Name: Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Découvrez la création d'échafaudages cardiaques néonataux pour la cardiologie régénérative à partir de tissu murin. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellule-matrice et les propriétés uniques de la matrice extracellulaire néonatale.

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Les auteurs remercient chaleureusement Mme Cynthia DeKay pour la préparation des figures.

Toutes les expériences de souris ont été effectuées en conformité avec loi sur la protection des animaux et des États-Unis ont été approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux à l&#39;Université du Minnesota. 1. Méthode de coeur Souris Isolation <ol><li> Euthanasier une souris néonatale par décapitation avec une lame à usage unique. </li><li> Badigeonner le thorax avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Disséquer la peau de la poitrine en réduisant l&#39;écart de la paroi thoracique, avec des ciseaux standards tout en tirant la peau latéralement par une paire de pinces # 5. </li><li> Perforer l&#39;abdomen juste en dessous du sternum avec les ciseaux en coupant à travers la paroi abdominale. Saisissant le processus xiphoïde avec # 5 forceps, rétracter le sternum rostrale du corps pendant la coupe que les nervures de chaque côté de la poitrine avec les ciseaux. La cage thoracique est réfléchie supérieurement avec la pince pour révéler le cœur. </li><li> disséquer Carrément les deux lobes principaux du thymus en tirant latéralement avec # 5 forceps, exposerla crosse de l&#39;aorte, ainsi que les veines Caval et pulmonaires. </li><li> Transect les artères principales de la crosse de l&#39;aorte et l&#39;aorte elle-même, avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Maintenir l&#39;aorte entre la base du coeur et l&#39;artère brachiocéphalique. Saisir les extrémités des vaisseaux sectionnés avec le # 5 forceps pour refléter le cœur vers l&#39;avant, la séparant de la trachée et de l&#39;œsophage. </li><li> Transect la vascularisation pulmonaire et d&#39;autres veines principales, en coupant entre les poumons et le coeur des deux côtés du cœur avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Les veines restent ouvertes pour assurer le drainage. </li><li> Retirer le cœur du médiastin avec les # 5 pinces, saisir les extrémités coupées des grands navires. Placez le coeur dans une boîte de culture de 60 mm contenant du phosphate saline stérile tamponnée (PBS) pour le cathétérisme. </li></ol> 2. Méthode de décellularisation par Langendorff Perfusion <ol><li> Préparer l&#39;ensemble de cathéter à l&#39;avance. Dessiner une section 4 cmPE 50 tube dans une petite flamme d&#39;alcool pour créer un plus petit, plus mince cathéter. Couper les extrémités d&#39;une lame pour atteindre les dimensions (env. 300 um de diamètre extérieur OD avec une bride d&#39;env. 500 um DO) représentée sur la figure 1. Ceci fournira deux cathéters symétriques de chaque côté de la traction. </li><li> Pointez l&#39;extrémité du tube de coupe dans la flamme brièvement, pour faire fondre une bride sur l&#39;ouverture à l&#39;extrémité mince. </li><li> Remplir la seringue 12 ml avec du PBS et assembler le cathéter en plaçant un robinet d&#39;arrêt à 3 voies sur la seringue. Ajouter un 22 G x 1 aiguille du robinet et conduire l&#39;aiguille à travers le septum. Faites glisser le PE tube cathéter dessiné sur l&#39;aiguille (Fig. 1). </li><li> Irriguer les pièces assemblées avec du PBS, assurant que toutes les bulles d&#39;air ont été enlevés. </li><li> Insérez le cathéter, préparé comme décrit ci-dessus, dans l&#39;aorte du coeur isolé, pas étendant au-delà de la valve aortique et ligaturer avec un match nul de 7-0 suture. Reste la bride de til cathéter à proximalement contre la cravate, ce qui rend un joint étanche et empêchant le cœur de se détacher du cathéter. </li><li> Observer le cathétérisme sous grossissement, tandis que perfuser doucement le cœur à l&#39;aide de la seringue contenant du PBS. Veiller à ce qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites dans le système et le tissu homogène que le sang blanches latente est retirée. </li><li> Placer la cloison dans le col de l&#39;adaptateur d&#39;entrée et le sceller en pliant les côtés au-dessus de la vitre. </li><li> Fixer le réservoir rempli avec 60 ml de 