Name: Murine Flexor Tendon blessures et chirurgie de réparation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Apprenez la chirurgie de réparation des tendons fléchisseurs chez la souris pour étudier la cicatrisation et identifier les cellules impliquées dans la formation de cicatrices. Ce modèle murin permet d'explorer des cibles thérapeutiques pour améliorer les résultats de guérison.

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Ce travail a été partiellement financé par la Société américaine pour la chirurgie du Prix Pilot Main et NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (à AEL) et NIAMS / NIH P30AR061307.

Le Comité de l&#39;Université sur la recherche animale de l&#39;Université de Rochester a approuvé l&#39;ensemble des expérimentations animales. Dix-12 souris C57BL femelle / 6J ont été utilisés. 1. Préparation des animaux pour la chirurgie Flexor Tendon (~ 15 min) <ol><li> instruments chirurgicaux autoclaves pour stériliser, porter des gants stériles tout au long, et de maintenir un champ opératoire stérile. </li><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) avec un volume de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) correspondant au poids corporel. Confirmer la profondeur de la sédation par absence de toe-pincement réflexe. </li><li> Administrer analgésie préventive (buprénorphine, 0,05-0,1 mg / kg) par injection sous-cutanée. Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter les yeux de se dessécher. </li><li> Préparer le site chirurgical par clipsage la fourrure sur l&#39;ensemble du membre postérieur. La stérilisation de la peau par lavage successivement avec de l&#39;iode de povidone, suivie par 70% d&#39;éthanol, et de nouveau avec de la povidone iode. </li></ol><ol><li> Trouver le tendon, vu superficiellement dans la face interne du mollet long fléchisseur des orteils (FDL). L&#39;utilisation d&#39;un scalpel, faire une petite 0,5-1 cm incision dans la peau avec des micro-ciseaux pour exposer le tendon. </li><li> Utilisez une pince pour séparer le tendon FDL du tissu environnant et il trace jusqu&#39;à la jonction myotendineuse. Couper le tendon à cette jonction avec des ciseaux à ressort pour le libérer, en prenant soin d&#39;éviter l&#39;artère tibiale postérieure. </li><li> Fermer la peau avec 5-0 sutures en nylon. Note: La transection FDL et réparation (étapes 2.4) doivent être effectuées à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. </li><li> Faire une incision de 3 mm sur l&#39;aspect postérolatérale de la patte arrière en utilisant ressort micro-ciseaux. rétracter délicatement les tissus mous environnants et les muscles avec une pince, en veillant à minimiser les dommages aux tissus, et identifier le tendon FDL. <ol><li> Soulevez doucement le tendon FDL et complètement transect en utilisant micro-ciseaux. Suturer les extrémités du tendon FDL ensemble selon un motif Kessler modifié avec des sutures 8-0, évitant ainsi le séchage du tendon en mouillant périodiquement avec une solution saline. </li><li> Remplacer les tissus mous et les muscles sur le tendon, puis fermez l&#39;incision avec 5-0 sutures en nylon. </li></ol></li><li> Placer des souris sur une lame de chauffe ensemble à 37 ° C, afin de maintenir la température du corps jusqu&#39;à récupéré de l&#39;anesthésie. </li><li> Surveiller les souris post-opératoire pour des signes de déficience ou d&#39;une infection, y compris la vocalisation accrue et fourrure ébouriffée. Injecter buprénorphine (50 pl / souris) comme analgésique toutes les 12 heures jusqu&#39;à ce que les souris ne montrent plus de signes de douleur ou de détresse. </li><li> Permettre aux souris de guérir pendant une période de 10 jours après la chirurgie avant de continuer à les prochaines étapes. Remarque: Les cellules peuvent être récoltées à tout point de temps après la chirurgie. Ici, 10 jours sont choisis pour ces expériences représentatives étant donné la relativement élevée cellularité du tissu à ce moment. </li></ol> 3. Labeling de cellules Cyclisme (~ 10 min) <ol><li> Préparer EdU (5-éthynyl-2&#39;deoxyuridine) solution (10 mg / ml dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate [PBS] + 1% de diméthylsulfoxyde [DMSO] pour augmenter la solubilité). </li><li> Injecter souris avec 100 ul EdU (50 mg / kg) par injection ip 24 h avant le sacrifice. </li></ol> 4. Les cellules de récolte pour cytologie Centrifugation (2,5 h, ~ 30 min temps sur les mains) <ol><li> Préparer 3 mg / ml de collagénase