Name: Conception et utilisation dun faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Découvrez comment utiliser un morbidostat à faible coût pour étudier l'évolution de la résistance antibiotique chez les bactéries. Cette méthode permet un ajustement dynamique des concentrations de médicaments en temps réel.

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Les auteurs tiennent à remercier le professeur Sze-Bi Hsu et Mme Zhenzhen pour leurs discussions utiles et leur aide dans l’analyse théorique et la simulation numérique. Y. T. Y. tient à remercier le ministère des Sciences et de la Technologie sous les numéros de subvention MOST 103-2220-E-007-026 et MOST 104-2220-E-007-011, ainsi que l’Université nationale de Tsing Hua sous les numéros de subvention 103N2042E1, 104N2042E1 et 105N518CE1.

Assemblée 1. et prétest de l&#39;appareil Morbidostat <ol><li> Assemblée de la Morbidostat <ol><li> Poinçonner des trous 3 sur le bouchon du flacon de culture avec une aiguille de seringue 18 G. Couper trois morceaux de tube en polyéthylène ~ 7 cm de longueur. Insérez ces trois morceaux de tuyaux en polyéthylène sur le bouchon. </li><li> Utilisez du ruban adhésif pour envelopper le bord de la capsule pour servir le casting pour le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS). Mélanger 5 g de composant A et 0,5 g de composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 ml en agitant manuellement à l&#39;aide d&#39;un cure-dent. Charger le mélange dans une seringue de 10 ml. <ol><li> Verser le mélange PDMS sur le bouchon avec la seringue. Cuire l&#39;ensemble de bouchon pour guérir les PDMS pendant 8 heures dans le four à 70 ° C. </li></ol></li><li> Soudez l&#39;anode LED avec le fil de calibre 24 et la cathode LED avec la résistance de carbone avec un fer à souder. Soudez une résistance de 680 Ω de carbone avec un G fil 24. Isolez la connexion de fil à l&#39;aide du ruban électrique. </li><li> Alorslder le collecteur du photo-détecteur avec le G fil 24 et l&#39;émetteur du photodétecteur avec une résistance de 100 kQ de carbone. Isolez la connexion de fil à l&#39;aide du ruban électrique. </li><li> Placez la diode émettant de la lumière dans le support de la culture de flacon. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez la diode électroluminescente et la puissance avec une alimentation de 5 V. Assurez -vous que la LED fonctionne en utilisant un appareil photo numérique qui permet de détecter IR (par exemple, une caméra de téléphone mobile). </li><li> Placer le photodétecteur dans le support de flacon de culture. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez le photodétecteur et la puissance avec une alimentation de 5 V. Branchez le fil sur les deux côtés des résistances photodétecteurs pour mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique. </li><li> Coller un aimant sur l&#39;arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d&#39;unité d&#39;agitation magnétique. A noter que le alignement de l&#39;arbre du ventilateur dans le flacon de culture, et l&#39;espacement entre la fiole de culture et l&#39;aimant est très critique pour le bon fonctionnement de l&#39;unité d&#39;agitation magnétique. </li><li> Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture dans le morceau de tube en silicone correspondant pour les micro-pompes, bouteilles moyennes, et une bouteille de déchets. Tournez sur la pompe pendant 1 heure et mesurer le volume total pompé de la bouteille moyenne dans le flacon de culture pour déterminer le débit de la pompe. Notez que le taux de pompage typique devrait être ~ 4 ml / h, ce qui correspond au taux de dilution D = 0,33 h -1 pour un 12 ml de volume de la fiole de culture de travail. </li><li> Placez tout l&#39;ensemble sur une taille moyenne (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Agitateur incubateur. </li></ol></li><li> Prétest l&#39;Morbidostat <ol><li> Set tension d&#39;alimentation du ventilateur cool de 5 V pour démarrer son moteur à tester la barre d&#39;agitation magnétique. Notez que l&#39;action d&#39;agitation peut être inspecté visuellement. La tension qui conduisents le moteur du ventilateur de refroidissement est contrôlée avec précision par la largeur d&#39;impulsion (PWM). </li><li> Préparer une série de type sauvage E. coli échantillons ayant une densité optique à 600 nm allant généralement de 0,07 à 0,3 pour l&#39; étalonnage. Placez un test E. échantillon coli dans le flacon de culture et d&#39; enregistrer la tension de photodétecteurs. <ol><li> Placer ~ 100 ul du même échantillon dans le lecteur de plaque et enregistrer la densité optique. Utiliser la tension du photodétecteur en fonction des données de densité optique pour tracer la courbe d&#39;étalonnage. Notez que généralement, un changement d&#39;unité de densité optique correspond à ~ 7,6 V changement dans le photodétecteur avec le schéma de polarisation utilisé ici. