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 &micro ;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norovirus VA387 : p-particule</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 &micro ;g.</td></tr><tr><td>Virus de l’hépatite A : concentré de grade II issu de la culture cellulaire</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antigène couplé à 100 & micro ; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori : lysat</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antigène couplé à 25 &micro ; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>Antigène couplé à 25 & micro ; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni : antigène KPL</td><td></td><td>50-92-93</td> tué par la chaleur <td>couplé à 50 &micro ; g</td></tr><tr><td>Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-norovirus de cobaye</td> <td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>Souris anti-hépatite A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>Souris anti-hépatite A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity Anticorps purifié contre Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>du pAb de chèvre avec Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>BacTrace Chèvre anti-Campylobacter espèce</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>Utilisé pour la confirmation</td></tr> <tr><td>du couplage<fort>secondaire » Anticorps</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotine-SP-Conjugués AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>IgG anti-chèvre de lapin biotinylé (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Utilisé pour la confirmation du couplage</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre biotinylée (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Utilisé pour la confirmation</td></tr> <tr><td>du couplageAffinity Anticorps purifié Biotine Étiqueté Chèvre anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Utilisé pour la confirmation de couplage</td></tr><tr><td><fort>Consommables</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes à microcentrifuger en copolymère</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Utilisé comme tubes à centrifuger à faible liaison</td></tr><tr><td>10 &micro ; l recharges d’embouts de pipette</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; l recharges d’embout de pipette</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1 000 & micro ; l recharges d’embout de pipette</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Divers fournisseurs</td><td></td><td>Utilisé pour garder les billes dans l’obscurité pendant les incubations</td></tr><tr><td>Plaques Deep Well</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Utilisé pour diluer des échantillons de salive</td></tr><tr><td>Plaques filtrantes multi-écrans</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Utilisé pour effectuer des tests</td></tr><tr><td>Système de collecte de salive Oracol</td><td>Malvern Medical Développé Limited</td><td></td><td>Utilisé pour la collecte de salive</td></tr> <tr><td>< forts>réactifs </forts></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microsphères carboxylées (billes)</td><td>Luminex Corporation</td><td>En fonction de l’ensemble de billes</td><td>Les antigènes sont couplés aux microsphères</td></tr><tr><td>EDC (chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide)</td><td>Pierce</td><td>77149 ou 22980</td><td>Utilisé dans l’activation</td></tr> <tr><td>des billesSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Utilisé dans l’activation des billes</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-phycoerythrine (1 mg/ml)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>S-866</td><td>Utilisé comme rapporteur</td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]acide éthanesulfonique)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Utilisé pour le couplage</td></tr><tr><td>Tween-20 (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitan)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>Utilisé dans le tampon de lavage pour éliminer les tampons de liaison</td></tr><tr><td><forts>protéiques non spécifiques</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forts>PBS-TBN (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % Azide, pH 7,4)</fort>**</td>Filtre Stériliser et stocker à 4 &deg<td></td><td></td><td> ; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0,1 % (p/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0,2 % (v/v)</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (0,05 % d’azoture)**</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td>**<fort>Attention</fort> : L’azoture de sodium est extrêmement toxique. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Portez des EPI appropriés. Disposer conformément aux lois applicables.</td></tr><tr><td><Tampon > couplage (0,05 M MES, pH 5,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]acide éthanesulfonique)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td><Tampon >dosage fort (PBS, 1 % BSA, pH 7,4)&nbsp ; </td><td></td><td></td><td>Filtre Stériliser et conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>PBS, 1 % BSA, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 % BSA</td></tr><tr><td>Tampon d’activation (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)</fort></td><td></td><td></td><td>Filtre Stériliser et conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (Phosphate de sodium, monobasique anhydre)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0,1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4)</td>Filter Stériliser et stocker à 4 &deg<td></td><td></td><td> ; C</td></tr><tr><td>PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05 % DOUZE</td></tr></tbody></table>

le développement d&#39;un anticorps salivaire multiplex immunoassay mesurer l&#39;exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