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l&#39; eau distillée (dH 2 O) par l&#39; intermédiaire d&#39; une ligne de longueur suffisante pour produire une colonne qui génère 20 mm Hg de pression comme indiqué sur la Fig. 1. Calculer la pression de la hauteur de colonne de liquide en fonction de la relation de 1 mm de Hg est égale à 1,3595 cm H 2 O. Attention: SDS est une poudre hautement floculant avec des propriétés irritantes. Le contact doit être évité. Manipulez la poudre en utilisant des vêtements de protection appropriés. </li><li> Perfuser cœur avec 1% SDS pendant 14 heures. Le cœur sera translucide en apparence sans tissu restant observable. </li><li> Rincer le système jusqu&#39;à le robinet de la solution SDS restant et le remplacer par 10 ml dH 2 O. Perfuser le cœur avec 10 ml de 1% de Triton X-100 (dilué dans de l&#39; eau distillée), suivie par 10 ml dH 2 O, suivie par 60 ml de PBS contenant de la pénicilline streptomycine 1x (Pen-Strep). </li><li> Rangez le coeur dans du PBS avec 1x Pen-Strep à 4 ° C. Si l&#39;application post-décellularisation destinée nécessite perfusion puis le cathéter dans l&#39;aorte doit être maintenue, sinon couper l&#39;attache de suture et retirer le cathéter. </li></ol> 3. Détermination de l&#39;ADN <ol><li> Préparer un condensé de l&#39;ECM ou le contrôle cardiaque décellularisé utilisant 200 pg / ml de proteinase K dans 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,45% de Tween 20 dans du Tris 10 mM (pH 8,3). </li><li> Laisser incuber le tissu à 55 ° C avec agitation jusqu&#39;à ce que le tissu est dissous,généralement 4-5 h. </li><li> Quantifier la teneur en ADN de l&#39;homogénat avec un dosage de liaison à l&#39; ADN 4,11. </li></ol> 4. Fixation et Sectionnement des tissus <ol><li> Fix décellularisé, coeurs recellularized ou le contrôle P3 dans 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver le tissu dans du PBS 3x. </li><li> Placer le tissu dans une solution de 7,5% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il coule. </li><li> Modifier la solution à 15% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C, encore une fois, jusqu&#39;à ce qu&#39;il coule. </li><li> Chauffer le tissu à 37 ° C, de remplacer la moitié du volume avec une solution de gélatine à 15% de saccharose et 0,1 M de tampon phosphate et équilibrer pendant une nuit. Les concentrations de gélatine sont augmentées par paliers par l&#39;intermédiaire de 1%, 2,5%, 5% et enfin 7,5% deux fois. </li><li> Placer les échantillons dans cryomoules utilisant fraîche 7,5% de gélatine. Pour restaurer la forme des échantillons décellularisés, liquide gélatine peut être perfusée dans les chambres comme til les cœurs sont moulés. Congeler par flottage cryomoules sur l&#39;azote liquide. Conserver à -80 ° C. </li><li> Couper (10 um d&#39;épaisseur) sections avec un cryostat. Apportez la lame près de la surface de section et d&#39;observer la section se déplacer hors du couteau sur la surface en raison de la charge sur les lames électrostatiquement traitées. Sécher les diapositives pendant la nuit et stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure. </li><li> Retirer les lames du congélateur, équilibrer à température ambiante puis placer dans un bocal de Coplin contenant du PBS pendant 20 min à 37 ° C pour dissoudre la gélatine. </li><li> Colorer les sections coupées de l&#39;étape 4.7 à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine. Placer les lames dans une jarre de Coplin. Exposer les diapositives hydratés à l&#39;étape 4.8 à hématoxyline pendant 45 sec, l&#39;eau du robinet pendant 1,5 min, tampon pendant 3 minutes, l&#39;eau du robinet pendant 1 min, agent de bleuissement pendant 1,5 min, l&#39;éthanol 80% pendant 1 min, alcooliques éosine Y pendant 8 sec, éthanol 80% pendant 1 min, l&#39;éthanol à 100% pour 1 min 2x, agent de compensation (remplaçant du xylène) pour 1 min 3x, lamelle avec de la résinemoyen de montage sur la base. Examiner les lames au microscope. </li><li> Pour confirmer le maintien de l&#39;ECM protéine réactivité de l&#39;ECM cardiaque, une teinture pour ECM des protéines structurales telles que le collagène IV, en plaçant les lames hydratés dans une chambre humidifiée et on traite avec 10% d&#39;âne sérum normal (PDN) dans un tampon phosphate salin à 0,1% de Triton -X100 (PBST) pendant 1 heure à la température ambiante (RT). Utiliser un volume suffisant pour couvrir les coupes de tissu. </li><li> Remplacer la solution avec l&#39;anticorps primaire de choix à une dilution déterminée empiriquement dans 5% NDS / PBST. Par exemple, l&#39;anticorps de collagène IV a été dilué à 1: 150. Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les lames avec du PBST 3x et à appliquer un anticorps secondaire de choix conjugué à un colorant fluorescent. Diluer l&#39;anticorps par une quantité déterminée de manière empirique. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS 3x. </li><li> Colorer les lames avec un colorant de liaison à l&#39;ADN tels que le DAPI afin de vérifier l&#39;absence de noyaux cellulaires en utilisant un mounti contenant DAPIng moyen lorsque le couvercle de glisser les diapositives. </li><li> Examiner les lames avec un microscope à fluorescence de 50 à 400X. </li></ol> 5. P1 néonatal murin Ventricular cardiomyocytes pour Recellularization <ol><li> Vaporiser chaque chiot avec 70% d&#39;éthanol et décapite avec une lame à usage unique. </li><li> Tenir chaque chiot entre le pouce et l&#39;index tandis que le thorax est divisé sur la ligne médiane avec de petits ciseaux stériles pour exposer la cavité thoracique. Appliquer une pression pour permettre au coeur de faire saillie librement de la poitrine alors qu&#39;il est coupé libre des gros vaisseaux et les oreillettes ne laissant que le tissu ventriculaire. </li><li> Placez chaque coeur directement dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de glace-froid calcium, la solution saline tamponnée de Bicarbonate libre Hank avec mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic 20 (CBFHH) jusqu&#39;à ce que tous les cœurs sont recueillis. </li><li> Aspirer le CBFHH et ajouter 10-15 ml de CBFHH frais (glacé) au tube. Laver le tissu en faisant tourbillonner le tissu en til le tube plusieurs fois. </li><li> Décanter la solution contenant les coeurs dans une boîte de Petri en plastique de 60 mm. </li><li> Disséquer tout tissu auriculaire latente du cœur sous un grossissement sur la glace en rognant loin de les coeurs avec les ciseaux à ressort. Émincer les ventricules en taille homogène petits morceaux. Retirez tout tissu non-ventriculaire séparé du plat avec # 5 forceps. </li><li> Pipet autant de la solution CBFHH que nécessaire pour transférer les fragments de tissus dans un petit flacon stérile qui contient une barre d&#39;agitation micro stérile. </li><li> Laisser le tissu dans les sédiments au fond du flacon et retirer la solution CBFHH. </li><li> Compenser 50 ml d&#39;une solution d&#39;enzyme de 1,75 mg / ml de trypsine, 20 pg / ml de DNase II CBFHH. Pipet 5 ml de cette solution d&#39;enzyme et l&#39;ajouter à un tube contenant du tissu ventriculaire émincé et le placer sur un agitateur magnétique. Agiter à une vitesse constante (340 rpm) à température ambiante pendant 8 min. NOTE: L&#39;action d&#39;agitation doit être doux et pourtant permettrela suspension de la suspension. </li><li> Retirer la cuvette de la plaque d&#39;agitation et de permettre la suspension de sédiments pendant 3 min. Pipeter et jeter le surnageant digérer initiale, car elle contient principalement des cellules sanguines et des débris de tissu. </li><li> Pipeter une seconde partie aliquote de 5 ml de la solution d&#39;enzyme et l&#39;ajouter au ventricule digestion. Agiter pendant 8 min et laisser sédimenter pendant encore 3 min. Avant de commencer les digestions, préparer deux tubes de 50 ml (marqué 1 et 2) contenant chacun 12 ml glacé sérum de veau fœtal (FBS). Placer un tamis cellulaire de 40 pm au sommet de chaque tube. Pipet ce surnageant à travers le filtre sur le tube 1. </li><li> Répétez le processus de digestion une 8 fois supplémentaires, en alternant le placement du surnageant de digestion entre les deux tubes contenant du FBS. Divisez le dernier surnageant à parts égales entre les tubes 1 et 2 pour assurer des volumes égaux dans chaque tube. NOTE: Chaque tube de collection contient maintenant 32,5 ml volume total de la suspension cellulaire. </li><li> Centrifuger les tubes contiennentment le surnageant 150 g pendant 6 min à 4 ° C. </li><li> Lors de la collecte des aliquotes de digestion, préparer cinq 100 tissus mm plaques de culture avec 6 ml de milieu (Modified Eagle Media (DMEM de Dulbecco) avec 10% de FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamine) par plaque. Incuber ces aliquotes