Name: לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד ללכוד ולשחרר תאי גידול מחזוריים חיים מדם מלא באמצעות מיקרופילטר מצופה PIPAAm. שיטה זו מאפשרת ניתוחי RNA ותרבית תאים לחקר גרורות והתקדמות מחלת הסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל החולים שתרמו דגימות דם כדי לתמוך בעבודה זו. אנו מודים לד"ר ג'וזפה ג'יאקון, ריטש פראג'ולי ומארק א. ליפמן על עזרתם ברכישת דגימות קליניות, ולד"ר כרמן גומז, ראלף לנדגרף, סטפן זוכנר, טומי גוטוש, דיאנה לופז על הדיונים מלאי התובנות שלהם. ג'נג אאו מודה לתמיכה חלקית וסיוע מהתוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן ע"ש שילה ודיוויד פואנטה, מרכז הסרטן המקיף של סילבסטר.

משפט ואתיקה: כדי להגן על זכויותיהם של בני אדם, דגימות דם נלקחו לאחר הסכמה מדעת לפי הפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת ועדות בוחנות מוסדיים מיאמי תחת IRB 20,150,020. הערה: דם להיות מסוננים עבור לכידת CTC יש לאסוף בצינור EDTA כדי למנוע קרישה. 1. ציפוי Microfilter עם midi (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול PIPAAm להכין פתרון 10% w / v ב butanol. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלסטיק Cut מחליק לתוך בערך 12 מ&quot;מ x 12 מ&quot;מ ריבועים או עם זוג מספריים או סכין חדה. לחלופין להשתמש גיליוטינה. הערה: ריבועים אלה ישמשו כמחזיק לקריטריונים במהלך תהליך ציפוי ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים חד קצה ישר, לחתוך את פרוסות Microfilter חריץ הנקבוביות אל 8 מ&quot;מ x 8 ריבועים מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סרט סרט polyimide לאבטח את המסננים לחתוך על squa הפלסטיקמיל בעבר לחתוך בשלב 1.3. החל את הסרט רק על קצה בפינת מסנן כך לפחות 7 מ&quot;מ X 7 מ&quot;מ של שטח סינון הוא בלתי מכוסה על ידי הקלטת. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> איור 2:. איור נציג של הקמה Microfilter עבור PIPAAm ציפוי 8 מ&quot;מ x Microfilter 8 מ&quot;מ ממוקמת על קיצוץ 12 מ&quot;מ x 12 מ&quot;מ פלסטיק מרובע של שקופית מיקרוסקופ פלסטיק. קלטת Polyimide משמש כדי לאבטח את Microfilter במקום להסתובב המעיל PIPAAm.Reproduced באישור התייחסות 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Microfilter כי הוא מאובטח על ריבוע הפלסטיק, על צ&#39;אק ואקום של coater-ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את coater ספין כדי המתכון הבא: התחל, 500 סל&quot;ד במשך 10 שניות, 6,000 rבערב במשך 60 שניות, 500 סל&quot;ד במשך 10 שניות, עצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר מספיק 10% w / v פתרון PIPAAm (שהוכנו 1.1) כדי לכסות את פני השטח Microfilter לחלוטין בעזרת פיפטה העברת פלסטיק רגיל ולהתחיל את coater ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Microfilter PIPAAm מצופה מן-coater הספין לאחר תהליך הציפוי הושלם. השאר את המסנן מצורף ריבוע הפלסטיק במהלך האחסון. הערה: ניתן לאחסן פילטר מצופה בטמפרטורת החדר למשך עד 3 חודשים. </li></ol> 2. האסיפה של קלטת סינון עם PIPAAm מצופה Microfilter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם Microfilter PIPAAm מצופה בטמפרטורת החדר ידי הצבת Microfilter עדיין מאובטחת על ריבוע הפלסטיק לתוך צלחת פטרי. הוסף PBS 1x עד Microfilter הוא שקוע לחלוטין ולתת לעמוד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב הידרציה, שחרר את המסנן מכיכר הפלסטיק על ידי חיתוך קלטת סרט polyimide בעזרת זוג מספרי. הערה: שים לב באיזה צד של המסנן ישציפוי PIPAAm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את Microfilter לתוך קלטת הסינון, על ידי רבדת Microfilter בין יצירת אקריליק העליונה ותחתונה יחד עם חתיכות 2 polydimethylsiloxane (PDMS) מתנהגות כמו אטם / חותם. הצמד את קלטת אקרילי עם קליפים לאבטח את המסנן ולספק חותם חזק. הערה: ציפוי PIPAAm צריך לפנות כלפי מעלה, כדי המדגם מסונן דרך, התא יהיה שנתפס על PIPAAm משטח מצופה של המסנן (איור 1). </li></ol> סינון 3. דגימת דם עם לכידת שחרור CTC מן Microfilter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כל מותג מזרק משאבה יש ממשק משתמש