L&#39;étiologie et les impacts de l&#39;exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux sont une préoccupation majeure dans le monde entier et, par conséquent, la capacité d&#39;évaluer des approches à haut débit rentables d&#39;exposition et les infections à l&#39;aide serait indispensable. Ce mémoire décrit le développement et l&#39;analyse d&#39;un essai immunologique à base de billes multiplexe capable de mesurer la présence d&#39;anticorps dans la salive humaine à des agents pathogènes multiples simultanément. Saliva est particulièrement intéressante dans cette application car elle est non invasive, moins cher et plus facile à recueillir que du sérum. Des antigènes provenant d&#39;agents pathogènes environnementaux ont été couplés à des microsphères carboxylées (billes) et sont utilisés pour mesurer les anticorps dans de très petits volumes d&#39;échantillons de salive humaine en utilisant un dosage en phase de solution à base de billes. Les billes ont été couplés à des antigènes provenant de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G et G I.1 II.4) et le virus de l&#39; hépatite A. Faire en sorte que les antigènes sont suffisamment couplés àles billes, le couplage a été confirmée en utilisant des espèces, des anticorps de capture primaires dérivés d&#39;animaux, suivie par une incubation avec biotinylés anti-espèce des anticorps de détection secondaires et de la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE). En tant que contrôle pour mesurer la liaison non spécifique, un jeu de billes a été traité de manière identique aux autres, sauf qu&#39;il n&#39;a pas été couplé à un antigène. Les billes d&#39;antigène couplé et de contrôle ont ensuite été incubées avec des échantillons prospectivement recueillies salive humaine, mesurée sur un analyseur à haut débit basé sur les principes de la cytométrie de flux, et la présence d&#39;anticorps dirigés contre l&#39;antigène a été mesurée dans médiane de fluorescence unités d&#39;intensité (MFI) . Ce dosage immunologique multiplex a un certain nombre d&#39;avantages, y compris davantage de données avec moins de l&#39;échantillon; les coûts et la main-d&#39;œuvre réduits; et la possibilité de personnaliser le test à plusieurs cibles d&#39;intérêt. Les résultats indiquent que le dosage immunologique multiplex salivaire peut être capable d&#39;identifier les expositions et les infections antérieures, qui peut être especially utile dans les études de surveillance impliquant de grandes populations humaines.

Un jeu de billes unique a été utilisé comme témoin pour mesurer la liaison non spécifique et de l&#39;échantillon à la variabilité de l&#39;échantillon. Ces billes ont été traitées de manière identique à l&#39;antigène billes couplées à l&#39;exception qu&#39;ils ne sont pas mises en incubation avec un antigène dans l&#39;étape de couplage. Les valeurs MFI&gt; 500 obtenues à partir des billes témoins incubées avec les échantillons de salive ont été prélevés à partir d&#39;autres analyses...

Dans le climat actuel de rareté des ressources, de nouvelles technologies émergent qui permettent aux chercheurs de mener des études moins coûteuses, plus rapides et avec plus de précision. Nous décrivons ici le développement d’un dosage immunologique multiplex d’anticorps salivaires à base de billes pour mesurer l’exposition humaine à plusieurs agents pathogènes environnementaux simultanément.

Le développement d&#39;un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l&#39;exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