à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 30 minutes pour équilibrer les médias. </li><li> Aspirer le mélange d&#39;enzymes CBFHH et remettre en suspension les cellules dans 30 ml de milieu de culture préparé ci-dessus, en combinant les cellules des deux tubes de prélèvement. </li><li> Retour 6 ml de suspension cellulaire dans chacune des plaques de 100 mm et incuber pendant 45 min à 37 ° C. </li><li> A la fin de l&#39;incubation, transférer les cellules non-adhérentes à 5 nouveaux plats et re-incuber pendant 45 minutes (la fraction de fibroblaste aura commencé à adhérer aux plats et peuvent être cultivées séparément si on le souhaite). </li><li> A la fin du second tour de pré-placage, recueillir les médias et les cellules non-adhérentes de la vaisselle et faire tourner les supports à 150xg pendant 6 min. </li><li> Soutirer l&#39; excès support pour amener les cellules à la concentration désirée approximative (4,0 x 10 5 cellules par recombinaison dans 100 ul de solution de perfusion). Retirer une aliquote de comptage et ou la viabilité des tests 14. </li></ol> 6. bioréacteur Recellularization de P3 Coeur Matrice <ol><li> Prétraiter la matrice de coeur isolé avec des milieux de culture (voir l&#39;étape 5.15) pendant la nuit avant d&#39;ajouter les cellules. </li><li> Assembler les éléments d&#39;un système Langendorff comme représenté sur la Fig. 2. Autoclaver les pièces de verre et d&#39; oxyde d&#39;éthylène et stériliser les pièces en matière plastique pour assurer la stérilité. Différentes sous-unités du système peuvent être assemblés dans une hotte à flux laminaire, avant d&#39;être monté sur la béquille de support. Circulant bain d&#39;eau et le chemin d&#39;écoulement d&#39;eau chauffée a été omis pour la clarté. </li><li> Remplir le système assemblé avec 120 ml de milieu de culture de tissu (voir l&#39;étape 5.15). </li><li> Placez la matrice de coeur cathétérisé de l&#39;étape 2.14 dans un 60 mm culAntenne ture sous grossissement et connecter une seringue de 1 ml avec 22 G x 1 aiguille chargée de suspension cellulaire de l&#39;étape 5.20 au cathéter. Assurez-vous que cette assemblée est libre de bulles d&#39;air pour éviter embolisation cœur. </li><li> perfuser doucement les 100 pi de suspension cellulaire dans la matrice cardiaque par les artères coronaires. Une fois terminé, détacher la combinaison seringue / aiguille. NOTE: Une perfusion lente d&#39;env. 20 ul par minute est nécessaire pour empêcher les cellules de couler des veines, qui transite sur le cœur. </li><li> Avec un bout émoussé 22g solidaire du raccord Luer sur la face inférieure du couvercle du bocal de coeur bioréacteur, pousser le cathéter sur la tubulure. </li><li> Démarrer la pompe péristaltique et observer que les flux se déroule comme décrit dans la figure 2. Produit de débit du réservoir par la pompe à travers le piège à bulles au cathéter placé dans l&#39;aorte à l&#39; étape 2.5 (chemin rouge sur la figure. 2). Observer l&#39;écoulement de la circulation cardiaque en dehors de la veines et au goutte à goutte de l&#39;apex, recirculation vers le réservoir de médias. REMARQUE: Le débit de perfusion dépend de différents facteurs tels que la résistance vasculaire de la construction et de la taille du cœur, mais un taux de 50 à 100 ul / min est un bon point de départ. Aux points de temps intermédiaires, les évaluations fonctionnelles peuvent être exécutées. L&#39;échelle de la taille du cœur recellularized néonatale limite les évaluations, qui peuvent être réalisées , mais nous avons déterminé que les systèmes basés optiquement peuvent être utilisés pour quantifier en battant le comportement comme ils ont été utilisés dans des coeurs de rats adultes. 4 La construction peut être perfusé pour étendu périodes de temps (jusqu&#39;à 23 h). </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La dépendance de cette technique sur des perfusions répétées du cœur fait éviter d&#39;une embolie, une composante essentielle d&#39;un résultat positif. À partir de la première cathétérisation du cœur dans les étapes 2,2-2,6, aux changements de solution entre les étapes 2.8-2.14, il y a des manipulations qui peuvent permettre l&#39;introduction de bulles d&#39;air qui compromettent l&#39;écoulement du liquide de perfusion dans le myocarde. En raison de la petite taille du cœur du nouveau-né, même de minuscules bulles d...

