Name: Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après ladministration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez la vaccination BCG intranasale versus sous-cutanée chez la souris pour étudier les réponses immunitaires pulmonaires contre la tuberculose. Cette méthode révèle le rôle crucial de l'IL17 dans la protection vaccinale.

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Ce travail a été soutenu par le « Ministère espagnol de l’Économie et de la Compétitivité » [numéro de subvention BIO2014-5258P], la « Commission européenne » par les programmes H2020 [numéros de subvention TBVAC2020 643381].

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions contrôlées et respectées pour tout signe de maladie. Le travail expérimental a été menée en accord avec les directives européennes et nationales en matière de protection des animaux de laboratoire et avec l&#39;approbation des commissions compétentes d&#39;éthique locaux. 1. Préparation des stocks quantifiées glycériques de BCG danoise et Mycobacterium tuberculosis H37Rv NOTE: Tous les protocoles décrits ont été réalisées dans des conditions de BSL3. <ol><li> Décongeler les stocks de glycerol congelé de BCG danoise ou souches H37Rv et ensemencer 100 ul dans 10 ml de milieu 7H9 10 supplémenté avec du Tween-80 0,05% (v / v) et l&#39; ADC (Albumine, dextrose, catalase) 10% (v / v). </li><li> Incuber dans des conditions statiques pendant une semaine à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la culture est en croissance en phase logarithmique. </li><li> Plus grande échelle de la culture bactérienne en transférant la culture de 10 ml à 200 ml de milieu frais. Incuber 20 supplémentairesjours dans des conditions statiques. </li><li> Transfert à tubes de centrifugation de 50 ml et centrifuger pendant 15 min à 2500 x g. </li><li> Jeter surnageants et resuspendre culot bactérien dans le volume résiduel. Ajouter à chaque tube de perles de verre de 3 mm de diamètre stériles (10 - 15) par tube. </li><li> Vortex vigoureusement pendant 1 min afin de dissocier des amas bactériens. Remettre en suspension chaque culot dans 10 ml de PBS avec du Tween-80 0,05% (v / v). </li><li> Laisser les tubes pendant 10 minutes permettant aux plus grands agrégats bactériens et perles de verre à installer. </li><li> Récupérer 9,5 ml de surnageant provenant de chacun des 4 tubes contenant de petites touffes et les bactéries individuelles et les volumes de transfert à un seul tube de centrifugeuse de 50 ml frais (volume final récupéré 38 ml). Centrifuger pendant 10 min à 400 x g. </li><li> Récupérer 35 ml de surnageant (contenant les bactéries principalement simples) dans un seul tube centrifuge de 50 ml frais et ajouter 15 ml de PBS avec du glycerol à 50% (v / v), pour obtenir une concentration de glycérol finale de 15% (v / v). </li><li> Mélanger doucementet distribuer dans des aliquotes de 1 ml dans des tubes appropriés pour la congélation. Conserver à -80 ° C (un lot fournit environ 50 aliquotes stock de glycérol). </li><li> Pour quantifier les stocks de glycérol, décongeler un glycérol jour après congélation et effectuer sept dilutions en série de dix fois dans des tubes de 1,5 ml séparés contenant 900 pi de PBS. </li><li> Plaque 100 ul de chaque dilution dans le milieu 7H10 agar solide complété avec 10 CAN 10% (v / v) préparé dans des plats de diamètre 55 mm de Petri. </li><li> Soigneusement ajouter 3 billes de verre mm de diamètre (env. 10 par plaque) et agiter la plaque pour répartir équitablement le volume sur plaque de gélose doucement. Jeter des perles et sceller la plaque de gélose avec du parafilm. </li><li> Incuber pendant 21 jours à 37 ° C et déterminer la concentration bactérienne en comptant les unités formant des colonies (UFC) dans les dilutions où des colonies individuelles peuvent être distinguées avec précision. </li></ol> 2. Souris Vaccination <ol><li> Décongeler un glycérol BCG pré-quantifiées et le diluer dans du PBS pour prepDeux suspensions. Calculer le volume final étant donné la dose par animal est de 100 ul pour une administration sous - cutanée (10 7 CFU par ml pour une vaccination sous - cutanée) et 40 ul pour une administration intranasale (2,5 x 10 7 UFC pour la vaccination intra - nasale). </li><li> Utilisez une station d&#39;anesthésie spécialisée pour les rongeurs pour anesthésier les souris avec un mélange d&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène. Utiliser l&#39;isoflurane 5% pour induire une anesthésie et 2% pour maintenir la souris dans la chambre d&#39;anesthésie. (Autre méthode d&#39;anesthésie acceptée peut