Name: Conception et utilisation dun faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Découvrez comment utiliser un morbidostat à faible coût pour étudier l'évolution de la résistance antibiotique chez les bactéries. Cette méthode permet un ajustement dynamique des concentrations de médicaments en temps réel.

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Les auteurs tiennent à remercier le professeur Sze-Bi Hsu et Mme Zhenzhen pour leurs discussions utiles et leur aide dans l’analyse théorique et la simulation numérique. Y. T. Y. tient à remercier le ministère des Sciences et de la Technologie sous les numéros de subvention MOST 103-2220-E-007-026 et MOST 104-2220-E-007-011, ainsi que l’Université nationale de Tsing Hua sous les numéros de subvention 103N2042E1, 104N2042E1 et 105N518CE1.

Assemblée 1. et prétest de l&#39;appareil Morbidostat <ol><li> Assemblée de la Morbidostat <ol><li> Poinçonner des trous 3 sur le bouchon du flacon de culture avec une aiguille de seringue 18 G. Couper trois morceaux de tube en polyéthylène ~ 7 cm de longueur. Insérez ces trois morceaux de tuyaux en polyéthylène sur le bouchon. </li><li> Utilisez du ruban adhésif pour envelopper le bord de la capsule pour servir le casting pour le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS). Mélanger 5 g de composant A et 0,5 g de composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 ml en agitant manuellement à l&#39;aide d&#39;un cure-dent. Charger le mélange dans une seringue de 10 ml. <ol><li> Verser le mélange PDMS sur le bouchon avec la seringue. Cuire l&#39;ensemble de bouchon pour guérir les PDMS pendant 8 heures dans le four à 70 ° C. </li></ol></li><li> Soudez l&#39;anode LED avec le fil de calibre 24 et la cathode LED avec la résistance de carbone avec un fer à souder. Soudez une résistance de 680 Ω de carbone avec un G fil 24. Isolez la connexion de fil à l&#39;aide du ruban électrique. </li><li> Alorslder le collecteur du photo-détecteur avec le G fil 24 et l&#39;émetteur du photodétecteur avec une résistance de 100 kQ de carbone. Isolez la connexion de fil à l&#39;aide du ruban électrique. </li><li> Placez la diode émettant de la lumière dans le support de la culture de flacon. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez la diode électroluminescente et la puissance avec une alimentation de 5 V. Assurez -vous que la LED fonctionne en utilisant un appareil photo numérique qui permet de détecter IR (par exemple, une caméra de téléphone mobile). </li><li> Placer le photodétecteur dans le support de flacon de culture. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez le photodétecteur et la puissance avec une alimentation de 5 V. Branchez le fil sur les deux côtés des résistances photodétecteurs pour mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique. </li><li> Coller un aimant sur l&#39;arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d&#39;unité d&#39;agitation magnétique. A noter que le alignement de l&#39;arbre du ventilateur dans le flacon de culture, et l&#39;espacement entre la fiole de culture et l&#39;aimant est très critique pour le bon fonctionnement de l&#39;unité d&#39;agitation magnétique. </li><li> Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture dans le morceau de tube en silicone correspondant pour les micro-pompes, bouteilles moyennes, et une bouteille de déchets. Tournez sur la pompe pendant 1 heure et mesurer le volume total pompé de la bouteille moyenne dans le flacon de culture pour déterminer le débit de la pompe. Notez que le taux de pompage typique devrait être ~ 4 ml / h, ce qui correspond au taux de dilution D = 0,33 h -1 pour un 12 ml de volume de la fiole de culture de travail. </li><li> Placez tout l&#39;ensemble sur une taille moyenne (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Agitateur incubateur. </li></ol></li><li> Prétest l&#39;Morbidostat <ol><li> Set tension d&#39;alimentation du ventilateur cool de 5 V pour démarrer son moteur à tester la barre d&#39;agitation magnétique. Notez que l&#39;action d&#39;agitation peut être inspecté visuellement. La tension qui conduisents le moteur du ventilateur de refroidissement est contrôlée avec précision par la largeur d&#39;impulsion (PWM). </li><li> Préparer une série de type sauvage E. coli échantillons ayant une densité optique à 600 nm allant généralement de 0,07 à 0,3 pour l&#39; étalonnage. Placez un test E. échantillon coli dans le flacon de culture et d&#39; enregistrer la tension de photodétecteurs. <ol><li> Placer ~ 100 ul du même échantillon dans le lecteur de plaque et enregistrer la densité optique. Utiliser la tension du photodétecteur en fonction des données de densité optique pour tracer la courbe d&#39;étalonnage. Notez que généralement, un changement d&#39;unité de densité optique correspond à ~ 7,6 V changement dans le photodétecteur avec le schéma de polarisation utilisé ici. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Exécution de l&#39;Morbidostat <ol><li> Préparation Avant de commencer l&#39;expérience quotidienne <ol><li> Préparer le flacon de culture avec trois ultra-résistants aux produits chimiques tubings Tygon avec diamètre intérieur 1/32 pouce et le diamètre extérieur de 3/32 pouce pour les entrées pour former le dispositif de l&#39;article1.1 et à la figure 1 supplémentaire. </li><li> Préparer le milieu minimum M9 (0,2% de glucose) et le triméthoprime (TMP) médicaments contenant du milieu. Stériliser le milieu, la bouteille moyenne, le milieu bouteille de médicament, le flacon de récupération, et le flacon de culture dans un autoclave à 121 ° C. NOTE: Le TMP est une solution de réserve qui est utilisée pour obtenir plus tard , les concentrations dans le tableau 1 et le médicament TMP contenant du milieu ne sont pas autoclavé. </li></ol></li><li> Exécution de l&#39;Morbidostat <ol><li> Le premier jour de l&#39;expérience, dégeler 1 ml de type sauvage congelé E. coli MG1655 cellules pendant 5 min à température ambiante , et le transfert de 120 ul de cellules dans le flacon de culture contenant ~ 12 ml de milieu de culture M9. Après le premier jour, décongeler 1 ml de E. congelées coli , des cellules de la veille pendant 5 min et le transfert de 120 ul des cellules à un nouveau flacon de culture contenant environ 12 ml de milieu de culture M9. </li><li> Allumez l&#39;incubateur shaker et régler le tempeh<html> rature à 30 ° C sans agitation. </li><li> Démarrer l&#39;opération de morbidostat en activant la micro-pompe, l&#39;unité d&#39;agitation magnétique et la mesure de la densité optique. Remarque: Au cours de l&#39;opération, un algorithme de seuil de contre-réaction est utilisé pour commander l&#39;injection du médicament. Lorsque la densité optique mesurée dépasse un seuil prédéterminé, la pompe d&#39;injection de médicament serait activé et la pompe à fluide soit mis hors tension. Dans le cas contraire, la pompe d&#39;injection de médicament reste éteint et la pompe à fluide est activée. </li><li> Surveiller la tension de temps à autre pour qu&#39;il y ait une croissance microbienne. Remarque: En raison du gel et du dégel du cycle, E. coli cellules présentent un retard de ~ 4 h au cours de la croissance de chaque jour. </li><li> Après ~ 23 h, arrêter le micro-pompe en éteignant sa tension d&#39;alimentation et retirez le flacon de culture. Ajouter 15% de glycérol dans le flacon de culture et congeler l&#39;échantillon à -80 ° C pour le stockage. </li><li> Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Antibiotique Susceptibilité Mesure dans 96 puits Format REMARQUE: Effectuez la mesure du taux de croissance dans un lecteur de plaque avec un format de 96 puits pour déterminer le niveau de résistance aux antibiotiques. <ol><li> Décongeler l&#39;échantillon congelé par jour à la température ambiante pendant 5 minutes et transférer 15 pl de la cellule dans le flacon de culture contenant environ 15 ml de milieu M9. Leur permettre de se développer jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,1. Diviser les 15 ml dans des flacons de 1 ml et ajouter le médicament TMP à cette étape pour obtenir les concentrations désirées de médicament comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Prendre 200 pi de l&#39;échantillon de l&#39; étape 3.1 et la place dans chaque puits dans le lecteur de plaque et leur permettre de se développer pendant 12 h 5. La densité optique à une longueur d&#39;onde de 600 nm est automatiquement enregistrée pendant la mesure. NOTE: Pour chaque point de données, les mesures sont enregistrées en triple et en moyenne pour assurer la cohérence des données. Les données sur la densité optique en fonction du temps peut be utilisée pour obtenir le taux de croissance. </li><li> Tracer les données de taux de croissance par rapport à la concentration du médicament pour obtenir IC50. A noter que la CI50 est définie comme la concentration de médicament à laquelle le taux de croissance est de cinquante pour cent du taux de croissance maximal 5. </li></ol> 4. Single Cell Morphologie et sensibilité aux antibiotiques dans la mesure dispositifs microfluidiques <ol><li> Effectuer la fabrication des dispositifs microfluidiques par