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Exécution de l&#39;Morbidostat <ol><li> Préparation Avant de commencer l&#39;expérience quotidienne <ol><li> Préparer le flacon de culture avec trois ultra-résistants aux produits chimiques tubings Tygon avec diamètre intérieur 1/32 pouce et le diamètre extérieur de 3/32 pouce pour les entrées pour former le dispositif de l&#39;article1.1 et à la figure 1 supplémentaire. </li><li> Préparer le milieu minimum M9 (0,2% de glucose) et le triméthoprime (TMP) médicaments contenant du milieu. Stériliser le milieu, la bouteille moyenne, le milieu bouteille de médicament, le flacon de récupération, et le flacon de culture dans un autoclave à 121 ° C. NOTE: Le TMP est une solution de réserve qui est utilisée pour obtenir plus tard , les concentrations dans le tableau 1 et le médicament TMP contenant du milieu ne sont pas autoclavé. </li></ol></li><li> Exécution de l&#39;Morbidostat <ol><li> Le premier jour de l&#39;expérience, dégeler 1 ml de type sauvage congelé E. coli MG1655 cellules pendant 5 min à température ambiante , et le transfert de 120 ul de cellules dans le flacon de culture contenant ~ 12 ml de milieu de culture M9. Après le premier jour, décongeler 1 ml de E. congelées coli , des cellules de la veille pendant 5 min et le transfert de 120 ul des cellules à un nouveau flacon de culture contenant environ 12 ml de milieu de culture M9. </li><li> Allumez l&#39;incubateur shaker et régler le tempeh<html> rature à 30 ° C sans agitation. </li><li> Démarrer l&#39;opération de morbidostat en activant la micro-pompe, l&#39;unité d&#39;agitation magnétique et la mesure de la densité optique. Remarque: Au cours de l&#39;opération, un algorithme de seuil de contre-réaction est utilisé pour commander l&#39;injection du médicament. Lorsque la densité optique mesurée dépasse un seuil prédéterminé, la pompe d&#39;injection de médicament serait activé et la pompe à fluide soit mis hors tension. Dans le cas contraire, la pompe d&#39;injection de médicament reste éteint et la pompe à fluide est activée. </li><li> Surveiller la tension de temps à autre pour qu&#39;il y ait une croissance microbienne. Remarque: En raison du gel et du dégel du cycle, E. coli cellules présentent un retard de ~ 4 h au cours de la croissance de chaque jour. </li><li> Après ~ 23 h, arrêter le micro-pompe en éteignant sa tension d&#39;alimentation et retirez le flacon de culture. Ajouter 15% de glycérol dans le flacon de culture et congeler l&#39;échantillon à -80 ° C pour le stockage. </li><li> Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Antibiotique Susceptibilité Mesure dans 96 puits Format REMARQUE: Effectuez la mesure du taux de croissance dans un lecteur de plaque avec un format de 96 puits pour déterminer le niveau de résistance aux antibiotiques. <ol><li> Décongeler l&#39;échantillon congelé par jour à la température ambiante pendant 5 minutes et transférer 15 pl de la cellule dans le flacon de culture contenant environ 15 ml de milieu M9. Leur permettre de se développer jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,1. Diviser les 15 ml dans des flacons de 1 ml et ajouter le médicament TMP à cette étape pour obtenir les concentrations désirées de médicament comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Prendre 200 pi de l&#39;échantillon de l&#39; étape 3.1 et la place dans chaque puits dans le lecteur de plaque et leur permettre de se développer pendant 12 h 5. La densité optique à une longueur d&#39;onde de 600 nm est automatiquement enregistrée pendant la mesure. NOTE: Pour chaque point de données, les mesures sont enregistrées en triple et en moyenne pour assurer la cohérence des données. Les données sur la densité optique en fonction du temps peut be utilisée pour obtenir le taux de croissance. </li><li> Tracer les données de taux de croissance par rapport à la concentration du médicament pour obtenir IC50. A noter que la CI50 est définie comme la concentration de médicament à laquelle le taux de croissance est de cinquante pour cent du taux de croissance maximal 5. </li></ol> 4. Single Cell Morphologie et sensibilité aux antibiotiques dans la mesure dispositifs microfluidiques <ol><li> Effectuer la fabrication des dispositifs microfluidiques par