Name: Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Découvrez la microscopie holographique numérique pour l'imagerie quantitative sans colorant de l'inflammation intestinale et la cicatrisation épithéliale in vitro. Cette méthode permet l'évaluation objective des tissus murins et humains.

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Nous remercions Faekah Gohar pour la relecture du manuscrit. Nous remercions Sonja Dufentester et Elke Weber pour leur assistance technique experte.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous démontrons que DHM fournit une évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite murins et des échantillons humains de tissus colique ex vivo. En outre, nous avons montré DHM peut surveiller en permanence la cicatrisation épithéliale tout en fournissant simultanément l&#39; information multimodale sur les altérations cellulaires. Dans DHM, la reconstruction d&#39;hologrammes capturées numériquement est effectuée numériquement 32. Par conséquent, par rapport à la microscopi...

Les maladies inflammatoires de l&#39; intestin (MICI), à savoir la rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires idiopathiques du tractus gastro - 1. La recherche sur la physiopathologie des MICI et l&#39;évaluation des nouveaux médicaments potentiels ou approches diagnostiques nouveaux est particulièrement important. Dans la recherche fondamentale et la prise en charge clinique des patients atteints de MII, la muqueuse intestinale est devenu un centre d&#39;attention 2,3. La muqueuse représente une limite anatomique, au cours de laquelle l&#39;interaction entre les bactéries commensales, les cellules épithéliales et les différents composants cellulaires du système immunitaire intestinal orchestrer homéostasie intestinale 4,5. Cependant, chez les patients atteints de MII, l&#39; inflammation intestinale non contrôlée et persistante conduit à la muqueuse des dommages, détectable comme ulcérations ou une sténose, qui peut finalement aboutir à répartition de la fonction de barrière épithéliale, qui s&#39;aggrave l&#39; inflammation locale 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; épithélial la guérison des plaies est donc crucial pour la régénération épithéliale suivant l&#39; inflammation , mais est également une exigence de base pour la guérison des ulcères gastro - intestinaux ou une fuite anastomotique après chirurgie gastro - intestinale 7. La cicatrisation epitheliale peut être simulé in vitro dans la plaie et la guérison des tests dans des modèles murins d&#39;inflammation intestinale 8,9. Fois in vitro et in vivo des approches présentent des inconvénients qui limitent la précision de l&#39; évaluation expérimentale. Essais in vitro, comme des dosages classiques de grattage, exiger des procédures de coloration prolongées ou transfection avec des chromophores fluorescents. Ils sont souvent limités par leur surveillance discontinue de la prolifération cellulaire et la migration qui ne peuvent pas être automatisés 10. Modèles in vivo, tels que le sulfate de dextran de sodium (DSS) de la colite induite, manquent souvent robustes lecture-outs, en partie en raison de la variation importante vu des marqueurs de laboratoire, maroi de tels marqueurs inappropriés pour évaluer la colite gravité 11,12. L&#39; analyse histologique de la muqueuse enflammée est encore actuellement l&#39;approche la plus valable pour déterminer la colite gravité mais, comme la plaie de guérison des essais épithéliales in vitro, nécessite une coloration et dépend de l&#39;expertise de l&#39; enquêteur 13. La microscopie holographique récemment numérique (DHM), une variante de microscopie de phase quantitative 14, a été identifié comme un outil utile pour l&#39;évaluation de l&#39; épithélium la cicatrisation in vitro et in vivo 15. DHM permet d&#39; évaluer la densité du tissu en mesurant la longueur de trajet optique à retard (OPD) , qui diagnostic perspectives roman cancer 16-18 et la quantification de l&#39; inflammation liée tissus altérations 19. En outre, la DHM permet la surveillance de la dynamique de la morphologie des cellules en déterminant l&#39;épaisseur de la cellule, la cellule recouverte de surface et intracellulaires (protéine) la quantité de contenu <sup&gt; 15,20. Dans des essais in vitro, DHM permet également l&#39;analyse de processus physiologiques, par exemple, cellulaire perméabilité à l&#39;eau en évaluant les variations de volume cellulaire et d&#39; épaisseur 21,22. En outre, les mesures DHM peuvent être automatisées qui empêche le biais de l&#39;échantillon chercheur associé. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation de DHM dans un modèle murin de l&#39; inflammation intestinale, et appliquons également DHM à l&#39; analyse d&#39;échantillons de tissus humains pour le suivi quantitatif de la cicatrisation des plaies comme un test sans marqueur in vitro. Tout d&#39;abord, nous évaluons les altérations inflammatoires de différentes couches murales colique chez la souris colitique et des coupes de tissus provenant d&#39;êtres humains atteints de MICI. Après avoir décrit la DHM phase quantitative procédure d&#39;imagerie, nous fournissons des instructions détaillées pour l&#39;utilisation des composants de microscope, la préparation des coupes de tissus et aussi décrire l&#39;évaluation des images de phase quantitatives acquises. Ensuite, nous montrons que DHM peut être utilisée pour la surveillance multimodale continue de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, et décrire l&#39;analyse des caractéristiques cellulaires telles que l&#39; épaisseur de la couche de cellules, la masse sèche et le volume cellulaire donner un aperçu de la drogue induit et cellulaires altérations physiologiques.

