Name: Croissance différée Essai dinhibition pour quantifier leffet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez l'essai d'inhibition de croissance différée pour évaluer quantitativement la compétition entre isolats bactériens et comprendre les dynamiques des communautés microbiennes.

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La méthode suivante est adaptée pour tester des souches 7,8 concurrent avec des souches productrices d&#39;inhibiteur. NOTE: Ce protocole implique la production d&#39;aérosols avec des cultures bactériennes. Cela ne peut être réalisé dans un espace confiné avec la mise en œuvre des considérations de sécurité localement approuvés. La pulvérisation de la culture sur les plaques d&#39;agar-agar dans une enceinte de sécurité de niveau 2 à minimiser la contamination des plaques d&#39;agar-agar et le milieu environnant. Cela permettra également de protéger le chercheur de l&#39;inhalation d&#39;aérosols des bactéries pulvérisées, ceci est une préoccupation majeure si le chercheur utilise un niveau de confinement 2 organismes. équipement de protection individuelle approprié doit être porté. La zone entourant la boîte de Pétri est mieux recouverte d&#39;un tissu absorbant jetable. décontamination post-pulvérisation en utilisant la lumière UV est conseillé. 1. Préparation des plaques d&#39;agar <ol><li> Préparer la perfusion cardiaque du cerveau (BHI) agar conformément à la fabriles instructions cant. </li><li> Autoclave l&#39;agar BHI à 121 ° C, 15 psi pendant 20 minutes, ou selon les recommandations du fabricant autoclave, à stériliser. </li><li> Verser 15 ml aliquotes de gélose BHI stérilisée dans des boîtes de Pétri stériles et laisser durcir. REMARQUE: Assurez-vous chaque plaque de gélose à être utilisé dans le test provient du même stock d&#39;agar et qu&#39;il y a la même quantité de gélose dans chaque plaque. Cela limite la variabilité des nutriments disponibles et inhibiteur de diffusion entre les plaques permettant la comparabilité. </li></ol> 2. Préparation stérile Broth <ol><li> Préparer un bouillon BHI conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Ajouter des aliquotes de 10 ml de BHI à 28 ml en verre bouteilles universelles. </li><li> Autoclave le bouillon BHI à 121 ° C, 15 psi pendant 20 minutes, ou selon les recommandations du fabricant autoclave, à stériliser. REMARQUE: Veiller à tout le bouillon utilisé dans l&#39;essai provient du même lot de bouillon autoclaved en même temps, afin de limiter la variation de nutriments qui pourraient provoquer des variations dans les résultats. </li></ol> 3. Préparation de bouteille stérile Vaporisateur (s) <ol><li> Démonter la bouteille de vaporisateur. </li><li> Vaporiser 5% agent de nettoyage actif à travers la bouilleur pour éliminer les contaminants internes, faire tremper le bouilleur bouteille, couvercle et bouilleur dans la surface agent de nettoyage actif de 5% du jour au lendemain. NOTE: Les gants et les équipements de protection individuelle approprié doivent être utilisés lors de la manipulation agent de nettoyage actif. </li><li> Sécher le vaporisateur, le couvercle et les bouteilles sous hotte à flux d&#39;air stérile. </li><li> Remplir la bouteille avec 70% d&#39;éthanol, rattachez vaporisateur et vaporiser un peu de l&#39;éthanol à travers le vaporisateur. </li><li> Mettez le couvercle sur le vaporisateur et le stocker avec l&#39;éthanol à l&#39;intérieur jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li><li> Immédiatement avant utilisation, aseptique rincer la bouteille avec le bouillon de BHI stérile et pulvériser le bouillon à travers le vaporisateur. NOTE: Ceci empêche le aff d&#39;éthanolète l&#39;inoculum ajouté à la bouteille dans la section 6.3. </li></ol> 4. Préparation de la culture bactérienne Nuit (s) <ol><li> Streak le concurrent et l&#39;inhibiteur des souches sur une plaque de gélose BHI stérile et incuber à 37 ° C aérobies pendant environ 18 heures (la nuit). NOTE: Cette plaque produit un stock de bactéries qui peuvent être utilisées pour de multiples répétitions au sein de la même semaine lorsqu&#39;elles sont conservées à 4 ° C. </li><li> Inoculer 10 