Conception et utilisation d'un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

L'objectif général de cette expérience est de caractériser la voie évolutionnaire de la résistance aux antibiotiques à l'aide d'un morbidostat qui surveille en continu la croissance bactérienne et ajuste dynamiquement la concentration en antibiotique au fur et à mesure que les bactéries acquièrent une résistance au médicament. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le dispositif est constitué de composants électroniques peu coûteux et facilement accessibles, et peut être facilement reconfiguré selon des besoins spécifiques. Les procédures seront démontrées par Po Cheng Liu et Yi Tai Lee, tous deux étudiants diplômés de mon laboratoire.

Pour assembler le morbidostat, commencez par utiliser une aiguille de 18 gauge pour percer trois trous dans le bouchon du flacon de culture. Coupez trois morceaux de tube en polyéthylène d'environ sept centimètres de longueur et insérez-les dans les trous du bouchon. Utilisez du ruban adhésif pour enrouler le bord du bouchon, servant ainsi de moule au mélange de polydiméthylsiloxane, ou PDMS.

Ensuite, ajoutez cinq grammes du composant A et 0,5 gramme du composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 millilitres et utilisez un cure-dent pour mélanger manuellement. Chargez le mélange dans une seringue de 10 millilitres. Puis, à l’aide de la seringue, injectez le mélange de PDMS sur le bouchon.

Faites cuire l'ensemble du capuchon à 70 degrés Celsius pendant huit heures pour polymériser le PDMS. Ensuite, à l’aide d’un fer à souder, soudez l’anode de la DEL avec un fil de calibre 24 et la cathode de la DEL avec la résistance en carbone. Puis soudez une résistance en carbone de 680 Ohms avec un fil de calibre 24.

Utilisez du ruban isolant pour isoler la connexion des fils. Soudez le collecteur du photodétecteur avec un fil de calibre 24 et l'émetteur du photodétecteur avec une résistance en carbone de 100 ohms. Ensuite, utilisez du ruban isolant pour isoler la connexion des fils.

Placez la diode électroluminescente dans le support de tube de culture. En suivant le schéma du circuit illustré ici, connectez la diode électroluminescente et utilisez une alimentation de cinq volts pour l'alimenter. Vérifiez le bon fonctionnement de la DEL à l'aide d'une caméra numérique capable de détecter l'IR. Placez ensuite le photodétecteur dans le support de tube de culture.

Ensuite, en suivant le schéma, reliez le photodétecteur et alimentez-le à l’aide d’une alimentation de cinq volts. Connectez le fil aux deux extrémités des résistances du photodétecteur afin de mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique. Collez un aimant sur l’arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d’unité d’agitation magnétique.

Étant donné que l'unité d'agitation magnétique est constituée de l'aimant et du ventilateur de refroidissement, il est essentiel d'aligner l'étagère du ventilateur avec le flacon de culture. De plus, la distance entre le flacon de culture et l'aimant est très critique pour assurer un fonctionnement stable. Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture au morceau correspondant de tube en silicone pour les micro-pompes, les flacons de milieu et le flacon de déchets.

Mettre en marche la pompe pendant une heure et mesurer le volume total transféré du flacon de milieu au flacon de culture afin de déterminer le débit de la pompe. Le débit de pompage typique doit être d'environ quatre millilitres par heure, ce qui correspond à un taux de dilution D égal à 0,33 par heure pour un volume de travail de 12 millilitres dans le flacon de culture. Une fois l'installation terminée, placer l'ensemble sur un incubateur agitateur de taille moyenne.

Pour tester au préalable le Morbidostat, réglez la tension d'alimentation du ventilateur de refroidissement à cinq volts afin de mettre en marche son moteur et tester l'agitateur magnétique. Après avoir préparé une série d'échantillons d'E. coli et tracé une courbe de calibration conformément au protocole décrit dans le texte, préparez le flacon de culture avec trois morceaux de tubing Tygon ultrarésistant aux produits chimiques mesurant chacun sept centimètres de long, ayant un diamètre intérieur de 1/32 pouce et un diamètre extérieur de 3/32 pouces, destinés aux entrées pour former l'appareil. Préparez le milieu minimal M9 contenant 0,2 % de glucose ainsi que le milieu M9 contenant le médicament triméthoprime ou TMP.