<table><tbody><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxyméthane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, États-Unis</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sodique (DSS)</td><td>TdB Consultation, Uppsala, Suède</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham’s F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Autriche</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgique</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (2-méthylbutane)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Allemagne</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composé O.C.T. Tissue Tek&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Pays-Bas</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium 0.9 %</td><td>Braun, Melsungen, Allemagne</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Régime standard</td><td>Altromin, Lage, Allemagne</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Pays-Bas</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash ; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Allemagne</td><td>04-0002&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &micro ;-Plat 35 mm avec insert de culture, high</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle DIC pour &micro ;-Plats, avec insert en verre</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td>80050<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>Microscope holographique numérique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Company</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>Objectif de microscope</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Göttingen, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>La source d’imagerie, Brême, Allemagne</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie multimodal quantitative phase avec digital holographic microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

L&#39;incidence de la maladie inflammatoire de l&#39; intestin, à savoir, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. L&#39;étiologie des MICI reste inconnue et les stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur la suppression non spécifique du système immunitaire. Le développement de traitements qui ciblent spécifiquement l&#39;inflammation intestinale et la guérison des plaies épithéliales pourrait améliorer considérablement la gestion des MII, mais cela nécessite une détection précise des changements inflammatoires. À l&#39; heure actuelle, les candidats potentiels de médicaments sont généralement évaluées en utilisant des modèles animaux in vivo ou par des techniques à base de culture cellulaire in vitro. L&#39;examen histologique nécessite habituellement les cellules ou les tissus d&#39;intérêt à être colorés, qui peuvent modifier les caractéristiques de l&#39;échantillon et, en outre, l&#39;interprétation des résultats peut varier selon l&#39;expertise des enquêteurs. La microscopie holographique numérique (DHM), basée sur la détection de la longueur de chemin optique de retard, permetsans tache contraste d&#39;imagerie de phase quantitative. Cela permet aux résultats d&#39;être directement corrélées avec les paramètres biophysiques absolus. Nous montrons comment la mesure des variations de densité des tissus avec DHM, basée sur la mesure de l&#39;indice de réfraction permet de quantifier les altérations inflammatoires, sans taches, dans les différentes couches de spécimens de tissus du côlon des souris et des humains souffrant de colite. En outre, nous démontrons une surveillance sans étiquette multimodale en continu de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, en utilisant la DHM possible grâce à la détermination automatisée simple , de la zone blessée et la détermination simultanée des paramètres morphologiques tels que la masse sèche et une épaisseur de couche de cellules migrantes. En conclusion, DHM représente un précieux outil original et quantitative pour l&#39;évaluation de l&#39; inflammation intestinale avec des valeurs absolues pour les paramètres possibles, la quantification simplifiée de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro et a un fort potentiel de u diagnostic translationnelle doncproprement parler.

Configuration typique pour DHM Imaging pour Digital Holographic Microscopy (DHM) Pour effectuer l&#39; imagerie du champ lumineux et quantitative DHM contraste de phase d&#39; imagerie, nous avons appliqué un microscope inversé comme représenté sur la figure 1 B. Le système a été modifié par fixation d&#39; un module de DHM, comme décrit précédemment 25.<...

