Croissance différée Essai d'inhibition pour quantifier l'effet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence

L'objectif général de ce protocole est d'examiner la compétition exercée par un isolat bactérien sur un autre de manière à la fois quantitative et qualitative. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'étude de l'exclusion compétitive au sein des communautés bactériennes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle reflète ce qui se produit dans une communauté bactérienne.

Les isolats envahisseurs doivent être capables de survivre aux effets inhibiteurs des isolats établis pour que l'envahissement soit couronné de succès. La procédure sera démontrée par Emma Crank, étudiante diplômée en biologie hospitalière. Pour commencer, préparez de l'agar bouillon cerveau-cœur, ou BHI, selon les instructions du fabricant.

Stériliser l'agar en autoclave à 121 degrés Celsius et 15 psi pendant 20 minutes. Verser des aliquotes de 15 millilitres d'agar BHI stérilisé dans des boîtes de Pétri stériles, et laisser l'agar durcir. Préparer le bouillon BHI selon les instructions du fabricant, puis transférer des aliquotes de 10 millilitres dans des flacons universels en verre de 28 millilitres.

Ensuite, stériliser le bouillon BHI à l'autoclave pendant 20 minutes. Pour préparer les flacons du vaporisateur, commencez par démonter les flacons. Pulvériser un agent nettoyant tensioactif à 5 % à travers le vaporisateur afin d'éliminer les contaminants internes.

Ensuite, faire tremper le flacon du vaporisateur, le couvercle et le vaporisateur dans l'agent de nettoyage toute la nuit. Le jour suivant, sécher le vaporisateur, le couvercle et les flacons sous une hotte à flux d'air stérile. Puis utiliser de l'éthanol à 70 % pour remplir les flacons.

Ensuite, réattachez le vaporisateur et vaporisez une partie de l'éthanol à travers celui-ci. Placez le couvercle sur le vaporisateur et rangez-le avec de l'éthanol à l'intérieur jusqu'à son utilisation. Avant utilisation, rincez aseptiquement le flacon avec du bouillon BHI stérile, puis vaporisez le bouillon à travers le vaporisateur.

Pour préparer des cultures bactériennes de nuit, étaler les souches compétitrice et inhibitrice sur une plaque d'agar BHI stérile, puis incuber à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant environ 18 heures. Dans un flacon universel de 28 millilitres, ensemencer 10 millilitres de bouillon BHI stérile avec une colonie unique de la souche bactérienne compétitrice requise. Incuber la culture dans un agitateur orbital universel à 37 degrés Celsius et 250 tr/min pendant la nuit.

Le lendemain, s'assurer que les boîtes de gélose sont parfaitement sèches et ne présentent aucune condensation sur le couvercle, afin d'éviter que l'inoculum ne se répande sur la boîte. Prélever 25 microlitres de la culture de nuit au centre des boîtes de gélose à l'aide d'une pipette, en évitant d'enfoncer complètement le piston de la pipette afin de prévenir la formation de bulles d'air qui pourraient projeter la culture sur la surface de la gélose. Laisser sécher la culture à température ambiante pour limiter sa propagation.

Ensuite, incuber les boîtes de gélose à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant la nuit. Après avoir cultivé une culture de nuit, et en travaillant sous une hotte de sécurité de niveau deux tapissée de papier absorbant, utiliser du bouillon BHI pour diluer la culture d’un facteur dix afin d’obtenir environ quatre fois dix à la puissance six UFC par millilitre. Ensuite, verser la culture diluée dans une bouteille stérile de vaporisateur en plastique pour parfum.

Pour réaliser un test de microdiffusion en phase vapeur, pulvériser la culture à travers chacun des flacons du vaporisateur afin de s'assurer que la culture est chargée dans le mécanisme de pulvérisation avant de l'appliquer sur l'agar. À une distance d'environ 15 centimètres au-dessus de l'agar, pulvériser environ 250 microlitres de culture diluée sur toute la surface de l'agar. Incuber les boîtes à 37 degrés Celsius de manière aérobie pendant la nuit.

Pour interpréter l'inhibition de croissance différée, mesurez la zone d'inhibition de croissance de la souche compétitrice pulvérisée en millimètres, en soustrayant le diamètre du point central de la souche productrice d'inhibiteur. Enfin, enregistrez le score de clarté des zones d'inhibition conformément au protocole décrit dans le texte. Comme illustré sur cette figure, les résultats du test doivent être observables sous la forme d'une différence dans la souche compétitrice recouvrant la souche productrice d'inhibiteur située au centre.

Les différences peuvent être une inhibition complète, une inhibition partielle, une absence d'inhibition ou une association positive. Ce graphique compare les zones d'inhibition entre les isolats producteurs d'inhibiteurs, ce qui peut résulter de la quantité d'agent antimicrobien produit, de la capacité de l'inhibiteur à diffuser à travers le milieu, du type d'inhibiteur produit ou du niveau de résistance de la souche concurrente aux inhibiteurs. Cet exemple montre que si la culture du concurrent testé est trop diluée, la zone d'inhibition apparaîtra plus grande et avec un bord moins net que ce qui est habituellement observé.

Si la souche productrice d'inhibiteur n'a pas été complètement séchée avant l'incubation nocturne, la souche inhibitrice s'étendra et ne formera pas un point parfaitement défini. En outre, si la souche compétitrice n'est pas pulvérisée uniformément, cela peut entraîner une répartition inégale des bactéries. Enfin, si la souche compétitrice est trop concentrée, elle peut croître au-dessus de la souche inhibitrice et, dans des cas extrêmes, provoquer une inversion des rôles entre la souche compétitrice et la souche inhibitrice.

Une fois maîtrisée, cette technique prendra une heure répartie sur quatre jours par paire d'isolats testée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de pulvériser de manière uniforme avec une bonne réplication entre les tests. Après cette procédure, les données d'inhibition peuvent être superposées aux données taxonomiques concernant la présence ou l'absence d'une espèce bactérienne dans une communauté.

Il est alors possible de déterminer si des effets inhibiteurs influencent la capacité d'une espèce à coloniser un environnement. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs spécialisés dans le domaine des microbiotes communautaires d'explorer les effets de la variance des caractéristiques, comme la prédiction de peptides antimicrobiens, sur la structure des communautés en lien avec l'exclusion compétitive. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de comparer la capacité d'un isolat bactérien à inhiber de façon compétitive la croissance d'un autre, tant de manière qualitative que quantitative.

N'oubliez pas que le travail avec des bactéries aérosolisées peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que de travailler dans une hotte de sécurité de niveau deux et de porter des EPI appropriés doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.