lithographie douce multicouche de PDMS comme décrit ailleurs 15. <ol><li> Utilisez photolithographie pour faire le moule de résine photosensible pour les couches de contrôle et de débit. Notez que pour la couche de contrôle, utilisez photorésist négatif (~ 15 um de hauteur) et résine photosensible positive (~ 8 pm hauteur) pour produire un moule sur une plaquette de silicium nue. </li><li> Préparer des mélanges de PDMS avec des rapports de reticulation de 5: 1 et 20: 1 pour la couche de contrôle et la couche d&#39;écoulement, respectivement. Mettez les mélanges dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bullesPendant 1 h. </li><li> Exposer les moules couche de résine photosensible de contrôle sur la plaquette de silicium à triméthylchlorosilane (TMCS) vapeur. Rendre la couche de contrôle de l&#39;épaisseur ~ 6 mm par coulée du mélange PDMS (avec un rapport de réticulation 5: 1) sur la plaquette de silicium sur la couche surmoulée contrôle de résine photosensible. Cuire la couche de commande pendant 40 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four. </li><li> Rendre la couche d&#39;écoulement par revêtement par centrifugation d&#39;un mélange de PDMS (avec un rapport reticulation 20: 1, la vitesse de rotation de 3000 rpm pendant 60 secondes) sur un moule de résine photosensible couche d&#39;écoulement. Cuire la couche d&#39;écoulement pendant 30 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four. </li><li> Utilisez une lame de rasoir pour couper la couche de contrôle dans la taille de la puce souhaitée (typiquement 3 cm x 2 cm) et manuellement décoller la couche de contrôle. Placez la couche de contrôle sur le dessus de la couche d&#39;écoulement et les aligner sous un stéréomicroscope. Durcir l&#39;ensemble aligné à 80 ° C pendant une nuit dans le four. Ensuite, faire tremper l&#39;ensemble dans 250 ml d&#39;eau déminéralisée dans un récipient en plastique pendant 5 heures pour dissoudre le TMCS résiduel. </li><li> Par la suite, poinçonner les trous d&#39;entrée avec 20 g d&#39;aiguilles et de lier l&#39;ensemble élastomère sur une lame de verre recouverte d&#39;une couche de PDMS ébauche (PDMS réticulation rapport 5: 1, vitesse de rotation 2000 tours par minute pendant 30 secondes), par traitement par plasma d&#39;air pendant 40 secondes à 1.2 pression d&#39;air Torr. </li><li> Effectuer une vaste cuisson pendant 36 heures à 80 ° C pour réduire les effets cytotoxiques de PDMS. A noter que cette étape de cuisson est crucial pour minimiser la toxicité pour les cellules bactériennes. </li></ol></li><li> On Chip Growth Experiment <ol><li> Avant de charger dans le dispositif microfluidique, rincer avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 1 heure et moyenne M9 pendant 1 h. </li><li> Décongeler l&#39;échantillon congelé tous les jours à la température ambiante pendant 5 min et inoculer un nouveau tube à essai avec un milieu M9 frais. Placer l&#39;échantillon dans un incubateur agitateur à 37 ° C pendant une nuit. </li><li> Diluer l&#39;échantillon 10 fois microbienne avec un milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en faisant pression sur le récipient d&#39;échantillon microbienne à 5 psi. Chargez ensuite le médicament TMPmoyen dans la puce en faisant pression sur le récipient milieu de médicament à 5 psi. Exécuter le mélange entre le microbe et de médicament par actionnement de la valve micromécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 min. </li><li> Placez la puce microfluidique dans l&#39;incubateur de microscope monté sur le microscope inversé. Acquérir l&#39;image de cellules dans la chambre de croissance à chaque heure pendant 8 heures avec la caméra CCD montée sur le microscope inversé. </li><li> Utiliser le script de programme personnalisé pour calculer le nombre de cellules par l&#39; intermédiaire d&#39; un algorithme de seuil sur les données d&#39;image de la cellule 18. A noter que les données de numéros de cellule sont typiquement en moyenne plus de trois chambres microfluidiques. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un dispositif de morbidostat faible encombrement à partir de composants à faible coût est démontrée. Les augmentations du niveau de résistance aux médicaments enregistrés par l&#39;appareil sont identiques à ceux des rapports précédents 5. Conçu pour les études évolutives de la résistance aux médicaments, le dispositif est potentiellement applicable à beaucoup d&#39;autres expériences. Tout d&#39;abord, une base de données complète des mutations induites par les médicaments peut être établie pour un grand nom...

