Name: Micromodelage et lAssemblée des microvaisseaux 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Découvrez la méthode de moulage par injection pour fabriquer des microvaisseaux 3D reproduisant les propriétés physiologiques de l'endothélium. Cette technique permet d'étudier la biologie vasculaire et les mécanismes des maladies vasculaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Lynn et Mike Garvey Laboratoire d&#39;imagerie à l&#39;Institut des cellules souches et médecine régénérative ainsi que la facilité de Washington nanofabrication à l&#39;Université de Washington. Ils reconnaissent également le soutien financier de l&#39;Institut national de la santé accorde DP2DK102258 (à YZ), et la formation accorde T32EB001650 (à SSK et MAR) et T32HL007312 (MAR).

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Microvaisseaux modifiés sont un modèle in vitro , où les caractéristiques physiologiques telles que la géométrie luminale, les forces hydrodynamiques et les interactions multicellulaires sont présents et accordable. Ce type de plate - forme est puissante en ce qu&#39;elle offre la possibilité de modéliser et d&#39; étudier le comportement de l&#39; endothélium dans une variété de contextes où les conditions de culture in vitro dans peut être adaptée à celle du microenvironnement en question. Par exempl...

La microvascularisation dans chaque organe contribue à définir le microenvironnement des tissus, maintenir l&#39; homéostasie tissulaire et régulent l&#39; inflammation, la perméabilité, la thrombose, et de la fibrinolyse 1,2. Endothelium microvasculaire, en particulier, est l&#39;interface entre le débit sanguin et le tissu environnant et donc joue un rôle essentiel dans la modulation de la fonction vasculaire et de l&#39; organe en réponse à des stimuli tels que les forces hydrodynamiques et les cytokines et les hormones circulantes 3 ​​- 5. La compréhension des interactions entre les détails de l&#39;endothélium, le sang et le tissu environnant microenvironnement est importante pour l&#39;étude de la biologie vasculaire et la progression de la maladie. Cependant, les progrès dans l&#39; étude de ces interactions a été entravée par limitées dans les outils in vitro qui ne récapitulent pas dans la structure microvasculaire vivo et fonctionnent 6,7. En conséquence, le champ et le progrès thérapeutique a beaucoup compté sur coûteuse et longueconsommant des modèles animaux qui ne parviennent pas souvent à traduire le succès chez les humains 8 - 10. Alors que les modèles in vivo sont précieux dans l&#39;étude des mécanismes de la maladie et les fonctions vasculaires, elles sont complexes et manquent de contrôle précis de l&#39; individu cellulaire, biochimique, et les indices biophysiques souvent. Vascularisation dans tout le corps possède une structure hiérarchique d&#39; âge mûr en conjonction avec des lits capillaires expansives, fournissant perfusion optimisée et le transport des nutriments simultanément 11. Dans un premier temps , les formes de vascularisation comme un plexus primitif qui réorganise à un réseau hiérarchisé ramifié au début du développement 12,13. Bien que plusieurs des signaux impliqués dans ces processus sont bien compris 14 - 16, il reste insaisissable comment une telle structuration vasculaire est déterminé 15. À son tour, récapitulant ce processus in vitro pour concevoir des réseaux vasculaires organisés a been. De nombreuses plates - formes existantes difficiles in vitro pour modéliser le système vasculaire, par exemple deux cultures de cellules endothéliales dimensions, manquent des caractéristiques importantes telles que la proximité multicellulaire, la géométrie en trois dimensions luminale, le débit et la matrice extracellulaire. Tube essais de formation en hydrogels 3D (collagène ou fibrine) 17 - 19 ou invasion des dosages 20,21 ont été utilisés pour étudier la fonction endothéliale en 3D et leurs interactions avec d&#39; autres vasculaires 17,22 ou de cellules de tissu types 23. Cependant, assemblés lumens dans ces tests manquent interconnectivité, flux hémodynamique, et la perfusion appropriée. En outre, la tendance à la régression vasculaire dans ces tubes 24 empêche la formation des essais de culture à long terme et la maturation qui limite le degré d&#39;études fonctionnelles qui peuvent être exécutées. Par conséquent, il est nécessaire de concevoir des plates - formes bourgeonnante in vitro des réseaux microvasculaires capable de modéliser de façon appropriée enendothéliales caractéristiques et sont capables de la culture à long terme. Une variété de techniques d&#39;ingénierie vasculaires ont émergé au fil des ans pour des applications