משלו, עיין במדריך למשתמש של המשאבה לתכנת את משאבת מזרק לזרום בקצב של 75 מ&quot;ל / שעה ו להגדיר את עוצמת ל -20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 מיליליטר חם של של מקוי (זמינה מסחרי) תקשורת תרבית תאים (שהוכן על ידי הוספת 10% בסרום שור עוברי 1% פניצילין סטרפטומיצין) ל -37 מעלות צלזיוס. <br /&gt; הערה:. בחירת התקשורת תתבסס על סוג הסרטן של החולה או אחר אם זה הוא ניסוי מערכת מודל שבו תאים בתרבית יש זנקו לתוך דם מתורם בריא, להשתמש בתקשורת התאים הם בדרך כלל בתרבית אם אינך בטוח, עיין למדריך culturing / שיטה שמספקת חברת התאים נרכשו מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7.5 מ&quot;ל של זמינים מסחרית מלח מאוזן של האנק פתרון (HBSS) המדגם 7.5 מ&quot;ל של דם לשאוב דם מדולל זה לתוך מזרק 25 מ&quot;ל. הערה: כוונן את עוצמת הקול של HBSS כך דגימת דם מדולל עם נפח שווה של 1: 1 עם HBSS לדוגמא אם 10 מ&quot;ל של דם משמש, ואז לערבב עם נפח שווה של 10 מ&quot;ל HBSS כדי להשיג את 1:. דילול 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעסיק את קלטת סינון עם המזרק ומניחים אותו על משאבת מזרק. מניחים שפופרת 50 מ&quot;ל לעבר התחתונה כדי לאסוף את הזרימה דרך ולהתחיל את המשאבה. הערה: הסינון יארך 10 12 דקות. כל צעדי הסינון נועדו להתבצעבטמפרטורת החדר הרגיל (C ° 20-25) כוללים שלב 3.8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסינון יושלם, לנתק את בשים לב קלטת סינון באיזה צד הוא העליון כי יש התאים נתפסו על המשטח המצופה PIPAAm. לשאוב 1 מיליליטר של התקשורת בתרבות החמה לתוך מזרק חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשוב וללבוש את קלטת סינון עם מזרק המכיל התקשורת, אך בשלב זה להעסיק את הקצה התחתון של הקלטת כך את פני השטח מצופה PIPAAm של המסנן מול הרחק מזרק. הערה: זה יהיה לשחרר את כל תאים שעשויים להיות מוטבע לתוך הנקבוביות חריץ על ידי יישום זרימה הפוכה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להכניס את המזרק שוב על משאבת המזרק וחזק בצלחת פטרי קטנה או צלחת 6-גם ממש מתחת קלטת הסינון. הגדר את קצב הזרימה 100 מ&quot;ל / שעה ולהתחיל את המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את כל התקשורת דרך המסנן ולאסוף את הזרימה דרך בצלחת פטרי. חכה כל התקשורת לעבור ולאחר מכן להפסיק את המשאבה ולהסיר את המזרקקלטת סינון nd מהמשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתקתי את קלטת הסינון מן המזרק ולפתוח אותו כדי לאחזר את המסנן מתוך הקלטת. מניח את המסנן עם משטח PIPAAm פונה כלפי מטה לתוך אותו בצלחת פטרי לאיסוף הזרימה ההפוכה כאשר משחררים את התאים מן הנקבוביות. מוסיפים את שאר כלי התקשורת חמים ומניחים בצלחת פטרי לתוך תרבות חממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות כל התאים ישוחררו מהמסנן. עם זאת, לעזוב מסנן בצלחת פטרי עבור עד 24 שעות על מנת להבטיח את כל התאים לנתק. הערה: לחילופין, התאים שוחרר ניתן לאסוף לתוך צינור microcentrifuge לבצע ניתוח נוסף במורד הזרם כגון PCR, ELISA, כתם המערבי שם כמה דוגמאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות בתרבות, להסיר בזהירות את Microfilter באמצעות מלקחיים. הערה: המסנן יכול להיות מושלך בשלב זה כמו התאים כבר להשתחרר ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה מדיום התרבות מעלה ומטה באמצעות 1,000 &amp; #181; פיפטה l, מחדש להשעות אריתרוציטים ותא דם היקפיים mononuclear (PBMC), כי הם נתפסו על המסנן ושוחרר לתוך צלחת עם CTC. בצע פעולה זו בזהירות ובעדינות להימנע ניתוק התאים הסרטניים המצורפים הרופף. מוציאים בזהירות את המדיום כולו המכיל אריתרוציטים מחדש מושעה ו PBMC תוך השארת תאים סרטניים מצ&quot;ב תחליף עם מדיום חדש מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה ניתן לחזור פעם אם אריתרוציטים מוגזמים נוכחים לאחר לשטוף אחד. </li></ol> 4. הערכת כדאיות CTC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת כדאי CTC תרבותיות באמצעות assay Live / Dead 8. הערה: רבי Live / מבחני מלח זמינים מסחרי. בעקבות הפרוטוקול של היצרן מומלץ מאוד. עיין ברשימת חומרים / ריאגנטים עבור ערכת assay המסחרית המשמשת לצורך הניסוי הזה. </li></ol>