Depuis l&#39;introduction de la première pénicilline médicament antibiotique, la résistance aux antibiotiques microbienne est devenue un problème de santé mondial 1. Bien que l&#39;acquisition d&#39; une résistance aux antibiotiques peut être étudié rétrospectivement in vivo, les conditions de ces expériences sont souvent pas contrôlés tout au long de l&#39; évolution 2. En variante, l&#39; évolution de laboratoire adaptatif peut révéler l&#39;évolution moléculaire d&#39;une espèce microbienne sous contraintes de l&#39; environnement ou de la pression de sélection d&#39;un médicament antibiotique 3. Récemment, de nombreuses expériences d&#39;évolution bien contrôlée de la résistance aux antibiotiques ont élucidé l&#39;émergence de la résistance aux antibiotiques. Par exemple, le groupe d&#39;Austin a démontré l&#39; émergence rapide dans un environnement compartimenté de microfluidique correctement conçu 4. Le morbidostat développé récemment induit des mutations systématiques sous la pression de la sélection des médicaments 5,6. Le morbidostat, une sélec microbiennedispositif de tion qui ajuste en continu la concentration en antibiotique pour maintenir une population à peu près constante, constitue une avancée majeure dans le test de fluctuation utilisée en microbiologie 7,8. Dans le test de fluctuation, un médicament antibiotique est injecté à une concentration élevée, et les mutants survivants sont criblés et comptés. Au lieu de cela, les microbes dans un morbidostat sont constamment remises en question et d&#39;acquérir de multiples mutations. Le morbidostat fonctionne de façon similaire à la chémostat, un dispositif de culture inventé par Novick et Szliard en 1950 qui maintient une population constante par apport continu de nutriments alors que la dilution de la population microbienne 9. Depuis son introduction, le chemostat a été avancée et améliorée. chémostats microfluidiques actuelles ont atteint des capacités de nanolitre et une seule cellule. Cependant, ces dispositifs ne sont pas appropriés pour des expériences d&#39;évolution adaptative, qui nécessitent une grande population de cellules avec de nombreux événements de mutation 10,11. Récemment, mini-chémostats avec des volumes de travail de ~ 10 ml ont également été développés pour combler l&#39;écart entre le litre bioréacteurs à l&#39;échelle et la microfluidique chemostat 12,13. Ici, nous présentons la conception et l&#39;utilisation d&#39;un faible coût, morbidostat automatisé pour une étude de résistance aux antibiotiques de la drogue. Le module proposé peut être utilisé dans un incubateur à agitateur dans un laboratoire de microbiologie à l&#39;exigence d&#39;un minimum de matériel. Le firmware open-source est également facilement adapté à des applications spécifiques de l&#39; évolution adaptative, tels que l&#39; ingénierie métabolique 3. Enfin, le morbidostat est intégré dans une plate - forme microfluidique multiplexé pour les tests de sensibilité aux antibiotiques 14.