être utilisé). </li><li> Pour une administration sous - cutanée d&#39; un vaccin remplir une seringue de 1 ml avec une aiguille 26 G avec 1 ml de suspension bactérienne (10 7 UFC / ml). Retirer les bulles d&#39;air. </li><li> Placer une souris anesthésiée sur une surface plane en position couchée à l&#39; intérieur d&#39; une hotte à flux laminaire et inoculer en sous - cutané 100 pi (10 6 UFC / dose) du vaccin dans un flanc de la souris arrière. Retour de la souris à la cage et de le surveiller pour qu&#39;il Properly récupère de l&#39;anesthésie. </li><li> Changez l&#39;aiguille de la seringue entre chaque administration de la souris. Enlevé les bulles d&#39;air comme décrit ci-dessus. </li><li> Pour l&#39;administration intranasale, placer une souris anesthésiée en position couchée à l&#39;intérieur de la hotte. </li><li> Avec une micropipette prendre 20 pi de la suspension avec 2,5 x 10 7 UFC / ml. Placez le goutte-à-goutte inoculum entre les deux narines jusqu&#39;à ce que le volume total a été déposé, laissant le temps entre les gouttes pour permettre la souris respirer le volume. Remarque: les souris peuvent souffrir de détresse respiratoire au cours de cette procédure, ils devraient être laissés à assimiler chaque goutte avant d&#39;administrer la suivante afin d&#39;éviter autant que possible. </li><li> Re-remplir le micropipette avec un autre 20 pl et répéter l&#39;opération. Si la souris commence à se réveiller de l&#39;anesthésie après la première inoculation, le placer dans la chambre d&#39;anesthésie avant la seconde. Retour de la souris à la cage et veiller à ce qu&#39;il récupère correctementde l&#39;anesthésie. </li></ol> 3. Souris intranasale Challenge H37Rv Strain <ol><li> Décongeler un glycérol H37Rv pré-quantifiées et le diluer dans du PBS pour préparer une suspension bactérienne de 2 500 UFC par ml. Calculer volume final compte tenu de la dose par animal est de 40 pi. </li><li> H37Rv est inoculé par voie intranasale, comme décrit dans 02/05 à 02/07. Dose d&#39;épreuve finale par souris est de 10 2 UFC / 40 pi. </li></ol> 4. Analyse de la réponse immunitaire induite en Poumons <ol><li> Suspension cellulaire pulmonaire NOTE: L&#39;évaluation de la réponse immune adaptative induite par le vaccin dans les poumons nécessite la génération d&#39;une suspension cellulaire unique. A cet effet, on utilise un dissociateur tissulaire tel que gentleMACS. <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale (ou autre méthode humaine acceptée) et de veiller à la souris est morte de toucher le globe oculaire pour confirmer l&#39;absence de réflexe de clignement. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, extraire le lUNGS avec des ciseaux et des pinces stériles et les placer sur une surface propre. poumons propres enlèvement de la trachée et du tissu conjonctif, et de transférer les poumons à un tube de 1,5 ml avec du PBS (conserver sur de la glace jusqu&#39;à ce que la transformation). </li><li> Pour produire une suspension cellulaire, placer les poumons dans un tube approprié pour la dissociation de l&#39; organe (tube C-dissociateur) contenant 5 ml de 10 mM de HEPES-NaOH à pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2 et 1,8 mM de CaCl2 tampon. </li><li> Ajouter 100 ul de la collagénase D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentration finale) et 40 ul de DNase I 20000 UI / ml (160 UI / ml de concentration finale. REMARQUE: Des solutions mères de la collagénase D ou DNasel sont préparés dissolvaient des enzymes lyophilisées dans du PBS ou du glycérol à 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 , MgCl 2 y 1 mM. </li><li> Placer le tube dans le dissociateur tissulaire et en utilisant la m_lung_01 prédéfinie du programme pour la fragmentation du poumon. Incuber le tube à 37 ° C dans un bain-marie pendant 30 min. </li><li> La place etube e dans le dissociateur et utiliser le m_lung_02 programme prédéfini pour l&#39;homogénéisation pulmonaire complète en suspension cellulaire unique. </li><li> Passer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm monté sur un tube de centrifugeuse de 50 ml. Laver le filtre avec 10 ml de milieu RPMI 1640. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 400 xg et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de lyse des érythrocytes, mélanger au vortex et incuber pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de RPMI 1640 cellules moyennes et centrifuger pendant 5 minutes à 400 x g. </li><li> Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de milieu RPMI 1640 additionné de 10% inactivé par la chaleur sérum de veau fœtal (FCS), 2 mM de L-glutamine, 100 pg / ml de streptomycine, 100 IU / ml de pénicilline et 50 pM de 2-mercaptoéthanol. REMARQUE: FCS est inactivée par incubation à 56 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Compter les cellules et ajouter RPMI complète 1640 pour atteindre la densité cellulaire finale de 10 7 cellules / ml. NOTE: Pour le nombre de cellules, nous utilisons le compteur de cellules automatisé. </li><li> Distribuer 100 ul de suspension cellulaire en fond U plaque de 96 puits stérile (10 6 cellules / puits). </li><li> Ajouter 50 pl / puits de milieu complet RPMI 1640 avec 15 pg / ml de H37Rv commerciale protéine purifiée dérivée (PPD) (5 ug / ml concentration finale). </li></ol></li><li> La collecte surnageante pour la détermination des cytokines par ELISA <ol><li> Incuber la plaque à partir 01/04/14 pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> plaque Centrifugeuse pendant 5 minutes à 400 g et de récupérer 100 pi de surnageant. </li><li> Conserver à -80 ° C. </li><li> Diluer le surnageant 1/10 et 1/2 dans du tampon d&#39;essai pour la détermination de l&#39;IFN-y et IL17A, respectivement. Déterminer les concentrations de cytokines avec des kits ELISA commerciaux, selon les instructions du fabricant (kits de développement ELISA). </li></ol></li><li> Coloration intracellulaire pour la détermination des cytokinesproductrices de cellules CD4 + par cytométrie de flux <ol><li> Incuber la plaque à partir 01/04/14 pendant 18 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 1,5 pl de Brefeldin A 1 mg / ml (stocks dissous dans du DMSO) à chaque (concentration finale de 10 pg / ml) puits et incuber pendant six heures supplémentaires. </li><li> Centrifuger la plaque de 4.3.2 pendant 1 min à 3200 xg et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 50 ul d&#39;anticorps anti-CD4 de souris-FITC dilué dans un milieu RPMI 1640 avec 10% de FCS (1/500) et incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger la plaque de 4.3.4 pendant 1 min à 3.200 xg, éliminer le surnageant et ajouter 100 pl / puits de solution de fixation. Incuber à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 150 pl / lavage de la solution de perméabilisation. NOTE: 10x concentré mère est diluée dans de l&#39;eau déminéralisée pour préparer une solution de travail 1x. </li><li> Resuspendre les cellules dans 50 ul d&#39;anticorps anti-IFNy de souris et d&#39;APC anti-souris-IL17A APC.Cy7 dilués dans permeabilsolution sation (1/250 les deux anticorps). </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 150 pl / lavage de la solution de perméabilisation. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 pi de PBS pour l&#39;acquisition de la cytométrie de flux. </li></ol></li></ol> 5. Analyse des immunoglobulines dans lavage broncho-alvéolaire (BAL) <ol><li> Obtention d&#39;échantillons de BAL <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale (ou autre méthode humaine acceptée) et de veiller à la souris est morte de toucher le globe oculaire pour confirmer l&#39;absence de réflexe de clignement. </li><li> Exposer la trachée en utilisant la précision appropriée des pinces et des ciseaux stériles et effectuer une petite incision dans la trachée, en veillant à ne pas exciser complètement. Prenez soin de ne pas causer des saignements qui pourraient contaminer les échantillons BAL. </li><li> Introduire dans la trachée d&#39;une canule raccordée à une seringue de 1 ml stérile avec 800 pi de PBS glacé. </li><li> Ensemencer lentement le PBS dans les poumons puis recover volume de BAL tirant le piston de la seringue très lentement afin d&#39;éviter l&#39;effondrement du poumon. NOTE: La récupération de 500 à 600 pi est satisfaisante. </li><li> Transférer le volume BAL dans un tube de 1,5 ml et confirmer BAL reste incolore, ce qui indique que ne sont pas contaminés par du sang (maintenir sur la glace jusqu&#39;à la transformation). </li><li> Centrifugeuse échantillons BAL pendant 5 min à 400 g, et le transfert surnageant dans un nouveau tube. </li><li> surnageants Conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Détermination d&#39;IgA dans le BAL surnageants NOTE: Tous les réactifs utilisés sont à la température ambiante. <ol><li> Polystyrène de liaison à haute teneur en protéines de Coat-fond plat des plaques à 96 puits avec 100 pl de PPD dilué dans du PBS (10 pg / ml) pour M. la tuberculose spécifique de la détermination des IgA ou avec 100 ul de surnageant BAL est dilué 10 fois dans du PBS pour une détermination totale IgA. </li><li> Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Rejeter