L&#39;insuffisance cardiaque est fréquente et mortelle. Il est une maladie progressive qui se traduit par une diminution de la contractilité du coeur, ce qui altère le flux sanguin vers les organes et laisse les besoins métaboliques de la non satisfaite du corps. On estime que 5,7 millions d&#39; Américains ont une insuffisance cardiaque et il est la principale cause d&#39;hospitalisation aux États-Unis 9. Le coût collectif de traitement des patients en insuffisance cardiaque aux États-Unis dépasse les 300 milliards de dollars par an 9-10. Le seul traitement définitif de l&#39;insuffisance cardiaque au stade terminal est une greffe cardiaque orthotopique. Chaque année, on estime que plus de 100.000 coeurs donateurs sont nécessaires pour les procédures de transplantation cardiaque aux États-Unis 1-2. En raison du nombre limité de donateurs, seuls environ 2.400 transplantations sont réalisées chaque année aux États - Unis 2. De toute évidence, cette pénurie d&#39;organes doit être abordée que d&#39;autres stratégies sont nécessaires pour produire des organes supplémentaires pour transplantationtion et, idéalement, ces organes seraient autologue de manière à éviter les complications associées au rejet et de la durée de vie immunosuppression. Cardiomyocytes adultes Mammifères démontrent une capacité de régénération limitée sur blessure , mais des données récentes suggèrent que les cœurs néonatals mammifères maintiennent une capacité de régénération remarquable suite à une lésion 5-8. Plus précisément, après une résection chirurgicale partielle, une fenêtre de régénération a été découverte entre la naissance et le jour post - natal 7. Cette période de régénération se caractérise par une absence de cicatrice fibrotique, la formation de la néovascularisation, la libération de facteurs angiogéniques , de l&#39;épicarde, et la prolifération des cardiomyocytes 8/5 , 11. Cette fenêtre de régénération du temps fournit la possibilité d&#39;utiliser le cœur du nouveau-né comme une nouvelle source de matériel pour le développement d&#39;un cœur bioartificiel. La matrice extracellulaire est connu pour fournir des indices importants pour promouvoir cardiomyocyte prolifération et la croissance. Différences distinctes dans la disponibilité des molécules dans les matrices néonatales et adultes 12 et leur capacité à promouvoir la régénération ont été explorées 13. les matrices adultes décellularisés ont été utilisées dans plusieurs études pour fournir un échafaudage de l&#39;ECM pour la repopulation cellulaire et la génération d&#39;un coeur bioartificiel. Bien que ces études, et de nouvelles découvertes dans les technologies de cellules souches, progressent rapidement, plusieurs obstacles doivent encore être remplies. Par exemple, les limitations dans la préservation de la structure native de la matrice, l&#39;intégration cellulaire dans la paroi de la matrice, et la capacité de soutenir la prolifération et à la croissance de toute limite le succès de cette approche. Alors que les attributs de régénération supérieures ont été attribuées au cœur du nouveau-né, les aspects pratiques de l&#39;utilisation d&#39;un tel tissu ont limité son exploration. Sur la base de la capacité de régénération démontré du cœur néonatale, nous avons développé de nouvelles matrices en développant unetechnique de décellularisation pour le coeur P3 de la souris. Le cœur P3 a été choisi pour ces études car il est dans la fenêtre de régénération cardiaque comme précédemment déterminé 6 mais le cœur est assez grand pour la récolte, decellularize et recellularize. Le but de cette étude est de démontrer la faisabilité de la création d&#39;une matrice à partir d&#39;un cœur de souris néonatale. Nos études fournissent des preuves de la faisabilité de décellularisation d&#39;une minute, le cœur du nouveau-né, tout en maintenant l&#39;intégrité structurelle et protéinique de l&#39;ECM. Nous démontrons également la capacité de recellularize cette ECM cardiaque avec mCherry cardiomyocytes exprimant et nous avons examiné ces cardiomyocytes pour l&#39;expression de différents marqueurs cardiaques suivants recellularization. Cette technologie permet à l&#39;essai de la supériorité d&#39;une matrice du nouveau-né à l&#39;élaboration d&#39;un coeur bioartificiel.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Matériaux pour l’isolement du cœur de souris </fort></td></tr> <tr><td>bébés souris P1 (comme illustré ; B6 ; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>60 mm Plat de culture</td><td>BD Falcon 353004</td><td></td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4 (stérile)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Lame à usage unique</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Ciseaux standard</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort 10 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>15024-10</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td colspan="4">2. Matériaux pour la décellularisation</> forte</td></tr> <tr><td>Adaptateur