I dans du PBS. </li><li> Euthanize souris par asphyxie du dioxyde de carbone à un taux de pas plus de 3 L / min Débit et effectuer luxation du rachis cervical en tant que mesure secondaire. </li><li> Localisez le tendon réparé en utilisant l&#39;étape 2.4 ci-dessus, et d&#39;isoler le tissu du tendon en coupant environ 2 mm de chaque côté du site de la lésion avec des micro-ciseaux. <ol><li> tissu Hacher avec scalpel dans une boîte de Pétri avec 1 ml de 3 mg / ml de collagénase, puis passer à travers un mélange de 18 aiguilles G à plusieurs reprises pour briser le tissu. Recueillir le mélange dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse. </li&gt; <li> Digest tissu tendineux pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation. </li><li> Essorage du tissu vers le bas (300 g pendant 5 min), aspirer la collagénase, puis remettre en suspension les cellules / tissus avec de l&#39;albumine de sérum bovin 500 ul de 3% (BSA) dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> suspension de cellules de filtre à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et de gros morceaux de tendon, et mettre de côté dans un incubateur à 37 °. </li><li> Placez tissu tendineux dans un autre tube de 1,5 ml de centrifugeuse, et rafraîchir avec 1 ml de solution de collagénase, pipetage haut et bas pour mélanger. </li><li> Laisser incuber le tissu encore une heure à 37 ° C sous agitation. </li><li> Isoler tissu tendineux digéré (300 g pendant 5 min), puis remettre en suspension dans 500 pi 3% de BSA dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Filtre suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 pm, combiner avec suspension isolé en 4.3.3, puis compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Laver les cellules une fois avec 3% de BSA dans du PBS, puis remettre en suspension à 3-610 x 4/100 ul. </li></ol></li><li> Fixer un entonnoir cytologique sur une lame chargée positivement et verrouiller dans le support de diapositives. Insérer l&#39;appareil entier dans une centrifugeuse cytologique et ajouter 100 ul de suspension cellulaire dans l&#39;entonnoir. Centrifuger à 300 g pendant 5 min pour disperser les cellules sur la lame. </li></ol> 5. immunocytochimie pour détecter EdU (2 h, ~ 45 min temps sur les mains) Remarque: Toutes les étapes d&#39;incubation doivent être effectuées dans l&#39;obscurité pour limiter photoblanchiment des fluorophores. <ol><li> les cellules de cercle avec un stylo à barrière hydrophobe pour réduire au minimum une solution nécessaire pour les étapes suivantes, puis fixer immédiatement avec 150 ul de 3% de paraformaldehyde dans du PBS 15 min à température ambiante (TA). <ol><li> Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de BSA à 3% dans du PBS. </li><li> cellules perméabiliser avec 0,5% de Triton-X 100 dans du PBS 20 min à température ambiante. </li><li> étape de lavage répétée comme dans 5.1.1. </li></ol></li><li> Préparer EdU réaction Cockttous selon les instructions du kit pas plus de 30 minutes avant l&#39;utilisation. <ol><li> Ajouter 150 ul cocktail à chaque diapositive, incuber 30 min à température ambiante. </li><li> étape de lavage répétée comme dans 5.1.1. </li></ol></li><li> Incuber avec 150 ul de contraste nucléaire Hoechst33342 dilué 1: 2000 dans du PBS 30 min à température ambiante. <ol><li> Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de 1 x PBS. </li></ol></li><li> Ajouter 1-2 gouttes moyen pour les cellules de montage anti-fade, puis lentement lamelle inférieure pour empêcher les bulles. <ol><li> Laisser le milieu de montage sécher durant la nuit dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle à la diapositive. </li></ol></li><li> Les diapositives d&#39;images au grossissement 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres d&#39;excitation / émission capables de détecter DAPI (Hoeschst33342) et Texas Red (Alexa Fluor 594). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents

La procédure chirurgicale pour un modèle murin de transection complète et la réparation du tendon fléchisseur des orteils est présenté dans cette étude. En outre, une nouvelle application de la concentration de petites populations de cellules avec la cytologie centrifugeuse est démontrée, permettant une analyse immunocytochimique quantitative de l&#39;environnement cellulaire pendant la guérison du tendon fléchisseur. Ce modèle de tendon fléchisseur de réparation démontre une réponse de guérison reproductible, qui peut ...