le surnageant et appuyez sur la plaque sur une serviette en papier à dry. Laver avec 200 pl / puits de PBS. </li><li> Poulie à 200 pl / puits d&#39;un sérum-albumine bovine (BSA) à 1% (p / v) dans du PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampon de blocage). </li><li> Incuber 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver une fois avec 200 pl / puits de PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampon de lavage). </li><li> Ajouter 100 pi de surnageant non dilué BAL dans les puits PPD revêtus. Incuber deux heures à température ambiante. NOTE: Si la détermination totale IgA se fait en parallèle avec le PPD spécifique IgA, laissez le total des puits IgA avec un tampon de lavage de 100 pi pendant cette incubation. </li><li> Laver trois fois avec 200 pl / puits de lavage buffer.0170004 </li><li> Ajouter 100 pi de peroxydase de raifort (HRP) conjugué avec l&#39;anti-IgA de souris dilué dans du tampon de blocage (1 / 10.000). </li><li> Incuber 1 h RT. </li><li> Laver à cinq reprises avec 200 pl / puits de tampon de lavage. </li><li> Ajouter 100 pl / puits de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB). Incuber 20 min à température ambiante en til sombre. </li><li> Ajouter 100 pl / puits de H 2 SO 4 0.5N. Lire la plaque dans un spectrophotomètre à une longueur d&#39;onde de 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. détermination de la charge bactérienne dans les poumons <ol><li> Homogénéisation du poumon et le plaquage <ol><li> Quatre semaines après la provocation, sacrifier la souris par dislocation cervicale (ou autre méthode humaine acceptée) et de veiller à la souris est morte de toucher le globe oculaire pour confirmer l&#39;absence de réflexe de clignement. </li><li> Placer la souris en position couchée fixée sur une surface plane et désinfecté à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire. </li><li> Faire une incision et enlever la peau de la région de la poitrine pour laisser visible la région thoracique. </li><li> Découpez les côtes et récolter les poumons et le cœur à l&#39;aide de ciseaux et des pinces stériles. Placez les organes sur une surface propre. </li><li> Nettoyer les poumons en enlevant le cœur, de la trachée et du tissu conjonctif et de transférer les poumons à un tube de 1,5 ml avec 1 ml d&#39;eau déminéralisée(Maintenir sur la glace jusqu&#39;à ce que le traitement). </li><li> Utiliser des pinces stériles pour transférer les poumons de chaque souris dans un tube approprié pour l&#39;homogénéisation d&#39;un organe (M - Tube dissociateur) contenant 1 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Placer le tube dans le dissociateur tissulaire et en utilisant la RNA_1 prédéfinie du programme afin d&#39;homogénéiser les poumons. </li><li> Faire cinq dilutions en série de dix fois dans des tubes de 1,5 ml, à partir de 100 pi d&#39;homogénat pulmonaire dilué dans 900 ul. </li><li> dilutions de plaque comme décrit au 1.11 à 1.14. </li></ol></li><li> La différenciation entre le BCG et H37Rv par PCR REMARQUE: Dans les plaques d&#39;immatriculation 6.1.6 correspondant au groupe vacciné avec le BCG par voie intra-nasale, nous avons analysé un nombre représentatif de colonies par PCR en discernant entre le BCG et H37Rv pour garantir que le UFC examiné pour évaluer l&#39;efficacité de protection vaccinale conférée correspondait unique pour H37Rv. Cette PCR cibles amplification de RD9, une région génomique différent dans le BCG et M. tutuberculosis, donnant un fragment de 2618 pb pour H37Rv, et 465 pb pour le BCG 11. <ol><li> Préparer un mélange maître stock pour tous les échantillons avec des volumes par échantillon comme indiqué, puis les distribuer dans des tubes de PCR (9 pi / échantillon). NOTE: Buffer 5x: 2 pl. Amorces Forward 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 ul, amorce inverse 25 uM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 ul, Taq polymérase 5 unités / ul: 0,04 ul, désionisée H 2 O: 6,32 ul. </li><li> Touchez une colonie avec un cure-dent stérile et immerger le cure-dent avec l&#39;échantillon dans un tube PCR contenant le mélange maître. </li><li> Exécutez la PCR avec le programme suivant: 10 min 95 ° C (cette étape est de déclencher une perturbation bactérienne), 10 min 95 ° C (cette étape est de déclencher une perturbation bactérienne), 35 cycles (30 secondes à 95 ° C, 1 min à 58 ° C et 4 min à 72 ° C). </li><li> Charger les échantillons de PCR dans un gel d&#39;agarose à 1% avec des échantillons de bromure d&#39;éthidium pour visualiser et exécuter les fragments. </li&gt; </ol></li></ol>

