Mesure quantitative des niveaux relatifs à l'acide rétinoïque E8.5 Embryons et Neurosphère Cultures Utilisation du F9 RARE-Lacz base de cellules Reporter Assay

L'objectif général de cette procédure est de mesurer de manière quantitative les niveaux relatifs d'acide rétinoïque dans des préparations tissulaires, telles que des embryons de souris E8.5 ou des cultures de neurosphères adultes, à l'aide d'un test rapporteur cellulaire. Bien que la voie de signalisation de l'acide rétinoïque soit bien caractérisée, la mesure histologique directe de l'acide rétinoïque est techniquement irréalisable. Ce test peut aider à répondre à des questions clés sur la manière dont des mutations génétiques peuvent affecter les niveaux d'acide rétinoïque.

Le principal avantage de cette technique est sa grande sensibilité et sa polyvalence, lui permettant de mesurer une large gamme de concentrations d'acide rétinoïque (RA) dans divers échantillons de tissus. Bien que cette méthode puisse fournir des informations directes sur la détermination des niveaux de RA dans différents échantillons de tissus, elle peut également être appliquée à d'autres études, telles que la détection de la présence ou de l'absence d'enzymes métabolisant le RA en surveillant les variations de ses concentrations. Avant de commencer toute expérience, tester la réponse des cellules F9 RARE-LacZ au RA. Ajouter un nanomolaire d'acide rétinoïque tout-trans aux cellules F9 RARE-LacZ cultivées dans une plaque de 96 puits.

Ensuite, incuber la plaque et cultiver à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, réaliser une coloration au LacZ et examiner les cellules à la recherche d'un précipité bleu. Si la couleur n'est pas uniforme dans l'ensemble des cellules, passer au sous-clonage des cellules.

Séparer les cultures sélectionnées dans des boîtes de 10 centimètres à raison de 100 000 cellules par 10 millilitres. Après deux jours de culture, préparer une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de gélatine à 0,2 % par puits, et laisser la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirer la gélatine et rincer les puits deux fois avec 500 microlitres d’eau distillée.

À présent, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture cellulaire F9 RARE-LacZ dans les puits. Ensuite, prélèvez des colonies de cellules F9 à l’aide d’une pointe de pipette stérile P10 et transférez chacune dans un puit. Après trois ou quatre jours de culture, divisez les colonies en deux plaques de 24 puits revêtues de gélatine, une pour les tests et l’autre pour l’expansion.

Après encore deux jours de culture, ajouter un nanomolaire de RA dans chaque puits d'une plaque de 24 puits et cultiver pendant la nuit. Le jour suivant, réaliser une coloration au LacZ pour tester les répondeurs élevés et amplifier la culture correspondante. Un jour avant la récolte des embryons E8,5 ou la dissociation des neurosphères, recouvrir une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de gélatine à 0,2 % par puits, puis laisser la plaque reposer pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le gélatine et rincez les puits deux fois avec 200 microlitres d'eau distillée. Puis, trypsinez les cellules F9 RARE-LacZ sélectionnées maintenues dans des boîtes de 10 centimètres. Ensuite, semez 100 000 cellules dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en utilisant un milieu de culture sans G418.

Chargez suffisamment de puits pour co-cultiver chaque embryon, ou préparez trois puits par génotype si vous travaillez avec des neurosphères. Préparez également 24 puits pour la courbe standard. Incubez ensuite la plaque pendant 24 heures.

Pour la co-culture de cellules embryonnaires, commencez par la dissection d'embryons E8,5. Ensuite, ajoutez dans un nouveau tube de 1,5 millilitre 10 microlitres de trypsine, puis, à l’aide d’une pipette P20 munie d’une pointe à orifice élargi, transférez l’embryon entier dans le tube et placez le tube sur de la glace. Une fois tous les embryons isolés, incubez tous les tubes à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de dissocier les tissus.