<table><tbody><tr><td>Incubateur Shaker</td><td>Environnemental BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo Board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Résistance Carbone</td><td>Digikey</td><td></td><td>Résistance Bias pour LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Résistance Carbone</td><td>Digikey</td><td></td><td>Résistance Bias pour phototransistor</td></tr><tr><td>940 nm Diode électroluminescente</td> LED <td>lumineuse Électronique</td><td>BIR-BM13E4G-2 Mesure de</td><td>la densité optique</td></tr><tr><td>940 nm phototransistor</td><td>Kodenshi&nbsp ;</td><td>ST-2L2B</td><td>Mesure de densité optique</td></tr><tr><td>Darlington paire IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>ce circuit intégré entraîne des micropompes et une unité d’agitation magnétique</td></tr><tr><td>Ventilateur brushless 5 V DC</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spécifications : tension d’alimentation 5 V et 80&nbsp ; maman; disponible www.jameco.com</td></tr><tr><td>Micropompe piézoélectrique</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pression > 3&nbsp ; kPa ; Débit >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID : 1/32 » OD : 3/32 » L :50'&nbsp ;</td></tr><tr><td>Barre d’agitation magnétique</td><td>COWIE</td><td></td><td>forme conique dim : 10&nbsp ; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Flacon de verre à scintillation de 20 ml Verre</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex 28 mm (diamètre) x 61 mm (hauteur)</td></tr><tr><td>Porte-flacon</td><td></td><td></td> de culture <td>Fabriqué sur mesure en polyformaldéhyde&nbsp ;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>utilisé pour sceller le flacon en verre</td></tr><tr><td>Bouteille moyenne</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 sel minimal 5x</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide cadamino</td><td>moyen BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>moyen Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Batériologique</td><td>Oxoid</td><td></td><td>pour plaque de gélose</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>DMI-LED</td><td>utilisé pour la mesure microfluidique Utilisation Objectif 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Microscope Incubateur</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>utilisé pour la mesure microfluidique</td></tr><tr><td>Électrovannes</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalement ouvert 1,3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>Carte d’interface USB</td><td>Hobby Engineering</td><td>Module d’E/S numériques USBIO24-R&nbsp ;</td><td>pour la mesure microfluidique</td></tr><tr><td>Compresseur d’air</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Source de pression pour microfluidiques ; Pression max. 80 psi</td></tr><tr><td>Raccords Luer-lock mâles à ValuePlastics.com cannelés 1/8 »</td><td></td><td>MTLL230-1</td><td>utilisés pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Cannelures 1/8 » à 10-32 orifices</td><td>filetés</td><td>ValuePlastics.com B-1</td><td>utilisés pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Raccords Luer-lock femelles à orifice</td> <td>fileté 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&nbsp ; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>10 kOhm, résistance à film de carbone, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Condensateur au tantale, 10&nbsp ; &mu ; F, 25 V, 10 %</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Caméra CCD Andor Zyla</td><td></td><td>4.2 Plus SCMOS</td><td>utilisée pour l’imagerie microfluidique sur puce</td></tr><tr><td>Lecteur</td><td></td><td></td><td></td>de plaque ELISA</tr><tr><td>à deux composants Silicone&nbsp ;</td><td>Minuteive</td><td>RTV 615</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>AZ4620 photoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Nettoyant plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Aiguille de seringue de calibre 20</td><td>BD</td><td></td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>ADN polymérase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>Amplification PCR</td></tr><tr><td>Triméthoprime</td><td>Sigma Lecteur de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaques</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp ;</td><td>Mesure de la résistance aux antibiotiques</td></tr></tbody></table>

conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé morbidostat pour adaptive evolution des bactéries sous sélection des médicaments antibiotiques

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Nous décrivons un faible coût, morbidostat configurable pour caractériser la voie de l&#39;évolution de la résistance aux antibiotiques. Le morbidostat est un dispositif de culture bactérienne qui surveille en permanence la croissance bactérienne et ajuste la concentration du médicament à récuser en permanence les bactéries à mesure qu&#39;ils évoluent pour acquérir une résistance aux médicaments de façon dynamique. L&#39;appareil dispose d&#39;un volume de travail de ~ 10 ml et est entièrement automatisé et équipé de la mesure de la densité optique et micro-pompes à moyen et à la délivrance de médicaments. Pour valider la plate - forme, nous avons mesuré l&#39;acquisition progressive de la résistance triméthoprime dans Escherichia coli MG 1655 et intégré de l&#39;appareil avec une plate - forme microfluidique multiplexé pour étudier la morphologie des cellules et la sensibilité aux antibiotiques. L&#39;approche peut être mise à échelle des études de laboratoire de la résistance aux antibiotiques, et est prorogeable adaptatifs évolution des améliorations de contrainte dans l&#39;ingénierie métabolique et d&#39;autres expériences de culture bactérienne.

Le morbidostat décrit ci-dessus est schématisé sur la figure 1. Les opérations de morbidostat communes, y compris l&#39; évolution expérimentale, test de sensibilité aux antibiotiques et la morphologie des cellules de vérification, ont été validées dans un E. culture coli MG1655 exposée au triméthoprime (TMP), un médicament antibiotique couramment utilisé 5,6. TMP induit par étapes augmente très distinctives dans la résistance aux médicaments...