ml de bouillon BHI stérile avec une seule colonie de la souche bactérienne concurrent requise dans un flacon de 28 ml universel. </li><li> Incuber la bouteille universelle à 37 ° C en aérobiose nuit en agitant à 250 tours par minute dans un agitateur orbital. </li></ol> 5. spot Culture de l&#39;Isolat Inhibitor produisant <ol><li> Préparer la culture (s) pendant la nuit, comme décrit à la section 4. </li><li> Veiller à des plaques d&#39; agar sont complètement sèches, sans condensation sur le couvercle, avant l&#39;inoculation (par exemple en incubant plate pendant 60 min à 37 ° C); ce qui empêche l&#39;inoculum de se propager à travers la plaque à partir du site d&#39;inoculation. </li><li> Introduire à la pipette 25 ul de la culture d&#39;une nuit sur le centre des plaques d&#39;agar-agar. Enfoncer complètement éviter le piston de la pipette pour éviter que des bulles d&#39;air qui pulvérisent la culture à travers l&#39;agar. </li><li> Laisser la culture sécher à la température ambiante pour limiter la propagation de la culture. Incuber les plaques de gélose à 37 ° C en milieu aérobie pendant une nuit. </li></ol> 6. Préparation de la pulvérisation de l&#39;inoculum de la souche d&#39;un compétiteur de test (s) <ol><li> Préparer la culture de la nuit , comme décrit dans la section 4. Diluer la nuit culture 10 fois dans un bouillon BHI pour donner environ 4 x 10 6 CFU ml -1, et une suspension de 600 OD 0,3 ± 0,05. NOTE: Une 10 fois la dilution ne donnera pas 4 x 10 6 CFU ml -1 pour toutes les espèces bactériennes, calculer le facteur de dilution nécessaire par la propagation de placage des dilutions en série entre 1 x 10 <sup&gt; -1 -1 x 10 -6. </li><li> Verser la culture diluée dans un flacon de parfum vaporisateur plastique stérile. REMARQUE: Le volume total doit être supérieur à celui nécessaire pour le nombre de plaques d&#39;agar-agar pulvérisé. Environ 250 pi par plaque est adapté pour un diamètre boîte de Pétri de 9 cm. </li></ol> 7. Croissance différée Essai d&#39;inhibition <ol><li> Pulvériser la culture à travers chacune des bouteilles de vaporisateur pour faire en sorte que la culture est chargé dans le mécanisme de pulvérisation avant la pulvérisation sur la gélose. </li><li> A partir d&#39;une distance d&#39;environ 15 cm au-dessus de la gélose, vaporiser environ 250 pi de culture diluée (3 pulvérisations d&#39;un type de 50 ml vaporisateur) sur toute la surface de la gélose. Incuber les plaques de gélose à 37 ° C en milieu aérobie pendant une nuit. Répéter pour d&#39;autres plaques avec le même nombre de pulvérisations. </li></ol> 8. Interprétation différés Résultats inhibition de la croissance Assay <ol><li> Mesurer la zone d&#39;inhibition de croissance du concur pulvérisétor souche (figure 1A - &quot;X&quot; C, à &quot;X&quot;) en millimètres, en soustrayant le diamètre de la tache centrale de l&#39;inhibiteur-producteur (Figure 1A - C, &quot;Y&quot; à &quot;Y&quot;). REMARQUE: La figure 1E montre comment ces données pourraient être présentées </li><li> Enregistrez le score de clarté pour les zones d&#39;inhibition. NOTE: Ceci indique le degré d&#39;inhibition observé. Des exemples sont montrés sur la figure 1A - D, les souches qui peuvent être utilisées pour la normalisation sont proposées dans la section des résultats représentatifs. L&#39;échelle suivante peut être utilisée pour la clarté notation: un score de clarté de 0 pour décrire une zone d&#39;inhibition complète de la croissance de la souche concurrent. Un score de 1 pour décrire une zone d&#39;inhibition presque complète de la croissance, avec des colonies uniquement individuelles présentes dans la zone de compensation. Un score de 2 pour décrire une zone visible de croissance réduite, la croissance dans cette zone est concouramment ou presque confluente mais réduit la densité de&gt; 50%. Un score de 3 à décrire que la réduction de la croissance minimale, la croissance est confluentes et réduite de moins de 50%, une zone est toujours visible et mesurable. Un score de 4 pour décrire l&#39;absence d&#39;inhibition visible de la croissance. Un score de 5 à décrire que la croissance de la souche concurrente a été