tendons fléchisseurs dans le travail de la main, de concert avec les muscles fléchisseurs de l&#39;avant-bras et les gaines numériques pour permettre la flexion des doigts et de la fonction de préhension de la main. tendons fléchisseurs courent le long de la face palmaire de la main; cet endroit relativement superficielle entraîne souvent des blessures aux tendons fléchisseurs pendant un traumatisme à la main. Tendons guérissent par une réponse d&#39; un tissu cicatriciel au lieu de la régénération du tissu normal du tendon 1. Bien que ce tissu cicatriciel assure la continuité du tendon, la fonction est considérablement diminué par rapport au tendon sain. Composites de tissus Tendon-cicatrice se caractérisent par des propriétés mécaniques affaiblies 1, ce qui rend les tendons réparés plus susceptibles de se rompre. En outre, le tissu cicatriciel n&#39;a pas l&#39;organisation de la structure des fibres de collagène de tendon natif, ce qui entraîne une augmentation de la taille du tendon et d&#39;encombrement. Compte tenu des contraintes anatomiques de l&#39;unité tendon-gaine, même une légère augmentation de la taille du tendon peut considérablement rougeUCE la fonction de glissement du tendon, et donc plage de chiffres de mouvement et la fonction de la main. Avant les blessures du 1960 aux tendons fléchisseurs, en particulier dans la zone II de la main, ne sont pas systématiquement réparées en raison des complications graves dans la guérison qui se posent avec ces réparations 2. Cette zone de la main a été appelé «la terre de personne» 3. Cependant, l&#39; amélioration des techniques chirurgicales, des motifs de suture et des protocoles de réhabilitation de physiothérapie ont considérablement amélioré les résultats du tendon fléchisseur réparations 2. Malgré ces progrès, jusqu&#39;à 40% des réparations entraînent la formation d&#39;adhérence suffisante pour empêcher la fonction de la main 4. Par conséquent, une approche biologique est nécessaire pour améliorer la guérison. Malheureusement, on sait très peu sur le processus de guérison du tendon au niveau cellulaire et moléculaire. Ainsi, l&#39;objectif était de développer un modèle murin qui pourrait être utilisé pour améliorer la understandin fondamentaleg des composants cellulaires et moléculaires de fléchisseur guérison du tendon et la réponse de la formation de cicatrices, comme un moyen d&#39;identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la guérison. modèles animaux plus grands ont contribué à améliorer la compréhension du processus de guérison du tendon fléchisseur. Études de Canine et le lapin ont démontré à la fois la capacité de guérison intrinsèque et extrinsèque des tendons fléchisseurs 5,6, l&#39;importance du mouvement passif tôt contrôlée pour minimiser la formation d&#39;adhérence par rapport à l&#39; immobilisation 7, ainsi que les effets des différents motifs de suture sur le processus de guérison 8 , 9. En outre, le modèle canin a été utile pour tester des approches d&#39;ingénierie tissulaire translationnelle pour améliorer la guérison 10. Cependant, il existe plusieurs avantages importants à l&#39;aide d&#39;un modèle murin par rapport à un grand modèle animal, y compris le coût relatif, la disponibilité des réactifs spécifiques de souris et de la facilité de génération globale KNOCk-out ou constructions délétion / surexpression spécifiques de tissus. En outre, les similitudes fonctionnelles entre les humains et les souris en ce qui concerne les tendons fléchisseurs 11 indiquent l&#39;utilité potentielle dans le développement d&#39; un modèle murin. Développement d&#39;un modèle murin de tendon fléchisseur transection et de réparation imite de nombreux aspects de la guérison clinique, y compris la formation de tissu cicatriciel abondante et des propriétés mécaniques avec facultés affaiblies. Le modèle décrit ici est pas un vrai récapitulation de la pratique clinique en raison de transection du FDL à la jonction myotendineuse afin de protéger le site de réparation. En outre, ce modèle ne tient pas compte de la contribution des cellules synoviales de la gaine à la réponse de cicatrisation, comme il n&#39;y a pas de gaine synoviale recouvrant la partie médiane du tendon se produit lorsque la réparation. Malgré ces limites, ce modèle a l&#39;avantage de la gamme de production d&#39;adhérences de mouvement de limitation, qui doit encore être démontrée dans des modèles murins que plus de closely rapprochant le scénario clinique. Ce modèle a été utilisé pour évaluer les modèles knock-out souris 12,13, et de tester différentes approches pharmacologiques pour améliorer la guérison 14-17. analyse histologique de ce modèle, par immunohistochimie et hybridation in situ, peut fournir des indications importantes pour la localisation des gènes et des protéines clés au cours de la guérison. Cependant, l&#39;histologie ne donne qu&#39;une analyse spatiale en coupe transversale et ne permet pas de quantification dans l&#39;ensemble du tissu entier. La cytométrie en flux est une approche plus quantitative, mais seulement un nombre très limité de cellules peuvent être isolées à partir du tissu de tendon de guérison dans le modèle de souris, et ce nombre est encore diminué au cours des étapes de fixation, perméabilisation et lavage. Prenant cela en compte, écoulement devient cytométrie une approche irréalisable en raison du nombre d&#39;animaux qui seraient nécessaires. Une autre méthode est nécessaire pour préserver la majorité de cette petite population de cellules dans le butpour caractériser davantage le milieu de guérison. La méthode utilisée pour ce faire, ici, concerne la concentration des cellules isolées par centrifugation cytologique sur une lame de verre, suivie par immunocytochimie. Dans la présente étude EdU (5-éthynyl-2&#39;deoxyuridine, un analogue de la thymidine) l&#39;incorporation et l&#39;étiquetage ultérieur a été utilisé pour déterminer l&#39;état prolifératif relatif de cellules sur le site de guérison. Cette approche peut être appliquée pour tester l&#39;efficacité des traitements pharmacologiques sur la prolifération cellulaire, le gène knock-out ou d&#39;une surexpression ou d&#39;identifier et de quantifier des populations de cellules différentes.