médicales pour remplacer ou bypass touchés vaisseaux chez les patients atteints de maladies vasculaires. Les navires de grand diamètre fabriqués à partir de matériaux synthétiques tels que le polyéthylène téréphtalate (PET), et le polytétrafluoroéthylène (ePTFE) ont eu un succès thérapeutique considérable avec une longue perméabilité à long terme (moyenne 95% patence plus de 5 ans) 25. Bien que les greffes synthétiques de petit diamètre (&lt;6 mm) généralement face à des complications telles que l&#39; hyperplasie intimale et thrombopoïèse 26 - 28, ingénierie tissulaire greffes de petit diamètre réalisés avec du matériel biologique ont fait des progrès significatifs 29,30. Malgré les progrès de ce genre, les navires d&#39;ingénierie sur le micrométrique sont restés un défi. Pour modéliser correctement le système microvasculaire, il est nécessaire de générer des configurations de réseau complexes avec sufficient résistance mécanique pour maintenir la perméabilité et avec une composition de matrice qui permet la perméation des nutriments pour les cellules parenchymateuses et le remodelage cellulaire. Ce protocole présente une nouvelle artificielle réseau de vaisseaux perfusable qui imite un natif in vivo de réglage avec un paramètre ajustable et contrôlable microenvironnement 31-34. La méthode décrite génère microvaisseaux conçu avec des diamètres de l&#39;ordre de 100 um. microvaisseaux d&#39;ingénierie sont fabriqués par perfuser les cellules endothéliales à travers un canal microfluidique qui est incorporé dans le type doux collagène hydrogel. Ce système a la capacité de générer des réseaux modelées avec une structure luminale ouverte, reproduire les interactions multicellulaires, moduler la composition de la matrice extracellulaire, et appliquer des forces hémodynamiques physiologiquement pertinents.

<table><tbody><tr><td>Wafer Fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoGlow Plasma System</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc&nbsp ;</td><td>PWM32 Spin Coater&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ABM Aligneur de contact</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step Profilomètre</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Développeur</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8" plaquette de silicium</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Générateur de micro-motifs de table</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&mu ; PG 101</td><td>Pour la génération de photomasque</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Alcool ispropylique</td><td>Avantor Performance Matériaux</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (120 x 120 mm, carrées)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Base élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissement</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Mixte à 10:1 (p/p)</td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Four</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>Device Fabrication and Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly(methyl methacrylate) (PMMA)</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corona Treater</td><td>Produits Electro-Technic, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Appareil portable pour le traitement au plasma des dispositifs PMMA et des moules PDMS</td></tr><tr><td>Fer à souder</td><td>Weller&nbsp ;</td><td>WTCPS</td><td></td></tr><tr><td>Vis mécanique fendue à tête de treillis en acier inoxydable</td><td>McMaster-Carr&nbsp ;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Goupilles en acier inoxydable</td><td>McMaster-Carr&nbsp ;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler&nbsp ;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Toute pince à épiler similaire peut être utilisée</td></tr><tr><td>Spatule (Micro Cuillère)</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Tournevis</td><td></td><td></td><td>N’importe quel tournevis à tête plate peut être utilisé, autoclavé</td></tr><tr><td>Lamelles en verre (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri (150 x 25 mm)</td>Boîtes de Pétri <td>430599</td><td></td> <td>Corning</td></tr><tr><td>(100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Coton, coupé en morceaux</td><td></td><td></td> de 1 cm x 3 cm <td>Polyéthylène autoclavé</td></tr><tr><td>(PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Diluer à 1 % dans de l’eau de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Diluer à 0,1 % dans de l’eau</td></tr> <tr><td>de culture cellulaireCollagène stérile H2O</td><td></td><td></td><td>Autoclavé DI H2O</td></tr><tr><td>de type I, dissous dans de l’acide</td><td></td><td></td> acétique à 0,1 % <td>Isolé à partir de queues de rat comme décrit dans Rajan et. al. 