augmentée à proximité de la souche d&#39;inhibiteur produisant test. Voir la figure 1 pour des exemples. Ces scores sont subjectifs à l&#39;expérimentateur. </li></ol> 9. réplicats <ol><li> Répétition des essais, au moins en triple exemplaire biologique afin de déterminer la reproductibilité des résultats obtenus. NOTE: Si les répétitions sont effectuées sur différents jours, prendre des mesures et marquer des plaques immédiatement après le retrait de l&#39;incubation, puis soit des plaques de magasin à 4 ° C ou prendre des photos de haute qualité de plaques avant de les jeter. Stockage ou photographies de plaques permet de comparer facilement les résultats entre les différents jours, tson est particulièrement important pour confirmer la notation reproductible à travers jours / expériences. Soyez conscient que le stockage des plaques a le potentiel de modifier les résultats. NOTE: Pour effacer les photos placer des plaques debout sans leur couvercle sur un fond noir mat dans une zone de lumière diffuse, utiliser un appareil photo haute résolution (≥8 MP) capable de se concentrer sur des objets proches de l&#39;objectif (mode macro). Par ailleurs, certains imageurs de gel avec trans-illuminateur fixés à la lumière blanche peut produire de haute qualité, des images hautement reproductibles. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Une étape cruciale de ce protocole de la concurrence des espèces bactériennes qui le différencie des autres, est l&#39;incubation pendant la nuit de l&#39;inhibiteur isoler avant l&#39; addition de l&#39;isolat de concurrent. La souche inhibiteur nécessite cette période de croissance pour produire des composés inhibiteurs. Comme la souche concurrent est superposé au-dessus du même milieu, cette méthode permet au chercheur d&#39;observer le plein potentiel de la souche inhibiteur d&#39;interférer avec la croissance de la souche concurrent. Par conséquent, cet essai reflète ce qui se passe avec la nature; un isolat est pleinement établie dans une niche, et l&#39;autre doit être capable de neutraliser toutes les variables inhibitrices pour être en mesure d&#39;envahir avec succès le créneau. Il y a deux parties à ce protocole qui sont les plus susceptibles d&#39;entraîner des résultats erronés si elle est effectuée de manière incorrecte. Tout d&#39;abord, la stérilisation incomplète des bouteilles de vaporisateur peut introduire des bactéries contaminantes dans le dosage. Incubation du bouillon utilisé pour rincer la bouteille de vaporisation à l&#39;étape 3.6, dans un récipient stérile peut être utilisée pour confirmer les bouteilles ont été complètement stérilisé. lavages supplémentaires dans des solutions désinfectantes, comme Virkon, peuvent être utilisés avant le lavage en surface agent de nettoyage actif, décrit à l&#39;étape 3.2, si la stérilisation supplémentaire est nécessaire. Une deuxième étape qui peut entraîner des résultats erronés est la dilution de la souche concurrent (étape 6.1). Si la dilution ne sont pas optimales, des mesures précises de l&#39;inhibition ne peuvent pas être facilement déterminées. Cet essai a été optimisée en utilisant différents isolats nasaux comme inhibiteur des souches productrices dans un large éventail d&#39;espèces Gram-positives et Gram-négatives par rapport à S. aureus SH1000 comme souche concurrent 7,8. Il a ensuite été testé à l&#39;aide de divers staphylocoques à coagulase négative et à coagulase positive en tant que concurrent et un inhibiteur des souches productrices. Lors du test de genres autres que ceux décrits ci-dessus comme le concurrentsouche, une certaine optimisation de la dilution de l&#39;inoculum peut être nécessaire. Si les scores de clarté varient considérablement entre les répétitions, il pourrait être nécessaire de normaliser la souche concurrent inoculum en la fixant à une densité optique spécifique. Cependant, cela va augmenter le temps le dosage nécessaire pour mettre en place, et est susceptible de réduire le nombre de souches, il est possible de traiter par expérience. ajuster visuellement la culture à une DO appropriée en utilisant un standard McFarland peut fournir une alternative