La détection Colorimétrie visuelle de Multi-nucleotide polymorphismes sur une plate-forme de manipulation pneumatique Droplet

L’objectif global de cette procédure est de combiner une méthode simple de détection visuelle des polymorphismes multinucléotidiques avec une plate-forme de manipulation de gouttelettes pneumatiques. La plate-forme de détection de l’ADN se trouve sur une surface ouverte et est simple à utiliser pour les chercheurs en biochimie. Nous avons étudié un outil simple pour détecter de manière répétée les mutations génétiques et les maladies génétiques.

Il a un plus grand potentiel pour nous aider à comprendre comment la variation génétique conduit à la maladie. Nous avons combiné deux méthodes nouvelles et simples. Le polymorphisme multinucléotidique peut être détecté à l’œil nu et sans aucun instrument supplémentaire sur la plate-forme de manipulation pneumatique des gouttelettes.

La méthode de détection du polymorphisme multinucléotidique sera démontrée par Tzu-Ming Wang, le post-docteur de notre groupe. Pour commencer cette procédure, préparez une solution de 100 micromolaires d’ADN de sonde comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, ajoutez l’ADN de la sonde à une solution d’une OD par millilitre de nanoparticules d’or.

Porter la concentration finale de SDS à 0,01 % et celle de PBS à 0,01 molaire. Laissez la solution incuber pendant 20 minutes. Ensuite, augmentez la concentration de chlorure de sodium à 0,05 molaire en ajoutant une solution de chlorure de sodium à deux molaires et de PBS à 0,01 molaire.

Maintenez la concentration de SDS à 0,01 % et laissez la solution incuber pendant environ 20 minutes. Augmentez la concentration de chlorure de sodium par paliers de 0,1 molaire sur des intervalles de 20 minutes jusqu’à ce qu’une concentration finale d’une molaire soit atteinte. Incuber la solution à 23 degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur.

Une fois que les échantillons d’ADN et les nanoparticules d’or se sont conjugués, centrifugez la solution à 7 000 fois g pendant 30 secondes. Retirez le surnageant. Ensuite, préparez une solution de sonde de nanoparticules d’or de 25 nanomolaires en remettant la pastille en suspension dans de l’eau déminéralisée.

Préparez les échantillons d’ADN cibles comme indiqué dans le protocole textuel. Ajoutez six microlitres de solution de sonde de nanoparticules d’or dans chaque échantillon d’ADN avec du chlorure de sodium. À l’aide d’un mélangeur vortex, agitez chaque solution d’échantillon pendant cinq minutes à 23 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez six microlitres d’hydroxylamine 400 millimolaires et six microlitres d’acide chloroaurique 25,4 millimolaires à chaque solution d’échantillon d’ADN. Mettez ces échantillons de côté car un changement constant de coloration se produira au cours de l’heure suivante. La taille, les propriétés optiques dépendantes de la forme de la nanoparticule, le nombre de décalages dans un fragment d’ADN d’échantillon typiques peuvent être discernés à l’œil nu.

Pour commencer à fabriquer la plate-forme de manipulation des gouttelettes, utilisez une machine à commande numérique par ordinateur équipée d’un foret de 0,5 millimètre pour produire des moules maîtres à base de PMMA avec des microstructures. Pour la perceuse, utilisez une vitesse d’avance de sept millimètres par seconde et une vitesse de rotation de 26 000 tr/min, et inspectez les moules après le perçage. Utilisez un souffleur d’air et de l’eau déminéralisée pour nettoyer la surface des moules maîtres et enlever toute ferraille de PMMA.

Ensuite, préparez un mélange de 10 pour un de base PDMS et d’agent de durcissement. Dégazez le mélange dans un dessiccateur jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées. Ensuite, versez le mélange PDMS dans le moule maître.

Cuire au four pendant trois heures à 60 degrés Celsius pour obtenir les microstructures inverses dans les chambres à air et les canaux d’air. Une fois la cuisson terminée, retirez la couche PDMS du moule principal et percez-y des trous pour les entrées d’aspiration d’air. Utilisez un système de traitement au plasma d’oxygène pour nettoyer la membrane et la couche PDMS.