<table><tbody><tr><td><forte>Préparation chirurgicale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>souris C57BL/6J&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Hospira</td><td>NDC # 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NDC # 61311-482-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Par Pharmaceutical Inc.</td><td>NDC # 42023-179-10</td><td></td></tr><tr><td>Irrigation au chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>Hospira</td><td>NDC # 0409-6138-03</td><td>Pour la préparation de solutions de kétamine/xylazine et de buprénorphine</td></tr> 1 <tr><td>ml de seringue</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G d’aiguille</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>solution de povidone et d’iode</td><td>Aplicare</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube veter pommade ophtalmique</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC# 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Outils chirurgicaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance portable 200 g</td><td>Ohaus</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguilles</td><td>pour les sciences fines</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à micro-ressorts</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micro-aiguilles</td><td>pour les sciences fines</td><td>12061-02</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutures en nylon</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td></td></tr><tr><td>8-0 microchirurgie sutures en nylon</td><td>Ethicon</td><td>2808G</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line histologie chauffe-lames</td><td>Barnstead International</td><td>26025</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td><méthode >Cytospin forte</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type I, lyophilisée</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>1700-017</td><td></td></tr><tr>Sérum<td>bovin Albumine</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoirs de cytologie</td><td>Fisher HealthCare</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope HistoBond+</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifugeuse</td><td>Shandon</td><td>SH-CYTO2</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateau de coloration de lames avec couvercle noir</td><td>IHC World</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Imaging Kit</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>C10639</td><td>Comprend EdU et&nbsp ; Hoeschst 33342</td></tr><tr><td>Immedge Stylo barrière hydrophobe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamant médium de montage</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre 24 x 50 mm #1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernis</td><td></td><td></td><td></td> à ongles transparent</tr></tbody></table>