rapide. Une limitation de cette technique est qu&#39;elle ne peut être appliquée aux bactéries cultivables. Voilà pourquoi de nombreuses études utilisent 16S séquençage ARNr pour prédire les interactions d&#39;exclusion compétitive 3,4,13. Cependant, les techniques génétiques et métagénomiques ne peuvent distinguer les membres de la communauté au niveau de l&#39;espèce, et / ou ne pas tenir compte de la variation particulière de trait intraspécifique. Il est possible de cribler pour l&#39;association d&#39;un particular gène qui code pour un trait à la présence ou l&#39; absence d&#39;une espèce bactérienne 5, mais cela nécessite une connaissance préalable d&#39;un gène susceptible d&#39;être associé à l&#39; exclusion d&#39;une espèce. Un examen de cette technique de sécurité est que, en raison de la génération d&#39;aérosol de bactéries, il ne peut être utilisé dans les laboratoires d&#39;une enceinte de sécurité de niveau 2, soit avec des précautions de sécurité similaires. Il existe des techniques alternatives pour tester la concurrence entre les isolats qui représentent intraspécifique la variation des caractéristiques et ne génèrent pas d&#39;aérosols de bactéries. Un tel procédé est l&#39;antagonisme dosage simultané 2. Dans cette méthode, un inoculum d&#39;un isolat est étalée sur une plaque de gélose, et un second inoculum d&#39;isolat est repéré ou poignardé sur le dessus une fois que le premier a séché. Cela produirait un environnement où les souches sont en concurrence directe (antagonisme simultané), à la fois en compétition pour produire des composés inhibiteurs et piéger les nutriments en premier. Le Advantage du différé test d&#39;inhibition de la croissance au cours du test de l&#39;antagonisme simultané est que l&#39;isolat d&#39;inhibiteur doit toujours avoir l&#39;avantage concurrentiel d&#39;être pleinement établie avant l&#39;invasion de l&#39;isolat de concurrent. Ceci est plus le reflet de ce qui se passerait dans l&#39;environnement, comme dans la plupart des niches, un isolat sera établi avant une autre souche est ajoutée, plutôt que deux isolats sont ajoutés en même temps 8. Une autre alternative pour éviter la production d&#39;aérosols de bactéries serait d&#39;ajouter le concurrent d&#39;isoler dans la gélose supérieure, ce qui pourrait être versé plutôt que pulvérisé sur l&#39;isolat d&#39;inhibiteur. Cependant, le volume de gélose ajoutée devrait être d&#39;environ 3 ml pour assurer une couverture uniforme de la plaque. Dans ce volume, l&#39;isolat concurrent ne serait pas de plus en plus sur les mêmes supports que l&#39;isolat d&#39;inhibiteur, donc ne souffrirait pas de nutriments réduits. Le concurrent ne serait également pas en contact direct avec des composés inhibiteurs until leur diffusion dans l&#39;agar-agar en haut. Un tel essai ne peut pas être décrit comme l&#39;inhibition différée ou simultanée antagonisme. Une méthode similaire a déjà été utilisé pour évaluer les niveaux de résistance à la bacitracine chez S. clinique aureus 10. La principale différence entre le protocole décrit ici et qui a été décrit par 10, sont les dernières souches concurrentes uniquement classées comme sensibles (compléter la clarté inhibition- marquer 0) ou résistants (partielles pas de clarté inhibition- marquer 1-5). Le test d&#39;inhibition de la croissance différée pourrait donc également être utilisé pour dépister les niveaux de résistance aux producteurs d&#39;antimicrobiens particuliers, ou même à la recherche de nouveaux antimicrobiens actifs contre les agents pathogènes multirésistantes. Il a été suggéré que la microflore de l&#39; hôte peuvent être manipulées pour éliminer les éléments indésirables de la communauté bactérienne 9. Application de corynébactéries ou Staphylococcus epidermidis ont déjà été montré pour éliminer S. aureus colonisation dans les fosses nasales , dans une proportion significative de la population 11,12. Les études portant sur des souches spécifiques qui peuvent exclure la concurrence des membres indésirables de la flore d&#39;accueil, grâce à des techniques telles que celle décrite ici, peut donc conduire à la thérapeutique à venir.