lithographie douce multicouche de PDMS comme décrit ailleurs 15. <ol><li> Utilisez photolithographie pour faire le moule de résine photosensible pour les couches de contrôle et de débit. Notez que pour la couche de contrôle, utilisez photorésist négatif (~ 15 um de hauteur) et résine photosensible positive (~ 8 pm hauteur) pour produire un moule sur une plaquette de silicium nue. </li><li> Préparer des mélanges de PDMS avec des rapports de reticulation de 5: 1 et 20: 1 pour la couche de contrôle et la couche d&#39;écoulement, respectivement. Mettez les mélanges dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bullesPendant 1 h. </li><li> Exposer les moules couche de résine photosensible de contrôle sur la plaquette de silicium à triméthylchlorosilane (TMCS) vapeur. Rendre la couche de contrôle de l&#39;épaisseur ~ 6 mm par coulée du mélange PDMS (avec un rapport de réticulation 5: 1) sur la plaquette de silicium sur la couche surmoulée contrôle de résine photosensible. Cuire la couche de commande pendant 40 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four. </li><li> Rendre la couche d&#39;écoulement par revêtement par centrifugation d&#39;un mélange de PDMS (avec un rapport reticulation 20: 1, la vitesse de rotation de 3000 rpm pendant 60 secondes) sur un moule de résine photosensible couche d&#39;écoulement. Cuire la couche d&#39;écoulement pendant 30 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four. </li><li> Utilisez une lame de rasoir pour couper la couche de contrôle dans la taille de la puce souhaitée (typiquement 3 cm x 2 cm) et manuellement décoller la couche de contrôle. Placez la couche de contrôle sur le dessus de la couche d&#39;écoulement et les aligner sous un stéréomicroscope. Durcir l&#39;ensemble aligné à 80 ° C pendant une nuit dans le four. Ensuite, faire tremper l&#39;ensemble dans 250 ml d&#39;eau déminéralisée dans un récipient en plastique pendant 5 heures pour dissoudre le TMCS résiduel. </li><li> Par la suite, poinçonner les trous d&#39;entrée avec 20 g d&#39;aiguilles et de lier l&#39;ensemble élastomère sur une lame de verre recouverte d&#39;une couche de PDMS ébauche (PDMS réticulation rapport 5: 1, vitesse de rotation 2000 tours par minute pendant 30 secondes), par traitement par plasma d&#39;air pendant 40 secondes à 1.2 pression d&#39;air Torr. </li><li> Effectuer une vaste cuisson pendant 36 heures à 80 ° C pour réduire les effets cytotoxiques de PDMS. A noter que cette étape de cuisson est crucial pour minimiser la toxicité pour les cellules bactériennes. </li></ol></li><li> On Chip Growth Experiment <ol><li> Avant de charger dans le dispositif microfluidique, rincer avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 1 heure et moyenne M9 pendant 1 h. </li><li> Décongeler l&#39;échantillon congelé tous les jours à la température ambiante pendant 5 min et inoculer un nouveau tube à essai avec un milieu M9 frais. Placer l&#39;échantillon dans un incubateur agitateur à 37 ° C pendant une nuit. </li><li> Diluer l&#39;échantillon 10 fois microbienne avec un milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en faisant pression sur le récipient d&#39;échantillon microbienne à 5 psi. Chargez ensuite le médicament TMPmoyen dans la puce en faisant pression sur le récipient milieu de médicament à 5 psi. Exécuter le mélange entre le microbe et de médicament par actionnement de la valve micromécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 min. </li><li> Placez la puce microfluidique dans l&#39;incubateur de microscope monté sur le microscope inversé. Acquérir l&#39;image de cellules dans la chambre de croissance à chaque heure pendant 8 heures avec la caméra CCD montée sur le microscope inversé. </li><li> Utiliser le script de programme personnalisé pour calculer le nombre de cellules par l&#39; intermédiaire d&#39; un algorithme de seuil sur les données d&#39;image de la cellule 18. A noter que les données de numéros de cellule sont typiquement en moyenne plus de trois chambres microfluidiques. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un dispositif de morbidostat faible encombrement à partir de composants à faible coût est démontrée. Les augmentations du niveau de résistance aux médicaments enregistrés par l&#39;appareil sont identiques à ceux des rapports précédents 5. Conçu pour les études évolutives de la résistance aux médicaments, le dispositif est potentiellement applicable à beaucoup d&#39;autres expériences. Tout d&#39;abord, une base de données complète des mutations induites par les médicaments peut être établie pour un grand nom...