Après le traitement, collez la membrane PDMS et la couche PDMS, puis percez des trous dans cette structure conjuguée. Ensuite, collez le PDMS et le substrat de verre ensemble à l’aide d’une plaque chauffante à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois les couches collées ensemble, placez la plaque composite dans une machine de découpe laser PDMS, côté membrane vers le haut.

Importez le fichier dwg pour définir la zone super hydrophobe, et notez qu’il sera directement gravé dans la membrane PDMS. Nettoyez la surface superhydrophobe nouvellement gravée avec de l’eau déminéralisée. Cela éliminera tous les résidus carbonisés.

Une fois la surface nettoyée, connectez l’entrée d’aspiration d’air et la pompe à vide via une électrovanne. Ensuite, connectez l’électrovanne à un ordinateur pour la contrôler avec un module USB IO numérique. Une fois la plate-forme de manipulation des gouttelettes pneumatique mise en place, ajoutez 10 microlitres d’ADN cible de 0,5 micromolaire sur la zone superhydrophobe.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de solution de sonde de nanoparticules d’or de 25 nanomolaires fraîchement hybridée à côté de la goutte d’ADN cible. Utilisez un programme simple pour contrôler l’aspiration de l’air vers la plate-forme à l’aide d’une électrovanne. Réglez la pression à moins 80 kilopascals et la fréquence de conduite à cinq hertz.

Fournissez une aspiration le long des chemins de vibration des gouttelettes, ce qui les fait entrer en collision et fusionner. Ensuite, mélangez la gouttelette coalisée en manipulant l’aspiration pour faire rouler l’échantillon pendant trois minutes. Ajoutez deux microlitres d’hydroxylamine 400 millimolaires et deux microlitres d’acide chloroaurique 25,4 millimolaires à la zone superhydrophobe de la plate-forme de manipulation des gouttelettes pneumatiques.

Manipulez l’aspiration de manière à ce que les gouttelettes entrent en collision et fusionnent. Ensuite, mélangez la gouttelette fusionnée en la roulant pendant une minute. Observez la couleur de la gouttelette finale à l’œil nu.

Dans cette étude, les polymorphismes multinucléotidiques sont détectés colorométriquement à l’aide de la croissance médiée par hybridation d’ADN de sondes de nanoparticules d’or. Ici, les échantillons d’ADN possèdent des affinités différentes avec l’ADN de la sonde, provoquant des différences dans la croissance des nanoparticules d’or, considérées comme un changement de couleur. L’échantillon d’ADN non apparié à trois paires de bases a moins d’hybridation que l’ADN entièrement complémentaire, ce qui peut être considéré comme des distinctions notables dans la couleur, en particulier à des concentrations plus élevées.

L’ADN à six bases non appariées a une faible affinité d’hybridation avec la sonde, et donc la taille de croissance des nanoparticules d’or était faible. Cette analyse colorométrique s’avère reproductible lorsque les échantillons sont manipulés via une plate-forme d’aspiration pneumatique, car les résultats de la non-concordance de l’ADN sont facilement observables à l’œil nu. Une fois maîtrisée, l’ensemble de la procédure prend moins de cinq minutes entre l’ajout de l’échantillon et du réactif jusqu’au résultat de ceux-ci, ce qui est beaucoup plus rapide que la méthode traditionnelle.

Le total de chaque opération n’est que de 10 microlitres, ce qui est nettement inférieur à ce qui est requis dans un grand système. Suite à cette procédure, une fois que la variation de séquence de l’espace du fragment d’ADN est confirmée comme étant responsable d’une maladie spécifique. Le produit spécialement conçu peut être utilisé pour acquérir un certain nombre de discordances de l’ADN de l’échantillon.

La plate-forme de manipulation pneumatique des gouttelettes est plus biocompatible que d’autres méthodes telles que la pondération optique, l’électrofluorescence de colorant, l’électro-pondération et l’actionnement capillaire de Shoomoo. La méthode de détection du polymorphisme multinucléotidique proposée a été réalisée sous une plate-forme de manipulation de gouttelettes pneumatiques, ce qui signifie que les échantillons et les réactifs peuvent être directement chargés et collectés à l’aide d’une pipette. Après son développement, cette technique a un fort potentiel pour le criblage de l’ADN et d’autres applications chimiques et biomatiques.