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 30 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (stérile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Diluer à 1 N dans de l’eau de qualité culture cellulaire</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance endothéliale</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dextran de Leuconostoc spp. (70&nbsp ; kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Hémocytomètre Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de chargement de gel</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G Aiguille de remplissage émoussé</td><td>BD&nbsp ;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de distribution en acier inoxydable de 20 g</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32" ID, 3/32 » OD Tube en silicone</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16 » Raccord tube-à-tube</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&deg ; Connecteurs coudés, tube à tube</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Accouplement Luer Lock (femelle, 1/16" ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Pince en plastique, avec mâchoires Services de</td><td>microscopie électronique</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue double</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tube à fond rond en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Device Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>dilution</td></tr> <tr><td>de travail 1:25FITC conjugué anti-von Willebrand Factor anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin de chèvre 568</td><td>secondaire Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Remis en suspension dans du</td></tr><tr><td>cacodylate de sodium DMSO&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Pour fabriquer un tampon cacodylate de 0,2 M</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa Dextran conjugué au FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td><Réactifs de culture supplémentaires>forts&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Inhibiteur de GSK-3 à petite molécule</td></tr><tr><td>Recombinant humain VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humain bFGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

micromodelage et l&#39;assemblée des microvaisseaux 3d

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels 

Dans les plates - formes in vitro pour étudier les cellules endothéliales et la biologie vasculaire sont largement limitées à 2D culture de cellules endothéliales, l&#39; écoulement des chambres avec un polymère ou des substrats de verre à base, et des essais de formation de tube à base d&#39; hydrogel. Ces essais, tandis que d&#39;information, ne récapitulent la géométrie lumière, matrice extracellulaire appropriée, et la proximité multi-cellulaire, qui jouent un rôle clé dans la modulation de la fonction vasculaire. Ce manuscrit décrit un procédé de moulage par injection pour produire des navires d&#39;ingénierie avec des diamètres de l&#39;ordre de 100 um. Microvaisseaux sont fabriqués par ensemencement des cellules endothéliales dans un canal microfluidique intégré dans un type natif du collagène hydrogel. En incorporant des cellules parenchymales dans la matrice de collagène avant la formation de canal, des micro-environnements spécifiques de tissus peuvent être modélisés et étudiés. modulations supplémentaires de propriétés et les médias hydrodynamique composition permettent un contrôle de la fonction vasculaire complexe dans le microenvironnement désiré.Cette plate-forme permet l&#39;étude du recrutement de cellules périvasculaires, des interactions de sang endothélium, la réponse de l&#39;écoulement, et les interactions avec les tissus microvasculaire. microvaisseaux Engineered offrent la possibilité d&#39;isoler l&#39;influence des composants individuels d&#39;une niche vasculaire et de contrôler précisément ses produits chimiques, et des propriétés biologiques mécaniques pour étudier la biologie vasculaire à la fois la santé et de la maladie.

La plate - forme de vaisseau d&#39; ingénierie crée microvascularisation fonctionnelle intégrée dans un type de collagène naturel I matrice et permet un contrôle serré de l&#39;environnement cellulaire, biophysique et biochimique in vitro. Pour fabriquer microvaisseaux d&#39;ingénierie, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) sont perfusés par l&#39;intermédiaire du réseau microfluidique de collagène embarqué où ils se fixent pour former une lumière de ...