Les bactéries vivant en communautés se font concurrence au niveau interspécifique et intraspécifique pour l’espace et les nutriments 6. La compétition entre les microbes peut souvent conduire à l’exclusion d’espèces ou de souches particulières au sein d’une communauté. L’exclusion peut être due à la compétition pour un récepteur ou un nutriment particulier, ou à la production d’un composé antimicrobien par un membre de la communauté 6.
Les études portant sur l’exclusion compétitive examinent fréquemment la présence et l’absence d’espèces à l’aide du séquençage de l’ARNr 16S 3,4,13. Cependant, la variation des caractères intraspécifiques, par exemple la présence ou l’absence de production de peptides antimicrobiens, peut avoir un impact considérable sur la capacité d’une espèce à en inhiber une autre. Étant donné que le séquençage de l’ARNr 16S ne peut pas distinguer les souches d’une même espèce, la variation des traits intraspécifiques ne peut pas être évaluée. La technique décrite ici peut être utilisée pour évaluer le potentiel d’exclusion d’autres bactéries par des souches individuelles. Cette méthode a déjà été utilisée pour montrer une corrélation positive entre la présence de bactéries inhibitrices de Staphylococcus aureus et l’absence de S. aureus dans une communauté nasale 7.
L’essai d’inhibition différée de la croissance (compétition) permet d’identifier la production de composés antimicrobiens ou la compétition nutritionnelle par la souche inhibitrice. Il peut également détecter des interactions positives, par lesquelles la présence de la souche inhibitrice améliore en fait la croissance de la souche concurrente. Ce test peut être utilisé pour créer des données quantitatives (taille de la zone de clairière) et qualitatives (degré d’inhibition), qui peuvent toutes deux être superposées aux données de la présence ou de l’absence d’une espèce au sein d’une communauté afin de trouver des corrélations entre le phénotype (caractère) et l’exclusion compétitive 7.