Depuis l&#39;introduction de la première pénicilline médicament antibiotique, la résistance aux antibiotiques microbienne est devenue un problème de santé mondial 1. Bien que l&#39;acquisition d&#39; une résistance aux antibiotiques peut être étudié rétrospectivement in vivo, les conditions de ces expériences sont souvent pas contrôlés tout au long de l&#39; évolution 2. En variante, l&#39; évolution de laboratoire adaptatif peut révéler l&#39;évolution moléculaire d&#39;une espèce microbienne sous contraintes de l&#39; environnement ou de la pression de sélection d&#39;un médicament antibiotique 3. Récemment, de nombreuses expériences d&#39;évolution bien contrôlée de la résistance aux antibiotiques ont élucidé l&#39;émergence de la résistance aux antibiotiques. Par exemple, le groupe d&#39;Austin a démontré l&#39; émergence rapide dans un environnement compartimenté de microfluidique correctement conçu 4. Le morbidostat développé récemment induit des mutations systématiques sous la pression de la sélection des médicaments 5,6. Le morbidostat, une sélec microbiennedispositif de tion qui ajuste en continu la concentration en antibiotique pour maintenir une population à peu près constante, constitue une avancée majeure dans le test de fluctuation utilisée en microbiologie 7,8. Dans le test de fluctuation, un médicament antibiotique est injecté à une concentration élevée, et les mutants survivants sont criblés et comptés. Au lieu de cela, les microbes dans un morbidostat sont constamment remises en question et d&#39;acquérir de multiples mutations. Le morbidostat fonctionne de façon similaire à la chémostat, un dispositif de culture inventé par Novick et Szliard en 1950 qui maintient une population constante par apport continu de nutriments alors que la dilution de la population microbienne 9. Depuis son introduction, le chemostat a été avancée et améliorée. chémostats microfluidiques actuelles ont atteint des capacités de nanolitre et une seule cellule. Cependant, ces dispositifs ne sont pas appropriés pour des expériences d&#39;évolution adaptative, qui nécessitent une grande population de cellules avec de nombreux événements de mutation 10,11. Récemment, mini-chémostats avec des volumes de travail de ~ 10 ml ont également été développés pour combler l&#39;écart entre le litre bioréacteurs à l&#39;échelle et la microfluidique chemostat 12,13. Ici, nous présentons la conception et l&#39;utilisation d&#39;un faible coût, morbidostat automatisé pour une étude de résistance aux antibiotiques de la drogue. Le module proposé peut être utilisé dans un incubateur à agitateur dans un laboratoire de microbiologie à l&#39;exigence d&#39;un minimum de matériel. Le firmware open-source est également facilement adapté à des applications spécifiques de l&#39; évolution adaptative, tels que l&#39; ingénierie métabolique 3. Enfin, le morbidostat est intégré dans une plate - forme microfluidique multiplexé pour les tests de sensibilité aux antibiotiques 14.