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<li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que le vaccin actuel contre la tuberculose, le BCG, soit le vaccin le plus largement administré de l’histoire, la tuberculose reste l’une des principales causes de décès et de morbidité dues aux maladies infectieuses dans le monde. Ce paradoxe s’explique par l’absence de protection de ce vaccin contre la tuberculose pulmonaire, forme de transmission responsable. De nouvelles approches vaccinales efficaces contre les formes pulmonaires de la maladie sont nécessaires de toute urgence, car elles auraient le plus grand ...

La tuberculose (TB) est l&#39; une des principales maladies infectieuses causant plus de décès associés que le VIH dans le monde et combiné avec la hausse augmentation des souches multirésistantes rend TB un problème de santé mondiale alarmante 1. De nouveaux outils diagnostiques, des médicaments plus efficaces et moins toxiques, et de nouveaux vaccins sûrs et efficaces TB sont un besoin urgent, en particulier dans le monde en développement. Vivant atténué Bacille Calmette-Guérin (BCG) est actuellement le seul vaccin homologué contre la tuberculose, qui a été administré par voie intradermique à la naissance depuis les années 1970 dans le monde entier. BCG est considéré comme efficace pour prévenir les formes graves de la maladie ( la méningite et la tuberculose miliaire) chez les enfants, mais a montré une efficacité incompatible contre la tuberculose pulmonaire responsable de la transmission de la maladie 2. vaccination pulmonaire, qui imite voie naturelle de l&#39;infection tuberculeuse, représente une approche intéressante pour amorcer la réponse immunitaire de l&#39;hôte locals. À cet égard, divers travaux précliniques dans différents modèles TB animaux pertinents ont démontré une plus grande efficacité du vaccin après l&#39; immunisation pulmonaire par rapport à la voie sous - cutanée ou intradermique 3-6. Néanmoins, les mécanismes de protection déclenchée par la vaccination pulmonaire ne sont pas bien comprises. Au cours des dernières années, plusieurs travaux ont pointé vers une réponse de IL17 médiée comme un facteur important de la muqueuse réponse immunitaire spécifique de la tuberculose, comme dans les modèles de souris déficientes pour IL17 muqueuse efficacité protectrice induite par le vaccin est altérée 7,8. Récemment , nous avons démontré pour la première fois que l&#39; administration intranasale BCG protégé DBA / 2 souris, une souche de souris caractérisé par l&#39;absence de protection après la vaccination par le BCG sous - cutanée 9. Ces résultats suggèrent que la vaccination contre la tuberculose respiratoire pourrait être plus efficace dans la réduction des taux de tuberculose dans les pays d&#39;endémie, où le BCG intradermique est considéré comme inefficace contre pulmonTB ary.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 bouillon</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3 mm de diamètre Perles de verre</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Dissociateur GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tubes C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Tubes M</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro ; m Filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplément</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentré</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentré</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Biologique Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Compteur de cellules automatisé portable</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Capteurs de compteur de cellules, 40 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Souris IFN-&gamma ; Kit de développement ELISA&nbsp ;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL17A Kit de développement ELISA&nbsp ;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Souris CD4</td><td>BD 553047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-souris IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Souris Anti-souris IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 23G x 1 1/4"</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Utilisé comme canule de trachée pour les</td></tr><tr><td>plaques de polystyrène à 96 puits à haute teneur en protéines à haute teneur en protéines BAL, MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumine, à partir de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>IgA anti-souris de chèvre (spécifique à la chaîne alpha)&minus ; Anticorps anti-peroxydase</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime ;,5,5&prime ;-Tétraméthylbenzidine (TMB)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq ADN polymérase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>Le kit comprend un tampon 5x</td></tr></tbody></table>

efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale bcg chez la souris

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Malgré la couverture mondiale de la vaccination intradermique par BCG, la tuberculose reste l’une des maladies infectieuses les plus répandues dans le monde. Les données précliniques ont encouragé les vaccins contre la tuberculose pulmonaire comme une stratégie prometteuse pour prévenir les maladies pulmonaires, qui sont responsables de la transmission. Dans ce travail, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer dans le modèle murin les avantages de la vaccination intranasale par BCG par rapport à la vaccination sous-cutanée. Nos données ont révélé une plus grande efficacité protectrice après l’administration intranasale de BCG. De plus, nos résultats indiquent que la vaccination pulmonaire déclenche une réponse immunitaire plus élevée dans les poumons, y compris les réponses Th1 et Th17, ainsi qu’une augmentation de la concentration d’immunoglobulines A (IgA) dans les voies respiratoires. Nos données montrent une corrélation entre l’efficacité protectrice et la présence de cellules productrices d’IL17 dans les poumons après la provocation de Mycobacterium tuberculosis, suggérant un rôle de cette cytokine dans la réponse protectrice conférée par la vaccination pulmonaire. Enfin, nous détaillons le flux de travail global que nous avons développé pour étudier la vaccination respiratoire dans le modèle murin, qui pourrait être extrapolé à d’autres vaccins contre la tuberculose, en dehors du BCG, ciblant la réponse muqueuse ou d’autres voies d’administration pulmonaires telles que l’intratrachéale ou l’aérosol.

Ce travail décrit la comparaison de deux voies d&#39;administration du BCG: sous-cutanée et intranasale. voie sous-cutanée est comparable à celui intradermique, qui est la voie d&#39;administration clinique actuel du BCG dans le monde entier. Intranasale voie de vaccination vise à imiter la voie naturelle de l&#39; infection de M. la tuberculose, dont l&#39;objectif est d&#39;induire une réponse immunitaire directement dans les poumons, le principal organe cible de ce p...

