Name: Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Découvrez la microscopie holographique numérique pour l'imagerie quantitative sans colorant de l'inflammation intestinale et la cicatrisation épithéliale in vitro. Cette méthode permet l'évaluation objective des tissus murins et humains.

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Nous remercions Faekah Gohar pour la relecture du manuscrit. Nous remercions Sonja Dufentester et Elke Weber pour leur assistance technique experte.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous démontrons que DHM fournit une évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite murins et des échantillons humains de tissus colique ex vivo. En outre, nous avons montré DHM peut surveiller en permanence la cicatrisation épithéliale tout en fournissant simultanément l&#39; information multimodale sur les altérations cellulaires. Dans DHM, la reconstruction d&#39;hologrammes capturées numériquement est effectuée numériquement 32. Par conséquent, par rapport à la microscopi...

Les maladies inflammatoires de l&#39; intestin (MICI), à savoir la rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires idiopathiques du tractus gastro - 1. La recherche sur la physiopathologie des MICI et l&#39;évaluation des nouveaux médicaments potentiels ou approches diagnostiques nouveaux est particulièrement important. Dans la recherche fondamentale et la prise en charge clinique des patients atteints de MII, la muqueuse intestinale est devenu un centre d&#39;attention 2,3. La muqueuse représente une limite anatomique, au cours de laquelle l&#39;interaction entre les bactéries commensales, les cellules épithéliales et les différents composants cellulaires du système immunitaire intestinal orchestrer homéostasie intestinale 4,5. Cependant, chez les patients atteints de MII, l&#39; inflammation intestinale non contrôlée et persistante conduit à la muqueuse des dommages, détectable comme ulcérations ou une sténose, qui peut finalement aboutir à répartition de la fonction de barrière épithéliale, qui s&#39;aggrave l&#39; inflammation locale 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; épithélial la guérison des plaies est donc crucial pour la régénération épithéliale suivant l&#39; inflammation , mais est également une exigence de base pour la guérison des ulcères gastro - intestinaux ou une fuite anastomotique après chirurgie gastro - intestinale 7. La cicatrisation epitheliale peut être simulé in vitro dans la plaie et la guérison des tests dans des modèles murins d&#39;inflammation intestinale 8,9. Fois in vitro et in vivo des approches présentent des inconvénients qui limitent la précision de l&#39; évaluation expérimentale. Essais in vitro, comme des dosages classiques de grattage, exiger des procédures de coloration prolongées ou transfection avec des chromophores fluorescents. Ils sont souvent limités par leur surveillance discontinue de la prolifération cellulaire et la migration qui ne peuvent pas être automatisés 10. Modèles in vivo, tels que le sulfate de dextran de sodium (DSS) de la colite induite, manquent souvent robustes lecture-outs, en partie en raison de la variation importante vu des marqueurs de laboratoire, maroi de tels marqueurs inappropriés pour évaluer la colite gravité 11,12. L&#39; analyse histologique de la muqueuse enflammée est encore actuellement l&#39;approche la plus valable pour déterminer la colite gravité mais, comme la plaie de guérison des essais épithéliales in vitro, nécessite une coloration et dépend de l&#39;expertise de l&#39; enquêteur 13. La microscopie holographique récemment numérique (DHM), une variante de microscopie de phase quantitative 14, a été identifié comme un outil utile pour l&#39;évaluation de l&#39; épithélium la cicatrisation in vitro et in vivo 15. DHM permet d&#39; évaluer la densité du tissu en mesurant la longueur de trajet optique à retard (OPD) , qui diagnostic perspectives roman cancer 16-18 et la quantification de l&#39; inflammation liée tissus altérations 19. En outre, la DHM permet la surveillance de la dynamique de la morphologie des cellules en déterminant l&#39;épaisseur de la cellule, la cellule recouverte de surface et intracellulaires (protéine) la quantité de contenu <sup&gt; 15,20. Dans des essais in vitro, DHM permet également l&#39;analyse de processus physiologiques, par exemple, cellulaire perméabilité à l&#39;eau en évaluant les variations de volume cellulaire et d&#39; épaisseur 21,22. En outre, les mesures DHM peuvent être automatisées qui empêche le biais de l&#39;échantillon chercheur associé. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation de DHM dans un modèle murin de l&#39; inflammation intestinale, et appliquons également DHM à l&#39; analyse d&#39;échantillons de tissus humains pour le suivi quantitatif de la cicatrisation des plaies comme un test sans marqueur in vitro. Tout d&#39;abord, nous évaluons les altérations inflammatoires de différentes couches murales colique chez la souris colitique et des coupes de tissus provenant d&#39;êtres humains atteints de MICI. Après avoir décrit la DHM phase quantitative procédure d&#39;imagerie, nous fournissons des instructions détaillées pour l&#39;utilisation des composants de microscope, la préparation des coupes de tissus et aussi décrire l&#39;évaluation des images de phase quantitatives acquises. Ensuite, nous montrons que DHM peut être utilisée pour la surveillance multimodale continue de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, et décrire l&#39;analyse des caractéristiques cellulaires telles que l&#39; épaisseur de la couche de cellules, la masse sèche et le volume cellulaire donner un aperçu de la drogue induit et cellulaires altérations physiologiques.