Ce manuscrit présente un procédé de moulage par injection pour concevoir des microvaisseaux qui récapitulent les propriétés physiologiques de l&#39;endothélium. Le procédé à base microfluidique crée des réseaux vasculaires 3D de brevet avec conditions, adaptable telles que le débit, la composition cellulaire, la géométrie, et les gradients biochimiques. Le procédé de fabrication et des exemples d&#39;applications possibles sont décrites.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

L'objectif général de l'utilisation de microvaisseaux conçus est de reproduire la structure et la fonction des vaisseaux dans l'organisme afin d'étudier la physiologie vasculaire dans des états normaux et pathologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire, telles que la manière dont différentes cellules anathèmes réagissent au flux, comment elles influencent la fonction tissulaire, et comment les maladies vasculaires s'initient et évoluent au fil du temps. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être facilement modifiée pour imiter différents systèmes organiques et différents états pathologiques.Cela peut être réalisé en modifiant les types cellulaires, la matrice et la composition du milieu, ainsi que d'autres variables. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés avant de prendre conscience des erreurs fréquentes pouvant entraîner une mauvaise qualité des vaisseaux. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car plusieurs astuces sont nécessaires pour une fabrication réussie lors des étapes de moulage par injection et d'assemblage.Pour cette procédure, préparez à l’avance les moules en PDMS plats et microstructurés ainsi que les pièces de logement en PMMA. Une description de la fabrication de ces pièces est fournie dans le protocole écrit. Stérilisez les moules en PDMS au autoclave, ainsi que les vis, les broches, la pince et une spatule.Ne pas stériliser les pièces de PMMA à l'autoclave. Elles doivent être stérilisées à l'eau de Javel sous une hotte. Après avoir laissé les pièces de PMMA tremper dans l'eau de Javel pendant au moins une heure, rincer l'eau de Javel avec de l'eau stérilisée à l'autoclave deux fois.Ensuite, placez les pièces dans des boîtes stériles. Aspirez l'excès d'eau et laissez-les sécher à l'air. Une fois tout nettoyé, commencez le protocole en traitant les puits internes des deux pièces PMMA, supérieure et inférieure, à l'aide d'un appareil à plasma portatif pendant environ une minute.Éteignez la lumière pour faciliter la visualisation de la couverture du traitement au plasma. Ensuite, ajoutez du PEI à 1 % dans les puits intérieurs. Si le PEI ne s'étend pas facilement, augmentez la durée du traitement au plasma.Après avoir laissé réagir le PEI pendant 10 minutes, éliminer la solution, rincer les dispositifs avec de l'eau stérile et les laisser sécher à l'air. Une fois secs, appliquer du glutaraldéhyde à 0,1 % sur les surfaces traitées et laisser réagir pendant une demi-heure. Ensuite, rincer les pièces deux fois avec de l'eau stérile et les laisser sécher à l'air.Préparez maintenant du collagène neutre frais à 0,75 % pour la fabrication des vaisseaux en combinant le volume de collagène stocké préalablement dosé avec la solution de neutralisation composée de milieu et d'hydroxyde de sodium. Mélangez lentement et soigneusement à l’aide d’une spatule jusqu’à ce que la solution soit homogène et prenne une couleur orange. Ensuite, si nécessaire, ajoutez les cellules à la concentration souhaitée et continuez à mélanger la solution jusqu’à une répartition uniforme des cellules.En prévision du processus d'assemblage, placez le moule en PDMS micropaterné dans une boîte de 100 par 20 millimètres et traitez le moule au plasma pendant une minute. Ensuite, alignez la pièce supérieure en PMMA sur le PDMS de manière à ce que les réservoirs carrés s'alignent avec les réservoirs d'entrée et de sortie. Puis, insérez des broches en acier inoxydable dans les