Nous détaillons ici la méthodologie suivie pour comparer l’efficacité protectrice et la réponse immunitaire pulmonaire induites par l’immunisation intranasale et sous-cutanée avec le BCG dans un modèle murin. Nos résultats montrent les avantages de la vaccination pulmonaire et suggèrent un rôle de la réponse médiée par l’IL17 dans la protection induite par le vaccin.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les réponses immunitaires dans les poumons après une immunisation contre la tuberculose, notamment l'efficacité protectrice du vaccin face à un défi intranasal et la réponse immunitaire pulmonaire induite localement par le vaccin. Cette méthodologie peut aider à répondre à nos questions clés dans le domaine du vaccin contre la tuberculose, notamment à l'identification des réponses immunitaires pulmonaires défensives déclenchées par les vaccins pulmonaires afin d'assurer une protection immunitaire optimale des poumons. Un avantage de cette méthodologie est que la réponse immunitaire pulmonaire de chaque animal est évaluée individuellement, parallèlement à l'efficacité protectrice.ce qui permet l'identification des paramètres immunitaires spécifiques corrélés à la protection. Pour l'administration sous-cutanée du vaccin BCG, remplir d'abord une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 26 avec un millilitre de suspension du vaccin BCG, puis éliminer les bulles d'air. Ensuite, placer une souris anesthésiée en position ventrale à l'intérieur d'une hotte de flux laminaire et inoculer l'animal par voie sous-cutanée avec 100 microlitres de bactéries dans une anse postérieure.Pour l'administration intranasale, charger une micropipette avec 20 microlitres de la suspension de BCG et placer la souris anesthésiée en position dorsale à l'intérieur de la hotte. Administrer l'inoculum goutte à goutte entre les deux narines jusqu'à ce que tout le volume de 20 microlitres soit déposé, en laissant un intervalle entre chaque goutte pour permettre à la souris d'inspirer la suspension. Ensuite, recharger la micropipette avec 20 microlitres supplémentaires de bactéries et répéter l'administration.Pour le défi intranasal avec la souche de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, au moment expérimental approprié après la vaccination, inoculer les animaux par administration intranasale de 40 microlitres de la suspension bactérienne H37Rv, comme vient d'être démontré. Pour obtenir le lavage broncho-alvéolaire ou l'échantillon BAL, utiliser d'abord des pinces et des ciseaux stériles afin d'exposer la trachée. Ensuite, pratiquer une petite incision dans la trachée en prenant soin de ne pas exciser complètement le tissu, puis insérer une canule reliée à une seringue stérile de 1 mL contenant 800 microlitres de PBS glacé.Lorsque la canule est en place, remplir soigneusement les poumons avec le PBS, puis tirer lentement sur le piston pour récupérer au moins 500 à 600 microlitres de liquide de lavage. Déposer le prélèvement dans un tube de 1,5 mL placé sur de la glace, et vérifier que la suspension est incolore, ce qui indique l'absence de contamination sanguine. Conserver les échantillons sur de la glace jusqu'au traitement du prélèvement.Pour déterminer la charge bactérienne et la réponse immunitaire dans les poumons, fixez la souris avec des épingles en position dorsale sur une surface plane et désinfectée à l'intérieur de la hotte de flux laminaire, puis pratiquez une incision dans la peau supérieure au niveau du thorax. Ensuite, retirez délicatement la peau pour exposer la région thoracique et ouvrez les poumons. À l’aide de ciseaux et de pinces stériles, prélèvez les poumons et le cœur, puis placez les organes sur une surface propre.Ensuite, retirer le cœur, la trachée et le tissu conjonctif. Placer chaque poumon dans un tube différent de 1,5 mL contenant 1 mL d'eau déionisée sur de la glace pour la détermination ultérieure de la charge bactérienne et des réponses immunitaires cellulaires. Par rapport à la voie sous-cutanée, la voie intranasale de vaccination confère une efficacité protectrice beaucoup plus élevée dans les poumons.L'analyse d'un nombre représentatif de colonies provenant du groupe vacciné par voie intranasale avec le BCG, par PCR spécifique de la région génomique RD9, démontre que toutes les colonies produisent un fragment de 0,4 kilo-paires de bases correspondant à H37Rv. Le BCG administré par voie intranasale induit une production plus élevée d'IL-17 et d'interféron gamma dans les poumons, révélant une corrélation entre l'efficacité protectrice conférée par la vaccination intranasale au BCG et la réponse immunitaire induite par le vaccin dans les poumons avant le défi, ainsi qu'une concentration plus élevée à la fois du taux total et de l'anticorps IgA spécifique au dérivé purifié des protéines H37Rv dans les échantillons de lavage observée chez les sujets vaccinés par voie intranasale. Une analyse complémentaire des cellules productrices de cytokines dans les poumons après le défi tuberculeux a révélé que, bien que des cellules productrices d'interféron gamma aient été détectées dans tous les groupes infectés, des cellules CD4+ productrices d'IL-17A n'ont été observées que dans le groupe vacciné par voie intranasale, démontrant ainsi une corrélation significative entre la présence d'IL-17 et la réduction de la charge bactérienne pulmonaire.À la suite de cette procédure, il est possible de comparer les réponses immunitaires pulmonaires locales lors de l'utilisation de vaccins antituberculeux biodivers, ainsi que différentes voies d'administration et différents points temporels après le défi. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour évaluer l'immunité induite par la vaccination après le défi, ce qui pourrait permettre l'identification des réponses immunitaires corrélées à la protection.Il est important de noter que le travail avec Mycobacterium tuberculosis nécessite des installations de laboratoire exemptes de BCL, et les précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour tester l’efficacité d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche contre l’infection à Bordetella pertussis chez la souris. Après la vaccination, les souris ont été soumises à une infection et leur homogénat de tissu a été cultivé pour analyser les colonies bactériennes afin de déterminer l’immunité protectrice induite par le vaccin.