<table><tbody><tr><td>Cerveau cœur infusion bouillon</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>riche milieu à usage général</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur de parfum en plastique</td><td></td> <td>inconnu-10 cm de haut avec 3,5 cm de diamètre flacon pulvérisateur en plastique transparent avec couvercle, acheté au rayon voyage d’un supermarché</td><td></td></tr><tr><td>Flacons</td><td></td><td>universels qui ne sont plus en production, SLS alternatifs BOT5006</td><td>flacon cylindrique en verre de 28 ml (~280 mm de diamètre, 850 mm de hauteur), à fond plat avec bouchon à vis en plastique</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&nbsp ;</td><td></td><td>agent de nettoyage tensioactif&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

croissance différée essai d&#39;inhibition pour quantifier l&#39;effet des bactéries dérivées antimicrobiens sur la concurrence

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

L’exclusion compétitive peut se produire dans les communautés microbiennes lorsque, par exemple, une souche productrice d’inhibiteurs surpasse son concurrent pour un nutriment essentiel ou produit des composés antimicrobiens auxquels son concurrent n’est pas résistant. Nous décrivons ici un test d’inhibition différée de la croissance, une méthode permettant d’évaluer la capacité d’une bactérie à inhiber la croissance d’une autre par la production de composés antimicrobiens ou par la compétition pour les nutriments. Cette technique a été utilisée pour étudier la corrélation entre les isolats nasaux et l’exclusion d’espèces particulières d’une communauté. Cette technique peut également être utilisée pour dépister les producteurs d’antibiotiques ou les antimicrobiens potentiellement nouveaux. L’essai est effectué en cultivant d’abord la souche productrice d’inhibiteurs d’essai pendant la nuit sur une plaque de gélose, puis en pulvérisant sur la souche concurrente d’essai et en l’incubant à nouveau. Après l’incubation, l’étendue de l’inhibition peut être mesurée quantitativement, par la taille de la zone d’éclaircie autour de la souche productrice d’inhibiteurs, et qualitativement, en évaluant la clarté de la zone d’inhibition. Nous présentons ici le protocole pour le test d’inhibition différée, décrivons les moyens de minimiser les variations entre les expériences et définissons une échelle de clarté qui peut être utilisée pour évaluer qualitativement le degré d’inhibition.