murine flexor tendon blessures et chirurgie de réparation

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Tendon relie le muscle squelettique et de l&#39;os, ce qui facilite le mouvement de la quasi-totalité du corps. Dans la main, les tendons fléchisseurs (FTS) permettent la flexion des doigts et de la fonction générale de la main. Les blessures aux FTs sont communs, et la guérison satisfaisante est souvent altérée en raison de tissus et des adhérences entre le tendon et les tissus environnants cicatrice en excès. Cependant, on sait peu sur les composants moléculaires et cellulaires de FT réparation. À cette fin, un modèle murin de FT réparation qui récapitule de nombreux aspects de la guérison chez les humains, y compris les troubles de l&#39;amplitude des mouvements et une diminution des propriétés mécaniques, a été développé et décrit précédemment. Voici une démonstration en profondeur de cette intervention chirurgicale est prévue, impliquant transection et réparation ultérieure du tendon fléchisseur des orteils (FDL) dans la patte arrière murin. Cette technique peut être utilisée pour effectuer une analyse de la lignée des différents types de cellules, d&#39;évaluer les effets du gain ou de la perte du gène de fonction, et de tester l&#39;efficacité des interventions pharmacologiques dans le processus de guérison. Cependant, il y a deux principales limites à ce modèle: i) le tendon FDL dans la partie médiane de la patte arrière murin, où le transection et la réparation se produisent, ne sont pas entouré par une gaine synoviale. Par conséquent, ce modèle ne tient pas compte de la contribution potentielle de la gaine au processus de formation de cicatrice. ii) Afin de protéger l&#39;intégrité du site de réparation, le FT est libéré à la jonction myotendineuse, ce qui diminue les forces mécaniques du tendon, a probablement contribué à l&#39;augmentation de la formation de cicatrices. L&#39;isolement de cellules suffisantes provenant du tissu de granulation du FT pendant le processus de guérison pour une analyse cytométrique en flux a révélé difficile; cytologique centrifugation pour concentrer ces cellules est une autre méthode utilisée et permet de générer des préparations de cellules sur lesquelles marquage immunofluorescent peut être effectuée. Avec cette méthode, la quantification des cellules ou des protéines d&#39;intérêt au cours de la guérison FT devient possible.

Le long fléchisseur des orteils (FDL) musculaire, situé dans le mollet, agit pour fléchir les chiffres de la patte arrière de la souris via le tendon fléchisseur (indiqué en bleu sur la figure 1A, et montré histologiquement à la figure 2A), qui fonctionne de manière proximale de la myotendineuse jonction et se termine par les phalanges distales. Dans ce modèle de tendon fléchisseur guérison, le tendon FDL est sectionnée et réparé à la mi-pied, à proximit...

tendons fléchisseurs de la main sont souvent blessés, conduisant à la fonction de la main avec facultés affaiblies. Cependant, la réponse de cicatrisation du tissu cicatriciel ne sont pas bien caractérisés. Un modèle murin de tendon fléchisseur de guérison est démontré ici. Ce modèle peut améliorer la compréhension globale du processus de guérison et d&#39;évaluer les approches thérapeutiques pour améliorer la guérison.