Évaluation de l’immunité induite par le vaccin contre l’infection bactérienne dans un modèle murin

Cette vidéo démontre l’immunisation intranasale par BCG chez la souris, activant à la fois les réponses immunitaires innées et adaptatives, conduisant au développement de lymphocytes T mémoires résidents des poumons et de lymphocytes B effecteurs, améliorant ainsi la protection contre les infections à Mycobacterium.

Immunisation intranasale par le BCG dans un modèle murin

La vaccination prophylactique et thérapeutique échoue souvent pour stimuler une forte réponse immunitaire due à la semaine drainage du vaccin vers les ganglions lymphatiques et par conséquent faible implication des cellules immunitaires. Par injection directe de vaccin vers les ganglions lymphatiques, dite injection intralymphatique, l'efficacité du vaccin peut être fortement améliorée, et les doses de vaccin peut être réduite.

Intralymphatique Immunothérapie et vaccination chez la souris

Le présent travail illustre la commodité de l’utilisation de l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et conférer une protection contre la pneumonie pneumococcique aiguë chez la souris.

L&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

L'interféron γ cultivées dosage immuno-enzymatique à long terme est utilisée comme mesure de réponses de la mémoire centrale et est en corrélation avec les réponses des vaccins anti-mycobactériens protection. Avec cet essai, des cellules mononucléaires du sang périphérique sont stimulés avec des antigènes mycobactériens et l'interleukine-2 pendant 14 jours, permettant la différenciation et l'expansion de lymphocytes T mémoire centrale.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Le développement du test ELISpot interféron-gamma pour cobaye PBMC permet la caractérisation des lymphocytes T dans ce modèle très pertinent pour l’étude des maladies infectieuses. Nous avons appliqué le test permettant de mesurer les lymphocytes T associés intradermique de vaccins à ADN.

Test ELISpot interféron-gamma optimisé à mesure les réponses des cellules T dans le modèle cobaye après Vaccination

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Découvrez la vaccination BCG intranasale versus sous-cutanée chez la souris pour étudier les réponses immunitaires pulmonaires contre la tuberculose. Cette méthode révèle le rôle crucial de l'IL17 dans la protection vaccinale.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après ladministration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l'administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

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