L'objectif général de cet immunoessai multiplex basé sur des billes pour les anticorps salivaires est d'identifier les agents étiologiques responsables des maladies symptomatiques et asymptomatiques liées à l'environnement en mesurant simultanément les réponses d'anticorps de type IGG contre plusieurs agents pathogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la science de l'exposition. Par exemple, quels agents pathogènes sont responsables des maladies observées dans certaines populations ?Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de mesurer rapidement et à moindre coût des anticorps dirigés contre de multiples analytes en un seul essai, en utilisant des volumes d'échantillons très faibles. Cette méthode peut fournir des informations sur les agents étiologiques et leurs sources d'exposition, notamment par voie alimentaire, hydrique et aérienne. La démonstration officielle de cette procédure est essentielle, car si elle n'est pas correctement mise en place, les résultats peuvent être peu fiables.Commencez par vortexer et soniquer les mélanges stock de billes couplées aux antigènes d'intérêt pendant 20 secondes à la fois afin d'obtenir des suspensions homogènes de billes. Ensuite, diluez les stocks de billes couplées à une concentration finale de 100 billes par microlitre de chaque jeu de billes unique dans du PBS supplémenté avec 1 % de BSA. Puis, préparez au moins sept dilutions sérielles deux fois consécutives d'anticorps primaire anti-espèce IgG, dans du PBS additionné de BSA, dans une plaque de 96 puits à fond rond selon les recommandations du fabricant.Pré-humidifiez une colonne séparée de huit rangées de 12 puits d'une plaque filtrante à 96 puits pour chaque test de confirmation du couplage de l'antigène avec 100 microlitres de tampon de lavage, puis éliminez le surnageant par aspiration sous vide. Ensuite, ajoutez 50 microlitres des billes couplées à l'antigène dans les puits pré-humidifiés, ainsi que 50 microlitres de l'anticorps dilué en série dans les rangées une à sept de la plaque filtrante à 96 puits, et ajoutez 50 microlitres de PBS additionné de BSA dans la rangée huit, servant de témoin du fond d'anticorps dilué. Utilisez une pipette multicanal pour mélanger les contenus de chacun des puits en aspirant et en expulsant cinq fois.Ensuite, couvrez la plaque et incubez les anticorps avec les billes couplées à l'antigène à l'abri de la lumière, à température ambiante, sur un agitateur de plaque microtitration à 500 tr/min. Après une heure, aspirez le surnageant et lavez les puits avec deux aliquots de 100 microlitres de tampon de lavage. Après le deuxième lavage, remplacez le tampon par 50 microlitres de PBS contenant du BSA.Diluez maintenant l'anticorps secondaire de détection anti-IgG spécifique d'espèce à 16 microgrammes par millilitre dans du PBS additionné de BSA, puis ajoutez 50 microlitres d'anticorps secondaire dilué à chaque puits. Incubez les billes et les anticorps à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 30 minutes sur un agitateur de plaque. À la fin de l'incubation, aspirez le surnageant et lavez les billes avec deux aliquots de 100 microlitres de tampon de lavage.Après le deuxième lavage, reprendre les billes dans 50 microlitres de PBS contenant du BSA et diluer le rapporteur streptavidine r-phycoérythrine à 24 microgrammes par millilitre dans du PBS contenant du BSA. Ajouter 50 microlitres du rapporteur à chaque puits et mélanger à l’aide d’une pipette. Incuber la plaque à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur, puis effectuer deux lavages avec 100 microlitres de tampon de lavage, comme indiqué.Ensuite, reprendre les billes dans 100 microlitres de PBS additionné de BSA et évaluer les billes couplées à l'antigène sur l'analyseur. Après avoir repris les stocks de billes couplées par vortexage et sonication pendant 20 secondes, diluer les stocks de billes couplées à une concentration finale de 100 billes par microlitre de chaque jeu de billes unique dans du PBS additionné de BSA. Préparer ensuite une dilution d'un à quatre de salive à température ambiante dans du PBS additionné de BSA dans une plaque 96 puits à puits profonds.Humidifiez préalablement une plaque filtrante avec 100 microlitres de tampon de lavage et aspirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes couplées à l'antigène et un volume équivalent de salive diluée dans 95 puits d'une plaque filtrante de 96 puits pour une dilution finale allant de un à huit. Parallèlement, ajoutez 50 microlitres de billes couplées à l'antigène ainsi que 50 microlitres de PBS additionné de BSA seul dans le puits témoin.Incuber les billes à l'abri de la lumière, à température ambiante, pendant une heure sur l'agitateurb plaque à microtitration à 500 tr/min. Ensuite, aspirer le surnageant et laver les puits deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage. Après le deuxième lavage, re-suspendre les billes dans 50 microlitres de PBS contenant du BSA.Effectuez la dilution de l'anticorps secondaire, puis ajoutez 50 microlitres de cette solution dans chaque puits. Après avoir mélangé le contenu des puits à l’aide d’une pipette multicanal, incubez la plaque sur un agitateur, à l’abri de la lumière, pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les puits deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez en suspension les billes dans 50 microlitres de PBS frais contenant du BSA. Diluez maintenant le marqueur et ajoutez 50 microlitres de cette solution dans chaque puits.Mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette multipuits. Après 30 minutes à température ambiante sur agitateur à l’abri de la lumière, laver les puits deux fois comme indiqué, puis resuspendre les billes dans 100 microlitres de PBS contenant du BSA et analyser les échantillons sur l’analyseur. Pour s’assurer que les billes couplées à l’antigène sont capables d’atteindre la gamme dynamique du test, un couplage adéquat est défini comme une intensité de fluorescence moyenne supérieure ou égale à 18 000.Comme le montrent ces confirmations représentatives de couplage des antigènes dans le test pour C.jejuni et T.gondii. Sur la base du seuil établi, les taux d'immunoprévalence des échantillons variaient d'environ 2 % pour T.gondii à près de 50 % pour le groupe génétique 1.1 du Norovirus, indiquant que l'immunoprévalence était la plus élevée pour les Norovirus, suivie par l'hépatite A et H. pylori. Alors que 32 % des échantillons étaient immunonégatifs pour tous les pathogènes du test, 68 % étaient immunopositifs pour un ou plusieurs pathogènes.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en environ quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les billes à l’abri de la lumière afin d’éviter le photoblanchiment. Après cette procédure, d'autres méthodes comme les ELISA et les immunotransferts peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la sensibilité et la spécificité.Ainsi que la réactivité croisée des anticorps. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de l'épidémiologie, de la science de l'exposition et de la microbiologie clinique pour explorer les risques humains liés à des expositions environnementales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière de développer, analyser et interpréter les résultats d'un dosage immuno-enzymatique multiplexe, mesurant simultanément les anticorps dirigés contre plusieurs agents pathogènes.N'oubliez pas que manipuler des fluides corporels et de l'azoture de sodium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés et l'élimination correcte des réactifs doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Grâce à la technologie Luminex Corporation microbille xMAP, nous avons développé le test immunologique multiplexée fluorométrique (MFIA) pour la surveillance de diverses espèces d'animaux de laboratoire. Le MFIA est une micropuce suspension, si l'antigène, le tissu de contrôle ou d'immunoglobulines sont liés de façon covalente à du polystyrène code couleur microsphères. La méthode de test MFIA ainsi que diverses rubriques de dépannage est adressée.