<ol><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer%3A+SWOG+S0500%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li>
<li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li>
<li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179(2013).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li>
<li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li>
<li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li>
<li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+pathology%22%5BJournal%5D)">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li>
<li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li>
<li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture%2C+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PHT%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li>
<li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+%28CTCs%29+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li>
<li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li>
<li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li>
<li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+polymeric+surfaces%3B+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Makromol.+Chemie%2C+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li>
<li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li>
<li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer%3A+a+retrospective+study+in+107+patients%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403(2015).</li>
</ol>

חלק מעבודה זו מוגן תחת בקשת פטנט זמנית בארה"ב מס' 62/219,808. Siddarth Rawal הוא בעל מניות ב-Circulogix Inc. המייצרת באופן מסחרי את המסננים וקלטות/מחסניות המסננים המשמשים במאמר זה.

התהליך לכיד CTC קיימא מהדם כולו ומשחרר אותם מן Microfilter הוא פשוט יחסית; עם זאת כמה נקודות קריטיות שווים אזכור. זה הכרחי, כמו עם כל תרבית התאים כי תנאי סטרילית נשמרים לאורך התהליך כולו. השלב הראשוני של ציפוי המסנן עם PIPAAm הוא קריטי, כבסיס הטכניקה של שחרור התאים ממסנן מבוסס על ניצול מאפייני interfacial תגובת הטמפרטורה של PIPAAm. כדי להבטיח את המסנן כבר מצופה ביעילות, למדוד את הגודל נקבובי (רוחב ואורך של נקבובי חריץ) על המסנן תחת מיקרוסקופ לפני ציפוי ואז שוב למדוד ציפוי פוסט גוד...