<table><tbody><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxyméthane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, États-Unis</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sodique (DSS)</td><td>TdB Consultation, Uppsala, Suède</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham’s F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Autriche</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgique</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (2-méthylbutane)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Allemagne</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Allemagne</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composé O.C.T. Tissue Tek&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Pays-Bas</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium 0.9 %</td><td>Braun, Melsungen, Allemagne</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Régime standard</td><td>Altromin, Lage, Allemagne</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Pays-Bas</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgique</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash ; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Allemagne</td><td>04-0002&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &micro ;-Plat 35 mm avec insert de culture, high</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle DIC pour &micro ;-Plats, avec insert en verre</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td>80050<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>Microscope holographique numérique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Company</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>Objectif de microscope</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Göttingen, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>La source d’imagerie, Brême, Allemagne</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie multimodal quantitative phase avec digital holographic microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

L&#39;incidence de la maladie inflammatoire de l&#39; intestin, à savoir, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. L&#39;étiologie des MICI reste inconnue et les stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur la suppression non spécifique du système immunitaire. Le développement de traitements qui ciblent spécifiquement l&#39;inflammation intestinale et la guérison des plaies épithéliales pourrait améliorer considérablement la gestion des MII, mais cela nécessite une détection précise des changements inflammatoires. À l&#39; heure actuelle, les candidats potentiels de médicaments sont généralement évaluées en utilisant des modèles animaux in vivo ou par des techniques à base de culture cellulaire in vitro. L&#39;examen histologique nécessite habituellement les cellules ou les tissus d&#39;intérêt à être colorés, qui peuvent modifier les caractéristiques de l&#39;échantillon et, en outre, l&#39;interprétation des résultats peut varier selon l&#39;expertise des enquêteurs. La microscopie holographique numérique (DHM), basée sur la détection de la longueur de chemin optique de retard, permetsans tache contraste d&#39;imagerie de phase quantitative. Cela permet aux résultats d&#39;être directement corrélées avec les paramètres biophysiques absolus. Nous montrons comment la mesure des variations de densité des tissus avec DHM, basée sur la mesure de l&#39;indice de réfraction permet de quantifier les altérations inflammatoires, sans taches, dans les différentes couches de spécimens de tissus du côlon des souris et des humains souffrant de colite. En outre, nous démontrons une surveillance sans étiquette multimodale en continu de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, en utilisant la DHM possible grâce à la détermination automatisée simple , de la zone blessée et la détermination simultanée des paramètres morphologiques tels que la masse sèche et une épaisseur de couche de cellules migrantes. En conclusion, DHM représente un précieux outil original et quantitative pour l&#39;évaluation de l&#39; inflammation intestinale avec des valeurs absolues pour les paramètres possibles, la quantification simplifiée de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro et a un fort potentiel de u diagnostic translationnelle doncproprement parler.

Configuration typique pour DHM Imaging pour Digital Holographic Microscopy (DHM) Pour effectuer l&#39; imagerie du champ lumineux et quantitative DHM contraste de phase d&#39; imagerie, nous avons appliqué un microscope inversé comme représenté sur la figure 1 B. Le système a été modifié par fixation d&#39; un module de DHM, comme décrit précédemment 25.<...

Une évaluation précise des effets anti-inflammatoires est de la plus haute importance pour l’évaluation de nouveaux médicaments potentiels pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. La microscopie holographique numérique permet d’évaluer l’inflammation dans des échantillons de tissus murins et du côlon humain, ainsi que d’évaluer multimodalement automatiquement la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro.

Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

L’objectif global de cette étude est d’utiliser la microscopie holographique numérique ou DHM pour fournir une imagerie quantitative automatisée sans coloration à contraste de phase d’échantillons de tissu côleux d’inflammation intestinale pour l’évaluation multimodale de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation gastro-intestinale et de la cicatrisation des plaies sur l’activité de la maladie : enflammée, humaine et marine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la détection et la quantification des cellules et des tissus par des paramètres physiques, de manière objective et sans colorant. La démonstration des procédures sera faite par Fittest Ketelhut, un technicien du Centre de technologie biomédicale.Mettez en place la culture cellulaire, incubez quatre fois dix à cinquième, Caco deux cellules par centimètre carré dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres équipées d’inserts de haute culture dans un milieu RPMI complété par FBS et des antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 95 % d’humidité et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après deux jours, traitez les cellules avec l’agent d’intérêt et retournez les cultures dans l’incubateur pendant 24 heures supplémentaires. Le lendemain, aspirez le surnageant et utilisez une pince à épiler pour retirer les inserts.Lavez la culture une à deux fois avec un millilitre de milieu de culture cellulaire tamponné HEPES pour éliminer les cellules mortes et tous les composants cellulaires restants de la zone de la plaie. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu frais tamponné HEPES et fermez le plat. Placez maintenant la boîte de Pétri dans le microscope holographique numérique et sélectionnez l’objectif 10 x.Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et sélectionnez le mode d’imagerie en fond clair. Réglez la chambre de chauffe à 37 degrés Celsius et placez la culture dans la chambre de chauffe. Ensuite, déplacez le champ de visualisation jusqu’à ce qu’une plaie appropriée avec une seule couche de cellules gigantesques et des bordures droites des deux côtés sans cellules mortes ni sérum puisse être visualisée dans la fenêtre de surveillance en direct.Capturez une image en lumière blanche de la zone initiale de la plaie. Ensuite, éteignez l’éclairage à lumière blanche et sélectionnez le mode de microscopie holographique numérique. Allumez l’éclairage laser et sélectionnez un temps d’exposition inférieur à trois millisecondes pour l’enregistrement de l’hologramme.Si les franges de brouillage holographiques hors accès apparaissent avec un contraste adéquat, capturez un hologramme échantillon et reconstruisez une image de phase quantitative avec le logiciel de reconstruction pour vérifier la qualité de l’image. Ensuite, démarrez une observation DHM en accéléré de la plaie en arrêtant l’enregistrement au point final approprié et obtenez une image finale de l’échantillon sous éclairage à lumière blanche. Pour l’induction aiguë du sulfate de sodium de dextran, ou induction de la colite DSS, fournissez trois grammes de DSS dissous dans 100 millilitres d’eau autoclavée aux souris ablibidim.Après sept jours, obtenir des sections de sept micromètres d’épaisseur d’échantillons de côlon roulés suisses chez les animaux témoins et traités. Immergez chaque section dans 50 à 100 microlitres de PBS et recouvrez les échantillons de lamelles de verre individuelles. Confirmez que le dessous des lames est exempt de poussière et d’autres formes de contamination.Ensuite, placez la première lame sur la platine du microscope et ajustez le champ de vision jusqu’à ce que la zone tissulaire d’intérêt soit visible. Faites la mise au point sur l’échantillon et capturez une image en fond clair dans le logiciel d’acquisition d’images. Ensuite, sélectionnez le mode d’imagerie DHM et passez à l’éclairage laser.Réglez un temps d’exposition inférieur à trois millisecondes et vérifiez que les franges d’interférence holographiques hors accès apparaissent avec un contraste adéquat dans la fenêtre d’imagerie en direct. Ensuite, capturez un hologramme numérique du tissu. Sur le plan endoscopique, les signes de colite modérée à sévère comprennent un épaississement de la paroi du côlon, des altérations du motif vasculaire, des nédudations des fibres et une granularité de la surface de la muqueuse.L’évaluation histologique conventionnelle des coupes du côlon révèle un œdème marqué dans la paroi colique des animaux traités par le DSS par rapport aux animaux témoins principalement situés dans la sous-muqueuse. Les images quantitatives de contraste de phase DHM correspondantes et les cartes d’indice de réfraction associées démontrent également que ces altérations tissulaires sans différences visibles dans les densités du menstroma épithélial sont particulièrement apparentes dans les échantillons de tissus natifs non colorés. L’indice de réfraction est significativement réduit dans l’épithélium, la sous-muqueuse et le stroma des souris colitiques par rapport aux témoins sains, avec une corrélation significative entre la perte relative de poids corporel et l’indice de réfraction chez les animaux de laboratoire.Ici, le suivi continu représentatif d’un test de cicatrisation des plaies par microscopie holographique numérique sur 45 heures est présenté. Permettant de calculer la surface couverte des cellules, l’épaisseur moyenne des cellules et la masse sèche cellulaire au cours du processus de guérison. Nous avons montré que la DHM permet une surveillance continue de la cicatrisation des plaies épithéliales tout en fournissant simultanément des informations bio-core sur les altérations cellulaires induites par les cytokines.De plus, nous démontrons l’évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite et les échantillons de tissu colique humain par DHM en mesurant les changements de l’indice de réfraction. Comme la DHM est basée sur la détection du retard de longueur du chemin optique, des paramètres biophysiques absolus, tels que la densité tissulaire, la masse sèche ou l’épaisseur cellulaire, peuvent être analysés par imagerie quantitative à contraste de phase sans colorant. L’aboutissement de la DHM avec des microscopes de recherche courants et la robustesse de la technique ouvrent la voie à des applications de routine de cette méthode en biologie cellulaire et en pathologie numérique.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie holographique numérique pour l’analyse des tissus de cultures de cellules vivantes dans l’environnement du laboratoire biomédical. En conclusion, le DHM crée un outil précieux, nouveau et quantitatif pour l’évaluation des paramètres absolus de l’inflammation, ainsi que pour la quantification simplifiée de l’épithélium volontaire in vitro avec un fort potentiel d’utilisation diagnostique translationnelle.

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