Méthodologie d&#39;essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

Cette vidéo présente une technique d’immunodosage multiplex basée sur des billes pour détecter simultanément des anticorps contre plusieurs agents pathogènes environnementaux dans la salive humaine. Des billes fluorescentes ont été couplées à des antigènes de différents agents pathogènes, qui ont été capturés à l’aide d’anticorps dans l’échantillon de salive humaine. Lors du marquage des anticorps à l’aide d’un rapporteur fluorescent, les billes ont été analysées à l’aide de la cytométrie en...

Un immunodosage multiplex basé sur des billes pour identifier les anticorps spécifiques des agents pathogènes dans la salive

Nous décrivons une procédure pour le profilage de protéines salivaires utilisant multiplexés puces à anticorps à base de microsphères. Les anticorps monoclonaux ont été liés par covalence à 4,5 um microsphères de polymère de colorants fluorescents codé en utilisant la chimie du carbodiimide. Les microsphères modifiées ont été déposés dans des micropuits à fibres optiques pour mesurer les niveaux de protéine dans la salive en utilisant des dosages immunologiques par fluorescence en sandwich.

Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques

Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

Nous présentons ici un protocole visant à décrire le développement et la validation d’une seule molécule tableau numérique analyse d’ELISA, qui permet la détection ultrasensible de tous les sous-types d’IFN-α dans des échantillons humains.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

Cet article présente un protocole pour la détection des immunoglobulines sériques spécifiques E avec un système de chimiluminescence axée sur la cartouche microfluidique et l’évaluation de son utilité dans le diagnostic de l’allergie.

Application des biopuces microfluidiques technologie pour détecter sérum allergène spécifique immunoglobuline E (sIgE)

Nous présentons un protocole pour l'utilisation d'un microarray protéique construit en imprimant des antigènes grippaux sur des lames enduites de nitrocellulose pour sonder simultanément le sérum pour plusieurs isotypes d'anticorps contre plus de 250 antigènes de différentes souches virales, permettant de mesurer l'étendue des anticorps sériques entre les sous-types de virus.

Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

Un système d’analyse de flux pour les essais multiplexés à base de billes qui fournit une lecture à deux rapporteurs a été utilisé pour le développement de tests sérologiques et de neutralisation des anticorps multiplex qui peuvent mesurer simultanément les anticorps IgG et IgM neutralisants pour le SARS-CoV-2.

Un test de neutralisation rapide et multiplex à double rapporteur IgG et IgM SARS-CoV-2 pour un système d’analyse de débit à base de billes multiplexées

Cet article décrit une méthode pratique pour surveiller les changements dynamiques dans les titres d’anticorps pour deux isotypes d’immunoglobulines simultanément (IgA, IgM ou IgG) résultant d’une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. Ce « panel de réponse immunitaire Covid-19 multianalyte » utilise trois immunoessais indirects construits sur des microsphères codées qui sont lues à l’aide d’un lecteur multiplex basé sur le flux avec une capacité « double...

Surveillance dynamique de la séroconversion à l’aide d’un test d’immunobilles multianalytes pour le Covid-19

Un système d’analyse de flux de fluorescence à double rapporteur à trois canaux a été utilisé pour développer un test immunologique multiplex à base de billes qui évalue simultanément les échantillons de sérum pour les IgG et les IgM provoquées par plusieurs antigènes de différentes espèces de Borrelia qui causent la borréliose de Lyme en Europe et en Amérique du Nord.

Détection simultanée de différentes classes d’anticorps dans un test sérologique multiplexé

Les immunodosages à fluorescence multiplex deviennent une référence pour les tests sérologiques. Leur application est toutefois limitée par la complexité et le temps nécessaire des processus de couplage bile-analyte. Ce rapport présente un protocole de couplage de microsphères multiplexes semi-automatisé et reproductible, comparable à la méthode standard, tout en réduisant considérablement le temps d’obtention des résultats.

Un test sérologique multiplex pour la détection des réponses anticorps aux arbovirus

Découvrez l'immunoessai multiplex salivaire basé sur des billes pour mesurer simultanément les anticorps IgG contre plusieurs agents pathogènes environnementaux. Cette méthode permet d'identifier rapidement les sources d'exposition alimentaire, hydrique et aérienne.

Le développement dun anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer lexposition humaine aux agents pathogènes environnementaux (Vidéo) | JoVE Journal

Le développement d'un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l'exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

Explorer plus de vidéos