מחלה גרורתית היא אחראית למותם של הסרטן ביותר. פיתוח סמנים ביולוגיים אבחון פרוגנוסטיים וכמלווה גרורות חיוני בניהול וטיפול בסרטן. בתאי גידול במחזור (CTC) לשחק תפקיד מרכזי בהפצת גידול וגרור. יתר על כן, להיות נגיש בקלות כמו ביו-מרקר &#39;ביופסיה נוזלית&#39;, CTC בחולי סרטן דם ההיקפי כבר עולה כ &#39;חממה&#39; למחקר ביו-מרקר הסרטן. CTC אומתו גם ביומרקר פרוגנוסטיים במסגרות שונות לחולי סרטן, כולל סרטן השד, הערמונית וסרטן המעי הגס 1 - 3. עם זאת, התקדמות בתחום CTC ציינה כי הספירה בלבד של תאים הנדירים אלה הגבילה תועלת קלינית, כפי שמוצגת ניסויים קליניים התערבותיים 4. לפיכך, קיים צורך המתעורר עבור טכנולוגיות המאפשרות אפיון מולקולרי ופונקציונלי של CTC. נכון לעכשיו, רק כמה טכנולוגיות קיימות המאפשרות FOr הלא אנטיגן מוטה, לכידת קיימא ושחרור CTC, מה שמאפשר 5,6 ניתוח מולקולרי ופונקציונלי במורד חזק. רוב התקנים microfabricated אלה הם מצמידים את פלטפורמות microfluidic ולכן יש גורם מגביל את כמות הדם שניתן לעבד, שנעה בין 2-4 מ&quot;ל 7 - 10. CTC הם אירועים נדירים בתוך שפופרת אחת של לקיחת הדם (7.5 מ&quot;ל), ולכן מקטינים עוד יותר את כמות הדם שניתן לעבד, מאוד מעכבת את סיכויי לכידה לבודד תאים אלה של עניין. פתחנו שני סוגי מכשירי Microfilter קרום Parylene C בתמורה ללכידתו של CTC המנצלת את ההבדלים בגודל בין תאים סרטניים גדולים ואת תאי דם הנורמלים הקטנים 11,12. יש לנו הדיווח בעבר על מסנן הספירה נקבובית העגול והשוו אותו עם פלטפורמת ה- FDA, שבו Microfilter הוצגה להיות מעולה יעיל ללכוד CTCעבור דגימות דם לחולה סרטן 13,14. עם זאת, מגבלה של המסנן העגול הוא הצורך להשתמש מקבעים משחררי פורמלדהיד לפני הסינון. תהליך זה שומר על מורפולוגיה תאים ובמקביל לאפשר להם לעמוד מאמץ הגזירה ולחץ במהלך תהליך הסינון. בעוד ספירה ומחקרים מולקולריים יכולים להתבצע על-שבב 13, מקבע פוגעת ביכולת לבצע אפיון פונקציונלי. כדי לתת מענה על מגבלה זו, פתחנו מסנן נקבובי חריץ השולל את הצורך לתקן תאים לפני הסינון (איור 1). החריץ הנקבובי הגיאומטריה (6 מיקרומטר הרוחב x 40 מיקרומטר נקבוביים חריץ אורך) מאפשרת לתאי הגידול להיות בשבי בזמן חלקי בלבד גורם לחסימה נקבובית ולכן עדיין המתיר מעבר חופשי עבור תאי דם אחרים והקלו על עליית לחץ שתוביל ניזק לתאים עד להתפקע סופי 15,16 מחסנית חריץ הנקבובית הורכב מ -2 חלקים אקרילי אשר כריךהחריץ הנקבובי מסנן בין היצירה העליונה ותחתונה עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתנהג כמו אטם לספק דליפת הוכחת חותם 14,15 (איור 1). בעוד יעילות לכידתו של מסנן חריץ הנקבובי גבוהה, (לוח 1), שנתפס CTC המאוגדים קרום Parylene C על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות הלא ספציפיות חזקות במקום תאי מטריקס (ECM) בתיווך הידבקות 15. שיטות כגון זרימה הפוכה או שימוש מגרדים תאים מצליחים לשחרר את התאים ביעילות ממסנן, או לגרום נזק לתאים תהליכי המוות התאי. בדקנו שימוש לא שגרתי של PIPAAm לגבש אסטרטגיה שחרור 15. PIPAAm הוא פולימר אשר עובר עיבוד טמפרטורת פתרון הפיך נמוכים קריטית (LCST) המעבר לשלב בטמפרטורת פתרון של 32 מעלות צלזיוס 17. באופן מסורתי, נכס זה של PIPAAm נחקר נרחב עבור יישומי הנדסת רקמות. בדרך כלל, תאיםבתרבית על PIPAAm מצופה משטחים על 37 מעלות צלזיוס כאשר PIPAAm הוא הידרופובי. התאים לאחר מכן ניתן מנותקים כסיד כאשר טמפרטורת התרבות מוסטת אל מתחת ל 32 מעלות צלזיוס, שבו המשטח המצופה PIPAAm הופך 17,18 התייבשות. אנו לנצל נכס תרמית זו על ידי ביצוע תהליך הסינון בטמפרטורת חדר (מתחת ל -32 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן המאפשר שחרור תא על ידי צבת המסנן בתקשורת תרבות על 37 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, שכבת הפולימר PIPAAm הופך הידרופובי, ובכך לשחרר את כבול אלקטרוסטטי תאים 15 (איור 1). למרות שיטת טמפרטורת התגובה כמו גם שיטות אחרות יושמה בהצלחה להשיג ללכוד CTC קיימא ולשחרר 19 - 21, חסרון פוטנציאלי עיקרי אחת משותף טכנולוגיות אלה המדווחים כי הם כולם משתמשים עיקרון אנטיגן התלוי עבור לכידת CTC. מבוסס Antigen ללכוד CTC, כמוצג previously, עלול להוביל 11,14 ניתוח CTC מוטה. לדוגמה, טכנולוגיות רבות מבוססי זיקה להעסיק נוגדן אשר נקשר EpCAM עבור לכידת CTC. עם זאת, CTC הוכח מבטאים רמות שונות של EpCAM, שמוביל השמטת EpCAM נמוך EpCAM שלילית CTC על ידי הטכנולוגיות הללו. כמו כן, מגבלות עלולות להתרחש כאשר CTC מהמקור שאינו אפיתל הוא של עניין, כגון CTC במסגרות מלנומה סרקומה. לכן, טכנולוגיה המאפשרת ללכוד קיימא CTC ושחרור ללא הטיה פוטנציאלית הציגה ידי לכיד מבוסס אנטיגן רצויה מאוד. חשוב לציין, מכשיר Microfilter ללכוד הוא בגודל מבוסס אך ורק ואת אסטרטגיית השחרור היא אגנוסטי לנוכחות של סמני משטח מסוימים. אנו מאמינים כי העסקתו של Microfilter מצופה PIPAAm יסייע להרחיב את הבנתנו את תהליך גרורתי, באמצעות מתן היכולת בצורה אפקטיבית ויעילה ללכוד ולשחרר CTC עבור ניתוחים במורד הזרם. מאי זה חזקially לחשוף מולקולות חדשות עבורו טיפולים מערכתיים ממוקד רומן עשויים להיות מופנים כמו גם לספק סמן ביולוגי כי ניתן לפקח בקלות וסיוע בניהול חולה סרטן.