Une évaluation précise des effets anti-inflammatoires est de la plus haute importance pour l’évaluation de nouveaux médicaments potentiels pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. La microscopie holographique numérique permet d’évaluer l’inflammation dans des échantillons de tissus murins et du côlon humain, ainsi que d’évaluer multimodalement automatiquement la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro.

Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

L’objectif global de cette étude est d’utiliser la microscopie holographique numérique ou DHM pour fournir une imagerie quantitative automatisée sans coloration à contraste de phase d’échantillons de tissu côleux d’inflammation intestinale pour l’évaluation multimodale de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation gastro-intestinale et de la cicatrisation des plaies sur l’activité de la maladie : enflammée, humaine et marine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la détection et la quantification des cellules et des tissus par des paramètres physiques, de manière objective et sans colorant. La démonstration des procédures sera faite par Fittest Ketelhut, un technicien du Centre de technologie biomédicale.Mettez en place la culture cellulaire, incubez quatre fois dix à cinquième, Caco deux cellules par centimètre carré dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres équipées d’inserts de haute culture dans un milieu RPMI complété par FBS et des antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 95 % d’humidité et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après deux jours, traitez les

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Les emplacements en trois dimensions des objets faiblement diffusion peuvent être identifiés de manière unique à l'aide en ligne numérique microscopie holographique (SMIH), ce qui implique une modification mineure à un microscope standard. Notre logiciel utilise une heuristique d'imagerie simple, couplé avec Rayleigh-Sommerfeld rétro-propagation pour obtenir la position en trois dimensions et la géométrie d'un objet de phase microscopique.

Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets

Nous décrivons l’utilisation d’un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, du volume et de la densité cellulaires grâce à une combinaison d’imagerie en champ clair et en contraste interférentiel différentiel.

Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

Techniques d'imagerie de petits animaux permettent examens diagnostiques de série et les interventions thérapeutiques in vivo. Récemment, le champ des applications a considérablement élargi et comprend actuellement évaluation du développement de la tumeur du côlon, la cicatrisation des plaies et la surveillance de l'inflammation. Ce protocole illustre ces diverses applications potentielles de l'endoscopie murin.

Murin endoscopie pour In Vivo Guérison multimodale d'imagerie de la cancérogenèse et de l'évaluation de la plaie intestinale et l'inflammation

Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

La notation systématique de l’inflammation intestinale utilisant un système informatique-aidé libre est un outil puissant pour comparer quantitativement des changements histopathologiques dans des modèles de colite caractérisés par la présence des ulcères et des changements inflammatoires. L’évaluation histologique de score de colite renforce des observations cliniques et facilite l’interprétation de données.

Analyse systématique de notation pour l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite par le sulfate de sodium murine dextran

Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des images de l’intestin lors d’une blessure induite par laser. En exposant l’intestin de la souris à un laser multiphotonique, la perte d’une ou de plusieurs cryptes est induite localement. En imageant à plusieurs reprises la zone endommagée pendant des mois, la dynamique en temps réel de la récupération intestinale est capturée.

Ablation au laser et microscopie intravitale pour étudier le remodelage intestinal

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution, sans marquage et des organoïdes à l’aide de l’holotomographie à faible cohérence. Ce protocole détaille la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse d’images informatiques, permettant de visualiser en temps réel la dynamique structurelle et les réponses aux médicaments dans les organoïdes vivants.

Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

Cette étude présente une méthode d’imagerie 3D utilisant des tissus intestinaux entiers et la microscopie multiphotonique pour quantifier le mucus sécrété, permettant une analyse volumétrique précise et la visualisation de la dynamique du mucus en réponse à des stimuli comme le chlorure de carbamoylcholine.

Quantification tridimensionnelle du mucus intestinal à l’aide de l’imagerie tissulaire intégrale

Découvrez la microscopie holographique numérique pour l'imagerie quantitative sans colorant de l'inflammation intestinale et la cicatrisation épithéliale in vitro. Cette méthode permet l'évaluation objective des tissus murins et humains.

Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

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