Murine Flexor Tendon blessures et chirurgie de réparation

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

L'objectif global de cette procédure chirurgicale est d'améliorer la compréhension des processus cellulaires et moléculaires de la formation de cicatrices et d'adhérences durant la cicatrisation des tendons fléchisseurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le processus de cicatrisation des tendons fléchisseurs, telles que les types cellulaires participant à la formation de la cicatrice et à la réparation. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de souris transgéniques et de souris knock-out afin de mieux comprendre le processus de cicatrisation.Cette technique peut identifier des cibles biologiques potentielles pour améliorer les résultats de la cicatrisation des tendons fléchisseurs, car elle facilite l'étude de ces populations cellulaires mal définies qui contribuent à la formation de cicatrices. Après avoir confirmé l'absence de réponse à une pincée des orteils, appliquer un onguent ophtalmique sur les yeux des animaux et raser le pelage de l'ensemble du membre postérieur. Stériliser le site chirurgical par des frictions successives à la povidone-iodée et à l'éthanol 70 %, puis localiser le fléchisseur digital long, ou tendon FDL, sur l'aspect médial du mollet.Ensuite, réalisez une incision de 0,5 à 1 centimètre dans la peau afin d'exposer le tendon. Utilisez la pince pour séparer le tendon du muscle fléchisseur des longs orteils (FDL) des tissus environnants et suivez le tendon jusqu'à la jonction myotendineuse. À l’aide de ciseaux à ressort, libérez le tendon au niveau de la jonction, en prenant soin d’éviter l’artère tibiale postérieure.Ensuite, fermer la peau à l’aide de points de suture en nylon 5-0. Transférer maintenant la souris sous un microscope stéréo et utiliser des ciseaux micro-chirurgicaux à ressort pour pratiquer une incision de trois millimètres sur la face postéro-latérale de la patte arrière. Utiliser la pince pour rétracter doucement les tissus mous et le muscle environnants, en prenant soin de minimiser les lésions tissulaires, et identifier le tendon du muscle fléchisseur des orteils (FDL).Ensuite, soulevez délicatement le tendon et utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour sectionner complètement le tissu. À l’aide de fils 8.0 en point de Kessler modifié, ligaturez les extrémités du tendon du muscle fléchisseur des orteils (FDL). Hydratez périodiquement le tendon avec du sérum physiologique au besoin tout au long de la procédure.Lorsque les extrémités ont été suturées, replacez le tissu mou et le muscle par-dessus le tendon et utilisez des sutures en nylon 5.0 pour fermer l'incision. Ensuite, placez la souris sur un réchauffeur de lame à 37 degrés Celsius avec surveillance jusqu'à ce qu'elle soit complètement réanimée. 24 heures avant le point final de l'expérience, injectez aux souris 100 micro litres d'EDU.Le lendemain, localisez le tendon réparé comme vient de l'être démontré, puis prélèvez le tissu sectionné. L'isolement du tissu granuleux entourant le tendon en cours de cicatrisation constitue une étape cruciale permettant l'analyse aminocytochimique ultérieure. Il est essentiel de minimiser au maximum l'inclusion de tissus périphériques.Placer le tendon dans une boîte de Pétri contenant un millilitre de collagénase. Ensuite, hacher les tissus avec le scalpel, puis procéder à la trituration des fragments par plusieurs passages à travers une aiguille de calibre 18. Transférer la suspension dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre et digérer les morceaux de tendon pendant une heure à 37 degrés Celsius sous agitation.À la fin de la digestion, centrifuger les suspensions de tissus et resuspendre les culots dans 500 µL de BSA à trois pour cent dans du PBS. Ensuite, filtrer les cellules à travers un tamis de 70 µm pour éliminer les débris et les gros morceaux de tendon non digérés. Puis placer les cellules dans une étuve à 37 °C.Transférez les fragments de tendon non digérés dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de collagénase fraîche, et mélangez les fragments par pipetage. Après une heure supplémentaire de digestion sous agitation, centrifugez à nouveau les fragments de tissu, puis resuspendez les culots dans 500 microlitres de PBS enrichi en BSA. Filtrez ensuite la suspension à travers un nouveau filtre cellulaire de 70 microns dans le tube contenant les cellules recueillies après la première digestion.Compter les cellules et les centrifuger. Ensuite, resuspendre le culot à une concentration de trois à six fois dix puissance quatre cellules par 100 microlitres de PBS supplémenté en BSA. Pour détecter l'incorporation d'EDU par immunocytochimie, utiliser d'abord un stylo hydrophobe pour délimiter un cercle autour des cellules sur les lames, puis fixer immédiatement les échantillons avec 150 microlitres de paraformaldéhyde à trois pour cent dans du PBS, à température ambiante.Après 15 minutes, rincez les cellules avec deux lavages de cinq minutes chacun dans 150 microlitres de PBS supplémenté en BSA. Ensuite, perméabilisez les échantillons avec du Triton X-100 0,5 % dans du PBS pendant 20 minutes. Après le lavage tel que décrit ci-dessus, ajoutez 150 microlitres de cocktail de réaction EDU fraîchement préparé aux cellules pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.Ensuite, lavez à nouveau les cellules et contre-tendez les échantillons avec 150 microlitres de Hoechst. Après 30 minutes à température ambiante, ajoutez une à deux gouttes de milieu de montage antifade sur les cellules, puis recouvrez soigneusement chaque échantillon avec une lame couvre-objet, en prenant soin d'éviter les bulles. Laissez polymériser le milieu de montage toute la nuit à l'abri de la lumière et à température ambiante.Ensuite, scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent. Enfin, observez les lames au microscope fluorescent en utilisant un grossissement de 40X. En cas de réparation réussie, le tissu de granulation présente une cellularité fortement accrue par rapport au tendon non lésé.Dans cette image, un exemple histologique de réparation de tendon fléchisseur rompu est présenté. Le marquage par l'EDU met en évidence uniquement les cellules qui prolifèrent activement au cours des 24 heures suivant l'administration d'EDU chez des souris vivantes. Cela permet une évaluation quantitative de la prolifération au sein du tissu de granulation du tendon en cicatrisation.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une chirurgie de lésion et de réparation du tendon fléchisseur chez la souris, afin de mieux comprendre les populations cellulaires qui contribuent à la formation de la cicatrice dans le tendon fléchisseur pendant la cicatrisation.