<table><tbody><tr><td>מסנן חריץ</td><td>Circulogix Inc.</td><td>MSF-01</td><td>מסננים בגדלים שונים זמינים על בסיס סינון ל-CTC מדם או שתן (www.circulogixinc.com)</td></tr><tr><td>poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)&nbsp;</td><td>Ploysciences בע"מ</td><td>21458</td><td>לא מסוכן. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>1-בוטנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B7906</td><td>השתמש באזור מאוורר היטב</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ פלסטיק</td><td>Cole-Parmer</td><td>48510-30</td><td>ניתן להשתמש בכל שקופיות פלסטיק או לחילופין כל סוג של ריבוע (מתכת, אקריליק וכו ') אם זה יהיה חבילה להחזיק את ריבוע המסנן 8 מ"מ x 8 מ"מ</td></tr><tr><td>ספין ציפוי</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>SCS G3 ספין ציפוי</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>פולימיד קלטת Uline</td><td></td><td>S-7595</td><td>פולימיד הוא השם הגנרי לקלטת קפטון שניתן לרכוש ממספר ספקים (אמזון, Kaptontape.com)</td></tr><tr><td>HBSS- תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי פלקון 35 x 10 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>קלטת מיקרופילטר</td><td>Circulogix Inc.</td><td>FC-01</td><td>מותאם אישית ניתן להשיג על סמך סינון ל-CTC מדם או שתן&nbsp;</td></tr><tr><td>מזרק 20 מ"ל</td><td>BD Scientific</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>KD scientific&nbsp;</td><td>78-0100V</td><td>ניתן להשתמש בכל משאבת מזרק המסוגלת להחזיק מזרק של 25 מ"ל</td></tr><tr><td>Cellstar 50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>82050-322</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio One 6 בארות צלחת</td><td>VWR</td><td>89131-688</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג, כל עוד המשטח תואם להתאמה של תאים ולא דוחה</td></tr><tr><td>תאי SKBR3 ATCC</td><td></td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>Live Dead Assay</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>כל בדיקה שיכולה לספק ניתוח סביר להערכת תאים חיים תעבוד</td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>VWR</td><td>98000-368</td><td>כל חממה שיכולה לשמש לתרבית תאים תספיק</td></tr></tbody></table>