d’entrée</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>1/8 po. ID x 3/8 OD Tube C-Flex</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Luer mâle à 1/8 » adaptateur de tuyau cannelé</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Luer femelle à 1/8 » adaptateur de tuyau cannelé</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 suture chirurgicale&nbsp ;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Support à anneau</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Pince support régulier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>60 cc seringue barillet&nbsp ;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>22 G x 1 Seringue Aiguille</td><td>BD</td><td>305155</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Seringue 12 cc</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tube PE50</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Doit être formable par la chaleur. Polyéthylène recommandé.</td></tr><tr><td>1 % FDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Qualité ultra-pure recommandée. Préparez une solution fraîche et filtrez la stérilisation avant utilisation.</td></tr><tr><td>1 % Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Préparez une solution fraîche à partir d’un stock à 10 % et filtrez, stérilisez avant utilisation.</td></tr><tr><td>Eau stérile dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>ou MilliQ.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>ou équivalent &nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">3. Matériaux pour la quantification de l’ADN </forte></td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg</td></tr><tr><td>activité KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>MgCl2&#183 ; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tris base/chlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>ou</td></tr><tr><td>équivalent Pico-Green kit de dosage de l’ADNdb</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>P7589</td><td>nécessite un fluorimètre pour lire</td></tr> <tr><td colspan="4">4. Méthode de fixation et de sectionnement des tissus</forts></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Gélatine de type A à partir de la peau porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>doit être de 300 bloom ou plus</td></tr><tr><td colspan="4">5. Méthode d’histologie tissulaire </td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>ou lames</td></tr><tr><td>de microscope équivalentes&nbsp ; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&nbsp ;</td><td>Surgipath/Leica Selectech·</td><td>3801570</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp ;</td><td>3803590</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tampon bleu&nbsp ;</td><td>Surgipath/Leica Selectech·</td><td>3802915</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Alcool Eosin Y 515&nbsp ;</td><td>Surgipath/Leica Selectech·</td><td>3801615</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Formule 83 Substitut de xylène&nbsp ;</td><td>CBG Biotech&nbsp ;</td><td>CH0104B</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Support de montage Permount&nbsp ;</td><td>Fisher Chemical&nbsp ;</td><td>SP15-500</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Collagène IV Anticorps</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>&alpha ;-actinine</td><td>Anticorps Abcam</td><td>AB9465</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>mCherry Anticorps</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>NKX2.5 Anticorps</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Donkey anti-souris AF488 Anticorps</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Âne anti-poulet AF594 Anticorps</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp ;</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre CY5 Anticorps</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp ;</td><td>705-175-147</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 Jackson</td><td>Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant avec DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td colspan="4">6. Isolement des cardiomyocytes ventriculaires néonatals à l’aide du pré-placage </td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tube de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm plaques</td><td>La surface Corning</td><td>353803</td><td>Primeria améliore la fixation des fibroblastes, favorisant une plus grande pureté des myocytes</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco’s Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Vitamine B12&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>ou plaques</td></tr><tr><td>équivalentes recouvertes de fibronectine&nbsp ;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Bioréacteur Heart</td><td>verrerie Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>Doit être stérilisable par autoclave ou par gaz.</td></tr></tbody></table>

néonatale cardiaque echafaudages: matrices nouveaux pour Études régénératives