Ensuite, stériliser le milieu, la bouteille de milieu, la bouteille de milieu contenant le médicament, la bouteille de déchets et le flacon de culture dans un autoclave à 121 degrés Celsius. Le premier jour de l'expérience, décongeler un millilitre de cellules congelées d'*E. coli* sauvage MG1655 à température ambiante pendant cinq minutes et transférer 120 microlitres des cellules dans un flacon de culture contenant environ 12 millilitres de milieu de croissance M9. Allumer l'incubateur agitateur et régler la température à 30 degrés Celsius sans agitation.

Démarrer le fonctionnement du morbidostat en mettant en marche la micro-pompe, l'unité d'agitation magnétique et la mesure de la densité optique. Après environ 23 heures, arrêter la micro-pompe en coupant sa tension d'alimentation et sortir le flacon de culture. Ajouter 15 % de glycérol dans le flacon de culture et congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour stockage.

Il est également important de passer à un nouveau flacon de culture en début d'expérience afin d'éviter la formation de biotine. Sinon, la formation de biotine peut survenir en deux ou trois jours. Après décongélation de l'échantillon quotidien congelé à température ambiante pendant cinq minutes, ensemencer un nouveau tube à essai avec du milieu M9 frais.

Placer l'échantillon dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, diluer l'échantillon microbien d'un facteur dix à l'aide de milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en appliquant une pression de cinq PSI sur le contenant de l'échantillon microbien. Ensuite, charger le milieu contenant le TMP dans la puce en appliquant une pression de cinq PSI sur le contenant de M9 avec TMP.

Effectuez le mélange entre le microbe et le médicament en actionnant la vanne micro-mécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 minutes. Placez finalement la puce microfluidique dans l’enceinte d’incubation du microscope fixée sur le microscope inversé. À l’aide d’une caméra CCD, acquérez des images des cellules dans la chambre de croissance toutes les heures pendant huit heures.

Calculer les données relatives au nombre de cellules conformément au protocole décrit dans le texte. Les opérations courantes du morbidostat, notamment l'évolution expérimentale, le test de sensibilité aux antibiotiques et l'analyse de la morphologie cellulaire, ont été validées à l'aide d'une culture d'Escherichia coli MG1655 exposée à l'antibiotique TMP, qui induit une augmentation progressive et caractéristique de la résistance au médicament, associée à des mutations regroupées autour du gène de la dihydrofolate réductase, ou DHFR. Chaque jour, on s'attend à ce que le microbe atteigne une densité optique supérieure au seuil prédéfini, déclenchant ainsi l'injection du médicament, comme indiqué ici.

On s'attend à ce que l'injection du médicament inhibe la croissance et, par conséquent, diminue la densité optique. Ce graphique montre l'augmentation temporelle de la résistance à l'antibiotique dans une expérience visant à déterminer la CI50. La résistance au médicament a augmenté d'environ 1500 fois, atteignant 1 000 microgrammes par millilitre en environ 12 jours.

Conformément aux résultats précédents, les mutations ponctuelles de DHFR chez le mutant du dernier jour ont été mesurées par séquençage de Sanger et sont indiquées dans ce tableau. L'acquisition d'une résistance au médicament par l'accumulation de mutations multiples démontre l'utilité du Morbidostat.

Comme la sélection sur des plaques d'agar contenant le médicament tend à conférer uniquement une mutation unique, cette figure affiche les courbes de croissance sur puce à différentes concentrations de TMP. Les échantillons mutants montrent une augmentation significative de la résistance à l'antibiotique.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier la position de la résistance aux antibiotiques dans un environnement de laboratoire sous contrôle réel. Après cette procédure, d'autres mesures, comme la mesure microfluidique de cellules uniques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si la morphologie persiste ou change en raison de l'exposition aux médicaments antibiotiques. Une fois maîtrisé, cet appareil peut être facilement reconfiguré pour toutes les expériences de culture bactérienne, telles que la cultivation d'un signe de bactéries ou l'augmentation du niveau de tolérance au coût d'une souche bactérienne.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier l'acquisition de la résistance aux antibiotiques dans une expérience réelle d'évolution adaptative en laboratoire sous contrôle. N'oubliez pas de manipuler les bactéries résistantes aux médicaments conformément aux règles de biosécurité en vigueur pour la pratique microbiologique. Une autorisation spéciale peut être requise pour une expérience impliquant l'entraînement de base de bactéries.