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

אנו מדגימים שיטה ללכוד גודל מבוסס של תא הקיימא מחזור גידול (CTC) מן הדם כולו, יחד עם שחרורו של תאים אלה בין שבב לניתוח במורד זרם ו / או תרבות. האסטרטגיה מעסיקה את השימוש של Microfilter הנקבוביות חריץ קרום Parylene C רומן ללכוד CTC וציפוי של פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) עבור thermoresponsive שחרור קיימא של CTC בשבי. לכידתו של תאי חיים מופעלת על ידי מינוף העיצוב של גיאומטריה נקבובית חריץ עם ממדים ספציפיים כדי להפחית את לחץ הגזירה מזוהה בדרך כלל עם תהליך הסינון. בעוד Microfilter מפגין יעילות גבוהה ללכוד, השחרור של תאים אלה הוא לא טריוויאלי. בדרך כלל, רק אחוז קטן של תאים משתחררים כאשר טכניקות כגון זרימה הפוכה או גירוד תא משמשות. ההידבקות החזקה של תאי סרטן אפיתל אלה קרום Parylene C נובעת אינטראקצית אלקטרוסטטית הלא ספציפית. כדי לנטרל את ההתוצאה היא, שיישמנו השימוש ציפוי PIPAAm וניצלו נכסים interfacial תגובה תרמית שלה כדי לשחרר את התאים מן הסינון. דם מסונן הראשון בטמפרטורת החדר. להלן 32 ° C, PIPAAm הוא הידרופילי. לאחר מכן, המסנן להציב גם בתקשורת תרבות או חיץ על 37 מעלות צלזיוס, שתוצאתו PIPAAm מפנה הידרופובי, ולאחר מכן משחרר את התאים מאוגדים אלקטרוסטטי.

באמצעות הדם &quot;תורמים בריאים (שהושג תחת פרוטוקול שאושר על ידי אונ&#39; מיאמי IRB 20,150,020 בעקבות הסכמה מדעת) ומשובץ תאים סרטניים בתרבית, טכניקת thermoresponsive לשחרורו של תאים במחזור גידול קיימא (CTC), לכידת מושגת, שחרור ויעיל יחזרו של 94% ± 9%, 82% ± 5% ו -77% ± 5% בהתאמה (לוח 1) 15. לשם השוואה, יעילות השחרור ואחזור של מסננים ללא ציפוי היו נמוך משמעותיות (7% ± 1% יעילי שחרור ו -6% ± 1% יעילים יחזרו) (לוחות...

פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ &#39;דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא ללכוד ביעילות תאי גידול במחזור הדם החיים, או CTCs, מתוך דם מלא. ניתן להעביר CTCs אלו לתרבית או להשתמש בהם לאנליזות המשך הדורשות דגימות שאינן מקובעות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגריור (metastasis).ניתן להשתמש בשיטה זו גם למעקב אחר התקדמות המחלה, תגובה לטיפול והערכת הסיכון לחזרה של המחלה. היתרון של טכניקה זו הוא היכולת לבצע לכידה ללא סימון (label-free) של CTCs חיים מכל גידול מוצק, תוך שרירותיות לביטוי של סמנים ביולוגיים. הרעיון לשחרר את ה-CTCs מהמסנן עלה תחילה מכיוון שרצינו לבצע ניתוחי RNA וטיפוח של CTCs בשלבים מאוחרים יותר, במקום לטפח אותם in-situ על המסנן.כדי להתחיל בניסוי, שקלו כמות מספקת של PIPAAm להכנת תמיסה בריכוז של 10% משקל לנפח בתוך מבחנה של 15 מיליליטר המכילה בוטנול. ערבבו את המבחנה ב-Vortex עד שהתמיסה תהיה צלולה. לאחר מכן, גזרו זכוכית של סליידים למיקרוסקופ לריבועים של בערך 12 מילימטר על 12 מילימטר בעזרת מספריים.לאחר מכן, באמצעות מספריים בעלי קצה ישר וחד, חתכו פרוסת מיקרופילטר בעלת נקבי חריץ לריבועים של שמונה מילימטרים על שמונה מילימטרים והניחו חלקים אלו ישירות על הריבועים מפלסטיק. בעזרת סרט דבק פולימיד,ידבקו את המסננים החתוכים לריבועי הפלסטיק, אך רק בקצה ובפינה של המסנן, כך ששטח מסנן של לפחות שבעה מילימטרים על שבעה מילי

capture-and-release-of-viable-circulating-tumor-cells-from-blood

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

אנו מציגים גישה חדשה כדי לאפיין תאים סרטניים. אנו משלבים immunofluorescence עם ה-DNA פלורסנט -מקומיים-הכלאה כדי להעריך את התאים שנתפסו על ידי חוט רפואי functionalized מסוגל ויוו מעשיר CTCs ישירות מדם החולה.

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.

הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למד ללכוד ולשחרר תאי גידול מחזוריים חיים מדם מלא באמצעות מיקרופילטר מצופה PIPAAm. שיטה זו מאפשרת ניתוחי RNA ותרבית תאים לחקר גרורות והתקדמות מחלת הסרטן.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

גלה סרטונים נוספים