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Le seul traitement définitif de l’insuffisance cardiaque terminale est la transplantation cardiaque orthotopique. Chaque année, on estime que plus de 100 000 cœurs de donneurs sont nécessaires pour les procédures de transplantation cardiaque auxÉtats-Unis 1-2. En raison du nombre limité de donneurs, seulement environ 2 400 greffes sont effectuées chaque année aux États-Unis2. De nombreuses approches, allant des études de thérapie cellulaire à l’implantation de dispositifs d’assistance mécanique, ont été entreprises, seules ou en combinaison, dans le but d’inciter le cœur à se réparer lui-même ou à reposerle cœur défaillant. Malgré ces efforts, les dispositifs d’assistance ventriculaire sont encore largement utilisés dans le but de faire le pont vers la transplantation et l’utilité des thérapies cellulaires, bien qu’elles soient prometteuses sur le plan curatif, se limite encore aux essais cliniques. De plus, une xénotransplantation directe a été tentée, mais le succès a été limité en raison du rejet immunitaire. De toute évidence, une autre stratégie est nécessaire pour produire des organes supplémentaires pour la transplantation et, idéalement, ces organes seraient autologues afin d’éviter les complications associées au rejet et à l’immunosuppression à vie. La décellularisation est un processus qui consiste à retirer les cellules résidentes des tissus pour exposer la matrice extracellulaire native (MEC) ou l’échafaudage. La décellularisation par perfusion offre une préservation complète de la structure tridimensionnelle du tissu, tout en laissant intactes l’essentiel des propriétés mécaniques du tissu4. Ces échafaudages peuvent être utilisés pour le repeuplement avec des cellules saines afin de générer des modèles de recherche et, éventuellement, des organes indispensables pour la transplantation. Nous avons exposé les échafaudages de souris néonatales (P3), connues pour conserver des capacités de régénération cardiaque remarquables5-8, à la décellularisation médiée par détergent et nous avons repeuplé ces échafaudages avec des cellules cardiaques murines. Ces études soutiennent la faisabilité de la construction d’un cœur néonatal. Ils permettent en outre d’enquêter pour savoir si la MEC des cœurs postnatals précoces peut contenir des indices qui se traduiront par de meilleures stratégies de recellularisation.

décellularisation En moyenne, le temps de décellularisation d&#39;un cœur de P3 en utilisant ce protocole est d&#39;environ 14 heures. étant donné un poids cardiaque moyenne de 23 mg pour le nouveau-né de P3. Acellularity Figure 3a montre un coeur néonatal P3 intact (toute la montagne). Figure 3b montre le même cœur suivant décellularisation. Les figures ...

Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

L'objectif général de cette méthodologie est de générer des échafaudages novateurs à partir de tissu cardiaque néonatal de la couche de revêtement interne du cœur pour leur utilisation dans des études de régénération. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en cardiologie régénérative. Elle fournit un modèle nouveau pour l'étude des interactions cellules-matrice, la matrice extracellulaire étant dérivée d'un tissu cardiaque capable de prolifération.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de découvrir les nouveautés de la matrice extracellulaire néonatale. La démonstration de la procédure sera effectuée par Stefan Kren, un technicien de mon laboratoire. Avant de commencer la procédure, faites chauffer une section de quatre centimètres de tubulure PE 50 au-dessus d'une petite flamme à l'alcool afin de créer un cathéter plus petit et plus fin.Rabotez les extrémités aux dimensions appropriées afin d'obtenir deux cathéters symétriques de chaque côté du PO, puis placez brièvement une extrémité coupée du tube dans la flamme pour faire fondre une phalange sur l'ouverture à l'extrémité fine. Ensuite, remplissez une seringue de 12 millilitres avec du PBS et fixez un robinet à trois voies sur la seringue. Attachez une aiguille de calibre 22 au robinet et faites passer l'aiguille à travers le septum.Ensuite, faites glisser le cathéter en tube PE sur l'aiguille et rincez l'ensemble avec du PBS. Lorsque l'ensemble du cathéter est prêt, passez l'thorax du nouveau-né avec de l'éthanol à 70 %. Puis, utilisez des ciseaux standards pour inciser la peau au niveau du thorax, tout en tirant latéralement sur le tissu à l’aide d’une pince n°5.Ensuite, percer la paroi abdominale juste en dessous du sternum et saisir l'appendice xyphoïde avec la pince. Relever le sternum vers l'avant par rapport au corps tout en coupant les côtes de chaque côté de la poitrine, puis rabattre la cage thoracique vers le haut. Lorsque le cœur est visible, tirer latéralement sur le thymus pour disséquer les deux lobes principaux, exposant ainsi l'arc aortique ainsi que les veines cave et pulmonaires.