Les résultats d&#39;analyse devraient être observables comme une différence dans la souche superposée concurrent à proximité du centre tacheté inhibiteur souche productrice (Figure 1). Ces différences peuvent être interprétées comme une inhibition complète (figure 1A), une inhibition partielle (Figure 1B et 1C), aucune inhibition (figure 1D) ou une association positive. Le laboratoire largement disponible souches S. epidermidis Tü3298 et S. epidermidis Rp62A, et S. epidermidis Rp62A et S. aureus Newman ont été utilisés dans les figures 1B et 1D , respectivement. Nous suggérons que ces souches pourraient être utilisées pour tester ce protocole. Selon les espèces testées, l&#39;inhibition complète et l&#39;inhibition partielle sont probablement le résultat de peptides antimicrobiens, des antibiotiques ou d&#39;autres inhibito de croissance diffusiblers produits par la souche de l&#39;inhibiteur de la production. L&#39; inhibition partielle a également été liée à une réduction de la disponibilité des nutriments pour la souche concurrente en raison de l&#39; absorption ou séquestrant des nutriments par la souche inhibiteur 6. Comparaison de la taille de la zone d&#39;inhibition entre les différents isolats d&#39;inhibiteur produisant testés par rapport à la même souche de concurrent indique des différences dans l&#39;un des éléments suivants: la quantité d&#39;agent antimicrobien produit par la souche productrice d&#39;inhibiteur; la capacité de l&#39;inhibiteur à se diffuser à travers les médias; le type d&#39;inhibiteur produit et le niveau de la souche concurrente aux inhibiteurs de résistance étant produite. Comparaison de la taille de la zone d&#39;inhibition entre les différentes souches testées contre des concurrents de la même souche productrice d&#39;inhibiteur est une indication du niveau des souches concurrent de l&#39;inhibiteur étant produit de la résistance. <p class="jove_content" fo:keep-together.w-page = SEIN &quot;1&quot;&gt; Les résultats varient en fonction de la souche inhibitrice utilisée et la souche utilisée concurrent. Répétitions en utilisant la même souche inhibitrice et concurrent devraient idéalement avoir le même score de clarté (décrite dans la section 8.2), ce qui indique une bonne technique a été utilisée tout au long. Si une application incohérente des bactéries a eu lieu les plaques ne doivent pas être utilisés. Par exemple, si la culture de compétiteur d&#39;essai est trop diluer la zone d&#39;inhibition apparaît plus grande et avec un bord moins clairement défini que ce qui est généralement observé (figure 2A); cela affecterait la fiabilité des mesures de la zone de comparaison. Si la tache de souche inhibiteur produisant n&#39;a pas été complètement séché avant une nuit d&#39; incubation, la souche inhibiteur est susceptible de se propager et non former une tache bien définie (figure 2B), qui affecte généralement les mesures de la zone , mais peut également affecter la notation de clarté. Si la souche de concurrentpas pulvérisé uniformément cela peut conduire à une répartition inégale des bactéries (figure 2C). Si la souche concurrent est trop concentré , il est possible que la souche concurrent peut se développer au - dessus de la souche d&#39;inhibiteur (figure 2C), dans les cas extrêmes , cela peut conduire à une certaine inversion des rôles de contrainte concurrent / inhibiteur. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> Figure 1:. La gamme des résultats qualitatifs et quantitatifs qui peuvent être obtenus à partir du test d&#39;inhibition de la croissance différée Résultats pour l&#39;inhibition de la croissance peut varier de (A) une inhibition complète (score de 0), (B) inhibition partielle (score de 1) , (C) l&#39; inhibition partielle (score de 2) à (D) aucune inhibition (score de 4). Les étiquettes indiquent les bords de croissance des souches d&#39;inhibiteur (Y) et le bord extérieur de l&#39;inhibitiondes zones (X). La taille de la zone d&#39;intervalle d&#39;inhibition de 0 mm à plus de 10 mm, comme illustré dans (E), qui montre les mesures pour les plaques photographiées en A, B, C et D. Les résultats sont présentés pour les souches de staphylocoques récentes (A , C) ou staphylococcique de laboratoire commun isolats S. epidermidis Tü3298 (inhibiteur) et S. epidermidis Rp62A (concurrent) (B), et S. epidermidis Rp62A (inhibiteur) et S. aureus Newman (concurrent) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> Figure 2: Exemples de résultats incohérents dus à une mauvaise technique Les résultats peuvent apparaître différemment que prévu si (A. </strong&gt;) souche concurrent a été trop diluée, (B) souche inhibiteur n&#39;a pas été complètement sec avant incubation / plaques n&#39;étaient pas sec ou (C) si la souche de concurrent n&#39;a pas été pulvérisé de manière uniforme et est trop concentré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