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

L'objectif général de cette expérience est de caractériser la voie évolutionnaire de la résistance aux antibiotiques à l'aide d'un morbidostat qui surveille en continu la croissance bactérienne et ajuste dynamiquement la concentration en antibiotique au fur et à mesure que les bactéries acquièrent une résistance au médicament. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le dispositif est constitué de composants électroniques peu coûteux et facilement accessibles, et peut être facilement reconfiguré selon des besoins spécifiques. Les procédures seront démontrées par Po Cheng Liu et Yi Tai Lee, tous deux étudiants diplômés de mon laboratoire.Pour assembler le morbidostat, commencez par utiliser une aiguille de 18 gauge pour percer trois trous dans le bouchon du flacon de culture. Coupez trois morceaux de tube en polyéthylène d'environ sept centimètres de longueur et insérez-les dans les trous du bouchon. Utilisez du ruban adhésif pour enrouler le bord du bouchon, servant ainsi de moule au mélange de polydiméthylsiloxane, ou PDMS.Ensuite, ajoutez cinq grammes du composant A et 0,5 gramme du composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 millilitres et utilisez un cure-dent pour mélanger manuellement. Chargez le mélange dans une seringue de 10 millilitres. Puis, à l’aide de la seringue, injectez le mélange de PDMS sur le bouchon.Faites cuire l'ensemble du capuchon à 70 degrés Celsius pendant huit heures pour polymériser le PDMS. Ensuite, à l’aide d’un fer à souder, soudez l’anode de la DEL avec un fil de calibre 24 et la cathode de la DEL avec la résistance en carbone. Puis soudez une résistance en carbone de 680 Ohms avec un fil de calibre 24.Utilisez du ruban isolant pour isoler la connexion des fils. Soudez le collecteur du photodétecteur avec un fil de calibre 24 et l'émetteur du photodétecteur avec une résistance en carbone de 100 ohms. Ensuite, utilisez du ruban isolant pour isoler la connexion des fils.Placez la diode électroluminescente dans le support de tube de culture. En suivant le schéma du circuit illustré ici, connectez la diode électroluminescente et utilisez une alimentation de cinq volts pour l'alimenter. Vérifiez le bon fonctionnement de la DEL à l'aide d'une caméra numérique capable de détecter l'IR. Placez ensuite le photodétecteur dans le support de tube de culture.Ensuite, en suivant le schéma, reliez le photodétecteur et alimentez-le à l’aide d’une alimentation de cinq volts. Connectez le fil aux deux extrémités des résistances du photodétecteur afin de mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique. Collez un aimant sur l’arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d’unité d’agitation magnétique.Étant donné que l'unité d'agitation magnétique est constituée de l'aimant et du ventilateur de refroidissement, il est essentiel d'aligner l'étagère du ventilateur avec le flacon de culture. De plus, la distance entre le flacon de culture et l'aimant est très critique pour assurer un fonctionnement stable. Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture au morceau correspondant de tube en silicone pour les micro-pompes, les flacons de milieu et le flacon de déchets.Mettre en marche la pompe pendant une heure et mesurer le volume total transféré du flacon de milieu au flacon de culture afin de déterminer le débit de la pompe. Le débit de pompage typique doit être d'environ quatre millilitres par heure, ce qui correspond à un taux de dilution D égal à 0,33 par heure pour un volume de travail de 12 millilitres dans le flacon de culture. Une fois l'installation terminée, placer l'ensemble sur un incubateur agitateur de taille moyenne.Pour tester au préalable le Morbidostat, réglez la tension d'alimentation du ventilateur de refroidissement à cinq volts afin de mettre en marche son moteur et tester l'agitateur magnétique. Après avoir préparé une série d'échantillons d'E. coli et tracé une courbe de calibration conformément au protocole décrit dans le texte, préparez le flacon de culture avec trois morceaux de tubing Tygon ultrarésistant aux produits chimiques mesurant chacun sept centimètres de long, ayant un diamètre intérieur de 1/32 pouce et un diamètre extérieur de 3/32 pouces, destinés aux entrées pour former l'appareil. Préparez le milieu minimal M9 contenant 0,2 % de glucose ainsi que le milieu M9 contenant le médicament triméthoprime ou TMP.Ensuite, stériliser le milieu, la bouteille de milieu, la bouteille de milieu contenant le médicament, la bouteille de déchets et le flacon de culture dans un autoclave à 121 degrés Celsius. Le premier jour de l'expérience, décongeler un millilitre de cellules congelées d'*E. coli* sauvage MG1655 à température ambiante pendant cinq