À l’aide de ciseaux à ressort de 10 centimètres, sectionner les artères principales à partir de l’arc aortique, ainsi que l’aorte elle-même. Saisir les extrémités des vaisseaux sectionés pour ramener le cœur vers l’avant, le séparant ainsi de la trachée et de l’œsophage, puis couper entre les poumons et le cœur et de chaque côté du cœur afin de sectionner le réseau vasculaire pulmonaire et les autres veines principales. Ensuite, saisir les extrémités sectionées des gros vaisseaux et retirer le cœur du médiastin, en plaçant le cœur dans une boîte de culture de 60 millimètres contenant du PBS stérile.Pour décellulariser le cœur, placez la boîte de culture sous un microscope stéréo et insérez l'aiguille de l'ensemble du cathéter dans l'aorte jusqu'à la valve aortique, sans dépasser celle-ci. Fixez l'aiguille avec un point de suture 7-0, en appuyant la phalange du cathéter proximalement contre le point de suture afin d'obtenir un joint étanche, puis perfusez doucement le cœur avec du PBS. En l'absence de fuite, le tissu deviendra homogènement blanc au fur et à mesure de l'élimination du sang résiduel.Placer le septum dans le col de l'adaptateur d'entrée et replier les bords du septum sur le verre. Ensuite, fixer un réservoir rempli de 60 millilitres de dodécylsulfate de sodium à 1 % dans de l'eau distillée à l'aide d'une tubulure de longueur suffisante pour produire une colonne générant une pression de 20 millimètres de mercure, puis perfuser le cœur avec le SDS pendant 14 heures. À la fin de la perfusion, le cœur sera translucide et aucun tissu résiduel observable ne sera présent.Nettoyer le système jusqu'au robinet avec la solution SDS restante et remplir le réservoir avec 10 millilitres d'eau déionisée. Ensuite, perfuser le cœur consécutivement avec 10 millilitres de Triton X-100 à 1 %, 10 millilitres d'eau déionisée, et 60 millilitres de PBS contenant de la pénicilline et de la streptomycine. Après la dernière perfusion, conserver le cœur dans du PBS contenant des antibiotiques à quatre degrés Celsius.Pour recoloniser le tissu, transférer la matrice cardiaque munie d'un cathéter dans une boîte de culture de 60 millimètres sous un microscope stéréo et connecter une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 22 chargée avec les cellules d'intérêt appropriées au cathéter. Vérifier que l'ensemble est exempt de bulles et perfuser doucement 20 microlitres de la suspension cellulaire par minute dans la matrice cardiaque via les artères coronaires. Une fois que 100 microlitres de cellules ont été administrés, détacher la seringue et enfoncer le cathéter sur une aiguille émoussée de calibre 22 fixée au raccord Luer situé sur la face inférieure du couvercle du bioréacteur pour cœur.Maintenant, démarrez la pompe péristaltique et vérifiez que l'écoulement s'effectue depuis le réservoir, passe par la pompe, traverse le piège à bulles, puis atteint le cathéter, et que la circulation cardiaque s'écoule par les veines et goutte à partir de l'apex, en se réacheminant vers le réservoir de milieu. Sur ces images, la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine de cœurs intacts et décellularisés est présentée. Notez l'absence de noyaux positifs à l'hématoxyline et la réduction des structures éosinophiles dans le cœur décellularisé.Pour évaluer la composition de la matrice extracellulaire chez les cœurs néonatals intacts et décellularisés, l'immunomarquage montre que le collagène IV est fortement exprimé à la fois dans le cœur intact et décellularisé, et que la localisation de cette protéine est conservée après le retrait des cellules, tandis que les noyaux positifs au DAPI sont efficacement éliminés. La teneur en ADN diminue également dans les cœurs néonatals après la décellularisation par détergent, ce qui est conforme aux rapports utilisant la décellularisation par détergent dans d'autres tissus. Sur ces images, on peut observer des cardiomyocytes recellularisés ayant migré dans la paroi du ventricule gauche.Jusqu'à 23 jours après la perfusion, ces cellules migrées peuvent être positives pour les marqueurs des cellules progénitrices cardiaques, la mCherry, les marqueurs des cardiomyocytes différenciés ou le DAPI, la majorité des cellules exprimant les quatre marqueurs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 34 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ne pas provoquer d'embolie cardiaque en introduisant de l'air par l'appareil de perfusion.Après avoir suivi cette procédure, la production de gel et l’impression 3D peuvent être utilisées pour créer des greffons prolifératifs, voire des cœurs en 3D in vitro. Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs souhaitant promouvoir la régénération cardiaque. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la décellularisation et de la recellularisation d’un cœur de souris néonatale.N'oubliez pas que le travail avec le dodécylsulfate de sodium peut être dangereux, et que des précautions telles qu'un masque N-95 ou une hotte aspirante doivent toujours être prises lors de la manipulation du réactif sous forme de poudre sèche.

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Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

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