orifices des réservoirs d'entrée et de sortie afin qu'ils restent ouverts après l'injection de collagène.Chargez maintenant le mélange de collagène et de cellules dans une seringue d'un millilitre sans introduire de bulles d'air. Ensuite, à l'aide de pinces, appuyez doucement sur la pièce supérieure en PMMA pour la fixer au moule en PDMS et injectez lentement environ un demi-millilitre de mélange de collagène et de cellules dans le port d'injection. Le collagène doit remplir la zone de 20 par 20 millimètres au-dessus du motif, sans fuir.Ensuite, fermez soigneusement la boîte sans secouer les broches d'alignement. Puis, placez un coverslip carré de 22 millimètres carrés en verre dans la cavité intérieure de la pièce inférieure en PMMA. Ensuite, déposez environ 0,25 millilitre de collagène uniformément sur le verre.Complétez la moitié inférieure en abaissant délicatement le PDMS plat dans le collagène afin qu’il soit bien à plat contre le PMMA, sans bulles d’air entre les deux. Placez ensuite soigneusement les deux moitiés du dispositif dans une étuve à 37 degrés Celsius et laissez la solution de collagène gélatiner pendant 30 minutes avant de poursuivre. Après la gélification, ajoutez suffisamment de PBS pour entourer le PDMS sur la pièce inférieure.Ensuite, utilisez une pince pour retirer tout excès de collagène autour des bords et détachez lentement la pièce plate de PDMS tout en maintenant le collagène hydraté avec du PBS. Pour préparer la pièce supérieure, utilisez une pince pour soulever l'ensemble PMMA et PDMS et retournez-le. Ajoutez ensuite quelques gouttes de PBS sur la face interne et retirez le moule en PDMS de la pièce PMMA supérieure en le décollant rapidement et fermement.Ensuite, à l’aide d’une deuxième paire de forceps, retirer délicatement les broches de l’autre côté du boîtier en PMMA. S’assurer que l’entrée et la sortie sont dégagées de tout excès de collagène en déplaçant les broches vers le haut et vers le bas avant de les retirer. Si les broches tombent d’elles-mêmes, utiliser simplement une autre broche stérile pour s’assurer que l’entrée et la sortie sont bien dégagées.Ensuite, déposez davantage de PBS sur le collagène microstructuré, retournez la pièce et insérez des vis dans les quatre trous situés aux coins. Placez maintenant délicatement la pièce supérieure sur la pièce inférieure en alignant les vis avec leurs trous. Veillez à ce que les deux pièces ne glissent pas l'une par rapport à l'autre.Ensuite, vissez délicatement les pièces ensemble à l'aide d'une spatule et avec une pression légère afin de ne pas les serrer excessivement. Il est essentiel d'être délicat et précis lors du montage. En appliquant une quantité suffisante de PBS, la friction entre les surfaces internes est réduite.Lors de la fixation des vis, procédez lentement et arrêtez-vous dès que vous rencontrez une résistance. Ensuite, aspirez le PBS entourant les surfaces de PMMA et placez un petit morceau de coton sous un bord du dispositif. Puis, aspirez tout résidu de PBS présent dans les réservoirs.À présent, remplissez à nouveau les réservoirs avec du milieu de culture cellulaire et incubez l'appareil pendant au moins une heure pour permettre la gélification. Une fois l'appareil assemblé, utilisez une suspension de cellules endothéliales à 10 millions de cellules par millilitre pour ensemencer l'appareil. Retirez le milieu des réservoirs d'entrée et de sortie, puis, à l'aide d'une pipette de 20 microlitres équipée de pointes de chargement pour gel, ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire au centre du réservoir d'entrée.Les cellules vont immédiatement s'écouler et recouvrir le réseau. Une fois que les cellules ont rempli le réseau et que l'écoulement est équilibré, ajoutez 150 microlitres de milieu dans les deux réservoirs. Incubez ensuite le dispositif pendant une heure ou plus afin que les cellules puissent s'étaler et s'attacher.Pour une culture à long terme, retirez le milieu toutes les 12 