minutes et transférer 120 microlitres des cellules dans un flacon de culture contenant environ 12 millilitres de milieu de croissance M9. Allumer l'incubateur agitateur et régler la température à 30 degrés Celsius sans agitation.Démarrer le fonctionnement du morbidostat en mettant en marche la micro-pompe, l'unité d'agitation magnétique et la mesure de la densité optique. Après environ 23 heures, arrêter la micro-pompe en coupant sa tension d'alimentation et sortir le flacon de culture. Ajouter 15 % de glycérol dans le flacon de culture et congeler les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour stockage.Il est également important de passer à un nouveau flacon de culture en début d'expérience afin d'éviter la formation de biotine. Sinon, la formation de biotine peut survenir en deux ou trois jours. Après décongélation de l'échantillon quotidien congelé à température ambiante pendant cinq minutes, ensemencer un nouveau tube à essai avec du milieu M9 frais.Placer l'échantillon dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, diluer l'échantillon microbien d'un facteur dix à l'aide de milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en appliquant une pression de cinq PSI sur le contenant de l'échantillon microbien. Ensuite, charger le milieu contenant le TMP dans la puce en appliquant une pression de cinq PSI sur le contenant de M9 avec TMP.Effectuez le mélange entre le microbe et le médicament en actionnant la vanne micro-mécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 minutes. Placez finalement la puce microfluidique dans l’enceinte d’incubation du microscope fixée sur le microscope inversé. À l’aide d’une caméra CCD, acquérez des images des cellules dans la chambre de croissance toutes les heures pendant huit heures.Calculer les données relatives au nombre de cellules conformément au protocole décrit dans le texte. Les opérations courantes du morbidostat, notamment l'évolution expérimentale, le test de sensibilité aux antibiotiques et l'analyse de la morphologie cellulaire, ont été validées à l'aide d'une culture d'Escherichia coli MG1655 exposée à l'antibiotique TMP, qui induit une augmentation progressive et caractéristique de la résistance au médicament, associée à des mutations regroupées autour du gène de la dihydrofolate réductase, ou DHFR. Chaque jour, on s'attend à ce que le microbe atteigne une densité optique supérieure au seuil prédéfini, déclenchant ainsi l'injection du médicament, comme indiqué ici.On s'attend à ce que l'injection du médicament inhibe la croissance et, par conséquent, diminue la densité optique. Ce graphique montre l'augmentation temporelle de la résistance à l'antibiotique dans une expérience visant à déterminer la CI50. La résistance au médicament a augmenté d'environ 1500 fois, atteignant 1 000 microgrammes par millilitre en environ 12 jours.Conformément aux résultats précédents, les mutations ponctuelles de DHFR chez le mutant du dernier jour ont été mesurées par séquençage de Sanger et sont indiquées dans ce tableau. L'acquisition d'une résistance au médicament par l'accumulation de mutations multiples démontre l'utilité du Morbidostat.Comme la sélection sur des plaques d'agar contenant le médicament tend à conférer uniquement une mutation unique, cette figure affiche les courbes de croissance sur puce à différentes concentrations de TMP. Les échantillons mutants montrent une augmentation significative de la résistance à l'antibiotique.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier la position de la résistance aux antibiotiques dans un environnement de laboratoire sous contrôle réel. Après cette procédure, d'autres mesures, comme la mesure microfluidique de cellules uniques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si la morphologie persiste ou change en raison de l'exposition aux médicaments antibiotiques. Une fois maîtrisé, cet appareil peut être facilement reconfiguré pour toutes les expériences de culture bactérienne, telles que la cultivation d'un signe de bactéries ou l'augmentation du niveau de tolérance au coût d'une souche bactérienne.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier l'acquisition de la résistance aux antibiotiques dans une expérience réelle d'évolution adaptative en laboratoire sous contrôle. N'oubliez pas de manipuler les bactéries résistantes aux médicaments conformément aux règles de biosécurité en vigueur pour la pratique microbiologique. Une autorisation spéciale peut être requise pour une expérience impliquant l'entraînement de base de bactéries.

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Conception et utilisation dun faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques (Vidéo) | JoVE Journal

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