<table><tbody><tr><td>Incubateur Shaker</td><td>Environnemental BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo Board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Résistance Carbone</td><td>Digikey</td><td></td><td>Résistance Bias pour LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Résistance Carbone</td><td>Digikey</td><td></td><td>Résistance Bias pour phototransistor</td></tr><tr><td>940 nm Diode électroluminescente</td> LED <td>lumineuse Électronique</td><td>BIR-BM13E4G-2 Mesure de</td><td>la densité optique</td></tr><tr><td>940 nm phototransistor</td><td>Kodenshi&nbsp ;</td><td>ST-2L2B</td><td>Mesure de densité optique</td></tr><tr><td>Darlington paire IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>ce circuit intégré entraîne des micropompes et une unité d’agitation magnétique</td></tr><tr><td>Ventilateur brushless 5 V DC</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spécifications : tension d’alimentation 5 V et 80&nbsp ; maman; disponible www.jameco.com</td></tr><tr><td>Micropompe piézoélectrique</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pression > 3&nbsp ; kPa ; Débit >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID : 1/32 » OD : 3/32 » L :50'&nbsp ;</td></tr><tr><td>Barre d’agitation magnétique</td><td>COWIE</td><td></td><td>forme conique dim : 10&nbsp ; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Flacon de verre à scintillation de 20 ml Verre</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex 28 mm (diamètre) x 61 mm (hauteur)</td></tr><tr><td>Porte-flacon</td><td></td><td></td> de culture <td>Fabriqué sur mesure en polyformaldéhyde&nbsp ;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>utilisé pour sceller le flacon en verre</td></tr><tr><td>Bouteille moyenne</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 sel minimal 5x</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide cadamino</td><td>moyen BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>moyen Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Batériologique</td><td>Oxoid</td><td></td><td>pour plaque de gélose</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>DMI-LED</td><td>utilisé pour la mesure microfluidique Utilisation Objectif 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Microscope Incubateur</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>utilisé pour la mesure microfluidique</td></tr><tr><td>Électrovannes</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalement ouvert 1,3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>Carte d’interface USB</td><td>Hobby Engineering</td><td>Module d’E/S numériques USBIO24-R&nbsp ;</td><td>pour la mesure microfluidique</td></tr><tr><td>Compresseur d’air</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Source de pression pour microfluidiques ; Pression max. 80 psi</td></tr><tr><td>Raccords Luer-lock mâles à ValuePlastics.com cannelés 1/8 »</td><td></td><td>MTLL230-1</td><td>utilisés pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Cannelures 1/8 » à 10-32 orifices</td><td>filetés</td><td>ValuePlastics.com B-1</td><td>utilisés pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Raccords Luer-lock femelles à orifice</td> <td>fileté 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&nbsp ; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>10 kOhm, résistance à film de carbone, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Condensateur au tantale, 10&nbsp ; &mu ; F, 25 V, 10 %</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>utilisé pour le contrôle microfluidique</td></tr><tr><td>Caméra CCD Andor Zyla</td><td></td><td>4.2 Plus SCMOS</td><td>utilisée pour l’imagerie microfluidique sur puce</td></tr><tr><td>Lecteur</td><td></td><td></td><td></td>de plaque ELISA</tr><tr><td>à deux composants Silicone&nbsp ;</td><td>Minuteive</td><td>RTV 615</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>AZ4620 photoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Nettoyant plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Aiguille de seringue de calibre 20</td><td>BD</td><td></td><td>utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>ADN polymérase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>Amplification PCR</td></tr><tr><td>Triméthoprime</td><td>Sigma Lecteur de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaques</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp ;</td><td>Mesure de la résistance aux antibiotiques</td></tr></tbody></table>

conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé morbidostat pour adaptive evolution des bactéries sous sélection des médicaments antibiotiques

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Nous décrivons un faible coût, morbidostat configurable pour caractériser la voie de l&#39;évolution de la résistance aux antibiotiques. Le morbidostat est un dispositif de culture bactérienne qui surveille en permanence la croissance bactérienne et ajuste la concentration du médicament à récuser en permanence les bactéries à mesure qu&#39;ils évoluent pour acquérir une résistance aux médicaments de façon dynamique. L&#39;appareil dispose d&#39;un volume de travail de ~ 10 ml et est entièrement automatisé et équipé de la mesure de la densité optique et micro-pompes à moyen et à la délivrance de médicaments. Pour valider la plate - forme, nous avons mesuré l&#39;acquisition progressive de la résistance triméthoprime dans Escherichia coli MG 1655 et intégré de l&#39;appareil avec une plate - forme microfluidique multiplexé pour étudier la morphologie des cellules et la sensibilité aux antibiotiques. L&#39;approche peut être mise à échelle des études de laboratoire de la résistance aux antibiotiques, et est prorogeable adaptatifs évolution des améliorations de contrainte dans l&#39;ingénierie métabolique et d&#39;autres expériences de culture bactérienne.

Le morbidostat décrit ci-dessus est schématisé sur la figure 1. Les opérations de morbidostat communes, y compris l&#39; évolution expérimentale, test de sensibilité aux antibiotiques et la morphologie des cellules de vérification, ont été validées dans un E. culture coli MG1655 exposée au triméthoprime (TMP), un médicament antibiotique couramment utilisé 5,6. TMP induit par étapes augmente très distinctives dans la résistance aux médicaments...

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

L'objectif général de cette expérience est de caractériser la voie évolutionnaire de la résistance aux antibiotiques à l'aide d'un morbidostat qui surveille en continu la croissance bactérienne et ajuste dynamiquement la concentration en antibiotique au fur et à mesure que les bactéries acquièrent une résistance au médicament. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le dispositif est constitué de composants électroniques peu coûteux et facilement accessibles, et peut être facilement reconfiguré selon des besoins spécifiques. Les procédures seront démontrées par Po Cheng Liu et Yi Tai Lee, tous deux étudiants diplômés de mon laboratoire.Pour assembler le morbidostat, commencez par utiliser une aiguille de 18 gauge pour percer trois trous dans le bouchon du flacon de culture. Coupez trois morceaux de tube en polyéthylène d'environ sept centimètres de longueur et insérez-les dans les trous du bouchon. Utilisez du ruban adhésif pour enrouler le bord du bouchon, servant ainsi de moule au mélange de polydiméthylsiloxane, ou PDMS.Ensuite, ajoutez cinq grammes du composant A et 0,5 gramme du composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 millilitres et u

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Genetics

Génétique

Ici nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutant pour une séquence cible donnée. Nous montrons comment cette méthode, qui est réalisée in vivo chez Escherichia coli, peuvent être couplées avec des sélections fonctionnelles d'évoluer de nouvelles activités enzymatiques.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

Source : Liu, P. C., et al. Conception et utilisation d’un morbidostat automatisé à faible coût pour l’évolution adaptative des bactéries sous sélection d’antibiotiques. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’utilisation d’une puce microfluidique pour visualiser et comparer la croissance et la morphologie de souches d’E. coli de type sauvage et résistantes au triméthoprime sous stress antibiotique du triméthoprime.

Croissance bactérienne sur une puce microfluidique pour étudier la résistance aux antibiotiques

Source : Jian, X., et al., Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes pour favoriser l’évolution adaptative des bactéries vers la tolérance au méthanol. En mélangeant des cultures bactériennes modifiées avec un milieu à fort stress de méthanol et en les segmentant en microgouttelettes, le système...

Évolution adaptative de bactéries à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir adaptatif évolution en laboratoire de micro-organismes dans des conditions à l'aide de la culture chemostat. En outre, l'analyse génomique de la souche évoluée est discutée.

Procédure d&#39;adaptation Laboratoire de l&#39;évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

Nous présentons ici une méthode expérimentale pour évaluer le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique.

Analyse le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique

Le Framework eVOLVER permet une culture microbienne continue à haut débit avec une haute résolution et un contrôle dynamique sur les paramètres expérimentaux. Ce protocole démontre comment appliquer le système pour mener une expérience de conditionnement physique complexe, guidant les utilisateurs sur la programmation de contrôle automatisé sur de nombreuses cultures individuelles, la mesure, la collecte et l’interaction avec les données expérimentales en temps réel.

Conception automatisée, à haut débit, des expériences de croissance cellulaire continue à l’aide d’eVOLVER

Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.

Système de culture automatisé destiné à être utilisé dans les essais précliniques de thérapies dirigées par l’hôte pour la tuberculose

Ce protocole fournit une méthode pour l’optimisation globale systématique des biocapteurs génétiquement codés par la génération et l’évaluation de bibliothèques génétiques assistées par automatisation. Ceci est associé à des méthodologies de conception d’expérience pour rationaliser l’expérimentation et permettre la sélection de composants génétiques pour ajuster les biocapteurs à des résultats de conception spécifiques.

Échantillonnage efficace de l’espace de conception de biocapteurs génétiquement codés grâce à un plan d’expériences et à un flux de travail d’automatisation

Découvrez comment utiliser un morbidostat à faible coût pour étudier l'évolution de la résistance antibiotique chez les bactéries. Cette méthode permet un ajustement dynamique des concentrations de médicaments en temps réel.

Conception et utilisation dun faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques (Vidéo) | JoVE Journal

Conception et utilisation d'un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

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