heures et ajoutez à nouveau 150 microlitres de milieu frais dans le réservoir d'entrée et 50 microlitres dans le réservoir de sortie. Après 24 heures de culture, une pompe à seringue peut être utilisée pour établir des conditions d'écoulement continu. Après avoir apporté les matériaux dans la hotte biologique, retirez les tubulures des sachets d'autoclave et placez-les dans une boîte. Ensuite, préparez une boîte d'écoulement stérile en faisant fondre les orifices latéraux, puis en passant le tube à travers. Préparez une seringue de 10 millilitres avec du milieu de culture contenant 3,5 % de dextran. Ensuite, fixez la seringue remplie au raccord verrouillable à l'extrémité du tube d'entrée.Ensuite, fixez la seringue à la pompe et perfusez le milieu jusqu'à ce que toutes les bulles d'air piégées aient quitté le tube. Une fois le tube rempli de milieu et débarrassé des bulles, transférez l'appareil dans une nouvelle boîte et insérez le raccord d'entrée dans l'orifice d'entrée du boîtier. Réglez ensuite la pompe à seringue à la débit souhaité et commencez la perfusion.Préparez la sortie en remplissant le tube avec du milieu de culture cellulaire à l’aide d’une aiguille de 18 g et d’une seringue d’un millilitre. Serrez-le avec une pince et retirez l’aiguille. Ensuite, faites fondre un trou dans le bouchon du tube de collecte de sortie à l’aide d’un fer à souder.Ensuite, ajoutez du milieu dans le tube de collecte, insérez le tube et fixez le raccord à l'orifice du boîtier. Tout au long de ce processus, une pince est utilisée pour retenir le milieu dans le tube. Une fois terminé, transférez l'ensemble du dispositif dans un incubateur.En fonction des conditions expérimentales, la seringue peut nécessiter d'être rechargée après 24 à 36 heures. Lors du remplacement de la seringue, veillez à ne pas introduire de bulles dans le tube. Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ont été perfusées à travers le réseau microfluidique intégrant du collagène afin de former une lumière perméable et un endothélium confluant.Plusieurs géométries de vaisseaux ont été utilisées afin d'établir différentes conditions d'écoulement. Des conditions de culture en écoulement continu ont été employées pour appliquer une contrainte de cisaillement constante sur l'endothélium. Les dispositifs cultivés dans des conditions d'écoulement par gravité ont également maintenu une viabilité et une perméabilité à long terme.Une caractéristique essentielle de ces microvaisseaux est leur capacité à répondre à des stimuli inflammatoires. Ceci a été étudié en perfusant les microvaisseaux avec du sang total. Les microvaisseaux non stimulés contenaient un endothélium non activé et sont restés au repos.Les microvaisseaux stimulés se sont activés et leur réponse a initié la formation d'un thrombus. Une autre application intéressante du système consiste à étudier les changements phénotypiques dans les vaisseaux formés à partir de différentes populations de cellules endothéliales. Par exemple, les microvaisseaux formés à partir de populations uniques de cellules souches présentaient des capacités de bourgeonnement angiogénique différentes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer des micro-vaisseaux et de les utiliser pour étudier la biologie vasculaire et construire des systèmes d'organes modèles complexes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la pratique améliorera le taux de formation réussie des vaisseaux et permettra d'obtenir des résultats plus reproductibles. Une fois maîtrisée, plusieurs dispositifs peuvent être fabriqués en trois à quatre heures.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la perfusion de sang total, le traitement au dextran ou des traitements pharmaceutiques peuvent être réalisées afin d'évaluer la quiescence endothéliale, la perméabilité, la réponse aux médicaments, ainsi que la morphologie générale des cellules et des vaisseaux.

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