L’essai d’inhibition différée de la croissance peut être utilisé pour évaluer l’effet de compétition d’un isolat bactérien sur un autre. L’inhibition est quantifiée en mesurant la zone d’élimination autour de l’isolat producteur d’inhibiteurs, ou évaluée qualitativement en déterminant l’étendue visible de l’inhibition.

Croissance différée Essai d&#39;inhibition pour quantifier l&#39;effet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

L'objectif général de ce protocole est d'examiner la compétition exercée par un isolat bactérien sur un autre de manière à la fois quantitative et qualitative. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'étude de l'exclusion compétitive au sein des communautés bactériennes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle reflète ce qui se produit dans une communauté bactérienne.Les isolats envahisseurs doivent être capables de survivre aux effets inhibiteurs des isolats établis pour que l'envahissement soit couronné de succès. La procédure sera démontrée par Emma Crank, étudiante diplômée en biologie hospitalière. Pour commencer, préparez de l'agar bouillon cerveau-cœur, ou BHI, selon les instructions du fabricant.Stériliser l'agar en autoclave à 121 degrés Celsius et 15 psi pendant 20 minutes. Verser des aliquotes de 15 millilitres d'agar BHI stérilisé dans des boîtes de Pétri stériles, et laisser l'agar durcir. Préparer le bouillon BHI selon les instructions du fabricant, puis transférer des aliquotes de 10 millilitres dans des flacons universels en verre de 28 millilitres.Ensuite, stériliser le bouillon BHI à l'autoclave pendant 20 minutes. Pour préparer les flacons du vaporisateur, commencez par démonter les flacons. Pulvériser un agent nettoyant tensioactif à 5 % à travers le vaporisateur afin d'éliminer les contaminants internes.Ensuite, faire tremper le flacon du vaporisateur, le couvercle et le vaporisateur dans l'agent de nettoyage toute la nuit. Le jour suivant, sécher le vaporisateur, le couvercle et les flacons sous une hotte à flux d'air stérile. Puis utiliser de l'éthanol à 70 % pour remplir les flacons.Ensuite, réattachez le vaporisateur et vaporisez une partie de l'éthanol à travers celui-ci. Placez le couvercle sur le vaporisateur et rangez-le avec de l'éthanol à l'intérieur jusqu'à son utilisation. Avant utilisation, rincez aseptiquement le flacon avec du bouillon BHI stérile, puis vaporisez le bouillon à travers le vaporisateur.Pour préparer des cultures bactériennes de nuit, étaler les souches compétitrice et inhibitrice sur une plaque d'agar BHI stérile, puis incuber à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant environ 18 heures. Dans un flacon universel de 28 millilitres, ensemencer 10 millilitres de bouillon BHI stérile avec une colonie unique de la souche bactérienne compétitrice requise. Incuber la culture dans un agitateur orbital universel à 37 degrés Celsius et 250 tr/min pendant la nuit.Le lendemain, s'assurer que les boîtes de gélose sont parfaitement sèches et ne présentent aucune condensation sur le couvercle, afin d'éviter que l'inoculum ne se répande sur la boîte. Prélever 25 microlitres de la culture de nuit au centre des boîtes de gélose à l'aide d'une pipette, en évitant d'enfoncer complètement le piston de la pipette afin de prévenir la formation de bulles d'air qui pourraient projeter la culture sur la surface de la gélose. Laisser sécher la culture à température ambiante pour limiter sa propagation.Ensuite, incuber les boîtes de gélose à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant la nuit. Après avoir cultivé une culture de nuit, et en travaillant sous une hotte de sécurité de niveau deux tapissée de papier absorbant, utiliser du bouillon BHI pour diluer la culture d’un facteur dix afin d’obtenir environ quatre fois dix à la puissance six UFC par millilitre. Ensuite, verser la culture diluée dans une bouteille stérile de vaporisateur en plastique pour parfum.Pour réaliser un test de microdiffusion en phase vapeur, pulvériser la culture à travers chacun des flacons du vaporisateur afin de s'assurer que la culture est chargée dans le mécanisme de pulvérisation avant de l'appliquer sur l'agar. À une distance d'environ 15 centimètres au-dessus de l'agar, pulvériser environ 250 microlitres de culture diluée sur toute la surface de l'agar. Incuber les boîtes à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant la nuit.Pour interpréter l'inhibition de croissance différée, mesurez la zone d'inhibition de croissance de la souche compétitrice pulvérisée en millimètres, en soustrayant le diamètre du point central de la souche productrice d'inhibiteur. Enfin, enregistrez le score de clarté des zones d'inhibition conformément au protocole décrit dans le texte. Comme illustré sur cette figure, les résultats du test doivent être observables sous la forme d'une différence dans la souche compétitrice recouvrant la souche productrice d'inhibiteur située au centre.Les différences peuvent être une inhibition complète, une inhibition partielle, une absence d'inhibition ou une association positive. Ce graphique compare les zones d'inhibition entre les isolats producteurs d'inhibiteurs, ce qui peut résulter de la quantité d'agent antimicrobien produit, de la capacité de l'inhibiteur à diffuser à travers le milieu, du type d'inhibiteur produit ou du niveau de résistance de la souche concurrente aux inhibiteurs. Cet exemple montre que si la culture du concurrent testé est trop diluée, la zone d'inhibition apparaîtra plus grande et avec un bord moins net que ce qui est habituellement observé.Si la souche productrice d'inhibiteur n'a pas été complètement séchée avant l'incubation nocturne, la souche inhibitrice s'étendra et ne formera pas un point parfaitement défini. En outre, si la souche compétitrice n'est pas pulvérisée uniformément, cela peut entraîner une répartition inégale des bactéries. Enfin, si la souche compétitrice est trop concentrée, elle peut croître au-dessus de la souche inhibitrice et, dans des cas extrêmes, provoquer une inversion des rôles entre la souche compétitrice et la souche inhibitrice.Une fois maîtrisée, cette technique prendra une heure répartie sur quatre jours par paire d'isolats testée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de pulvériser de manière uniforme avec une bonne réplication entre les tests. Après cette procédure, les données d'inhibition peuvent être superposées aux données taxonomiques concernant la présence ou l'absence d'une espèce bactérienne dans une communauté.Il est alors possible de déterminer si des effets inhibiteurs influencent la capacité d'une espèce à coloniser un environnement. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs spécialisés dans le domaine des microbiotes communautaires d'explorer les effets de la variance des caractéristiques, comme la prédiction de peptides antimicrobiens, sur la structure des communautés en lien avec l'exclusion compétitive. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de comparer la capacité d'un isolat bactérien à inhiber de façon compétitive la croissance d'un autre, tant de manière qualitative que quantitative.N'oubliez pas que le travail avec des bactéries aérosolisées peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que de travailler dans une hotte de sécurité de niveau deux et de porter des EPI appropriés doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Source : Speare, L., et al. Essai de coïncubation pour quantifier les interactions compétitives entre les isolats de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test de co-incubation utilisé pour étudier comment les souches bactériennes se font concurrence dans un environnement partagé. Il est largement utilisé en microbiologie pour identifier les mécanismes, tels que la destruction dépendante ou indépendante du contact, qui sont à l’origine de ces interactions.

Essai de coincubation pour l’étude des interactions compétitives entre souches bactériennes

Cette vidéo présente une méthode basée sur la microscopie à fluorescence pour étudier la compétition bactérienne au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet de mieux comprendre la structure et la fonction des communautés bactériennes.

Essai de co-incubation bactérienne : une technique basée sur la microscopie à fluorescence pour visualiser la compétition bactérienne intraspécifique au niveau de la cellule unique

Cette vidéo présente le test d’inhibition différée de la croissance, utilisé pour étudier comment les composés antimicrobiens produits par un type de bactérie affectent une autre souche bactérienne concurrente.

Un essai d’inhibition différée de la croissance pour évaluer l’effet des composés antimicrobiens dérivés de bactéries

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