Après cinq minutes, triturez délicatement le contenu de chaque tube à l’aide d’une pipette P20, puis transférez 10 microlitres dans un puits de la plaque 96 puits préparée contenant les cellules F9 RARE-LacZ. Incubez la plaque toute la nuit. Pour les co-cultures de neurosphères, commencez par transférer une culture de neurosphères dans des tubes de 15 millilitres.

Faites centrifuger les tubes à 200 g pendant 10 minutes, puis retirez tout le surnageant sauf un millilitre. Ensuite, triturez le contenu à l’aide d’une pipette P1000. Maintenant, utilisez un petit volume pour déterminer la densité des cellules dissociées.

Ensuite, ensemencez 100 000 cellules de neurosphères dissociées au-dessus des cellules F9 RARE-LacZ. Chargez trois puits avec chaque type de culture de neurosphères. Préparez maintenant les puits pour la courbe standard.

En triple exemplaire, ajouter 100 microlitres de solutions de RA tout-trans préparées par dilution sériée à sept concentrations différentes dans le milieu de culture F9 RARE-LacZ. Inclure des contrôles négatifs de cellules non traitées. Enfin, cultiver la plaque 96 puits complètement chargée pendant la nuit.

Le lendemain, retirez le milieu et fixez les cultures en utilisant 100 microlitres de glutaraldéhyde à 2,5 % par puits. Incubez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, retirez le fixateur et lavez les puits deux fois avec 200 microlitres de PBS pendant 10 minutes par lavage.

Ensuite, lavez les puits trois fois avec 200 microlitres de solution de lavage LacZ pendant 10 minutes par lavage. Pendant le troisième lavage, préparez la solution de coloration X-gal dans un tube de 15 millilitres enveloppé dans du papier d’aluminium. Préparez également une chambre humidifiée pour la plaque de 96 puits.

Ajoutez maintenant 200 microlitres de la solution de coloration X-gal dans chaque puits. Placez la plaque dans la chambre humidifiée et incubez à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, retirez la solution de coloration LacZ et remplacez-la par 200 microlitres de PBS.

Ensuite, mesurez l'absorbance à 610 nanomètres et imagez la plaque. La lignée cellulaire rapporteur F9 RARE-LacZ est composée de cellules de carcinome embryonnaire adhérentes qui répondent de manière quantitative à l'acide rétinoïque par une induction proportionnelle de la bêta-galactosidase. Elles présentent également une morphologie épithéliale.

Bien que cultivées en présence de sélection par la G418, la réponse de ces cellules à l'acide rétinoïque s'affaiblit après plusieurs passages. Ainsi, un sous-clonage périodique est nécessaire pour garantir une réponse forte et uniforme à l'acide rétinoïque. On s'attend à ce que les embryons E8,5 homozygotes pour la mutation vl dans Gpr161 présentent une signalisation embryonnaire de l'acide rétinoïque diminuée. À l'aide de cet essai de co-culture décrit, utilisant des embryons dissociés et des cellules F9 RARE-LacZ, cette hypothèse a été confirmée.

La co-culture de neurosphères issues d'adultes de type sauvage avec des cellules F9 RARE-LacZ a également été utilisée pour tester la présence d'acide rétinoïque (RA) dans les cultures de neurosphères. La coloration accrue, par rapport aux cellules au stade E8,5, pourrait être due à l'homogénéité des cultures de neurosphères. En établissant une courbe standard pour les concentrations d'acide rétinoïque, le taux de RA a pu être quantifié dans les cultures de neurosphères de type sauvage ainsi que dans les embryons au stade E8,5.

Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à maintenir, par des sous-clonages périodiques, des cellules F9 RARE-LacZ qui répondent fortement à l'acide rétinoïque (RA). Assurez-vous également de bien dissocier votre échantillon afin de faciliter une distribution homogène et une mesure cohérente du RA. Après cette procédure, les effets de mutations génétiques sur les niveaux de RA peuvent être étudiés, et d'autres méthodes peuvent ensuite être réalisées pour déterminer quelles composantes de la voie de signalisation du RA sont directement affectées.