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Source : Dalkin, W., et al. La méthode des lésions du nerf fibulaire : un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparent les jonctions neuromusculaires. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre une intervention chirurgicale visant à induire une lésion du nerf fibulaire chez une souris afin d’étudier la régénération de la jonction neuromusculaire (JNM). La procédure consiste à exposer le nerf fibulaire, à appliquer une pression contrôlée pour induire une lésion et à s’assurer que...

Induction d’une lésion du nerf fibulaire chez une souris pour étudier la régénération de la jonction neuromusculaire

Ce protocole décrit un modèle de souris de chirurgie orthopédique qui a été utilisée pour étudier les mécanismes de la neuro-inflammation postopératoire et les changements de comportement et lorsqu’il est combiné avec parabiose, pour étudier la régénération des tissus au cours du vieillissement.

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Dans cet article, nous présentons un protocole in vitro et in situ pour réparer un espace tendineux allant jusqu’à 1,5 cm en le remplissant d’une greffe de collagène modifiée. Ceci a été réalisé en développant une technique de suture modifiée pour prendre la charge mécanique jusqu’à ce que le greffon mûrisse dans le tissu hôte.

Une nouvelle technique de suture Tenorrhaphy avec greffe de collagène issue d’une ingénierie tissulaire pour réparer les gros défauts tendineux

Ici, nous présentons un protocole pour décrire une technique mini-invasive pour l'immobilisation d'articulation de genou dans un modèle de rat. Ce protocole reproductible, basant sur le modus de séparation de muscle-écart et la compétence de mini-incision, est approprié pour étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent de la contracture commune acquise.

Une technique de fixation interne mini-invasive pour étudier la contracture de flexion du genou induite par l'immobilisation chez les rats

Ici, nous présentons une technique de suture « » qui peut être effectuée dans la réparation du tendon et ses effets sur la formation d’écart et la force de traction des tendons réparés. La suture Q s’est avérée efficace pour améliorer la résistance à la traction et la force de réparation de tendon.

Utilisation de la suture Q pour renforcer la résistance à la formation d’écart et la résistance à la traction des tendons fléchisseurs réparés

Le présent protocole illustre une méthode d’évaluation des propriétés biophysiques des réparations tendineuses ex vivo. Un matériau de suture en polytétrafluoroéthylène (PTFE) a été évalué par cette méthode et comparé à d’autres matériaux dans différentes conditions.

Polytétrafluoroéthylène (PTFE) comme matériau de suture en chirurgie tendineuse

L’articulation complexe cheville-sous-talienne (ASCJ) est le noyau du pied et joue un rôle clé dans le contrôle de l’équilibre dans les activités quotidiennes. Les blessures sportives entraînent souvent une instabilité de cette articulation. Nous décrivons ici un modèle murin d’instabilité de l’ASCJ induite par la transsection ligamentaire.

Un modèle murin d’instabilité de l’articulation complexe cheville-sous-talienne

Cette étude détaille les procédures permettant d’établir une lésion chronique de la coiffe des rotateurs (RC) de lapin. Plus précisément, la lésion est créée dans l’unité muscle-tendon/myotendineuse sous-scapulaire (SSC) pour imiter l’anatomie et la physiopathologie de la RC humaine, y compris la dégénérescence graisseuse musculaire sévère (DF). Ce protocole peut être appliqué à l’étude des lésions RC et à l’évaluation des thérapies régénératives.

Développement d’un modèle de lésion chronique de la coiffe des rotateurs chez le lapin pour l’étude de la fibrose et de la dégénérescence graisseuse musculaire

Nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée et un protocole de culture tissulaire qui recrée le changement fibrocartilagineux induit par le conflit de l’insertion du tendon d’Achille dans les explants murins des membres postérieurs avec une viabilité cellulaire soutenue, fournissant un modèle adapté à l’exploration de la mécanobiologie du conflit tendonineux.

Modèle d’explant murin d’un membre postérieur pour l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille

Nous décrivons deux méthodes de tests sensoriels tactiles pour des périodes aiguës ou chroniques de lésions de la moelle épinière chez le rat. Ces procédures validées peut détecter le développement et la maintenance de l'allodynie des sensations semblables.

Aiguë et chronique Test tactile sensorielle après un traumatisme médullaire chez le rat

Apprenez la chirurgie de réparation des tendons fléchisseurs chez la souris pour étudier la cicatrisation et identifier les cellules impliquées dans la formation de cicatrices. Ce modèle murin permet d'explorer des cibles thérapeutiques pour améliorer les résultats de guérison.

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