Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

L’objectif global de cette étude est d’utiliser la microscopie holographique numérique ou DHM pour fournir une imagerie quantitative automatisée sans coloration à contraste de phase d’échantillons de tissu côleux d’inflammation intestinale pour l’évaluation multimodale de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation gastro-intestinale et de la cicatrisation des plaies sur l’activité de la maladie : enflammée, humaine et marine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la détection et la quantification des cellules et des tissus par des paramètres physiques, de manière objective et sans colorant. La démonstration des procédures sera faite par Fittest Ketelhut, un technicien du Centre de technologie biomédicale.

Mettez en place la culture cellulaire, incubez quatre fois dix à cinquième, Caco deux cellules par centimètre carré dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres équipées d’inserts de haute culture dans un milieu RPMI complété par FBS et des antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 95 % d’humidité et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après deux jours, traitez les cellules avec l’agent d’intérêt et retournez les cultures dans l’incubateur pendant 24 heures supplémentaires. Le lendemain, aspirez le surnageant et utilisez une pince à épiler pour retirer les inserts.

Lavez la culture une à deux fois avec un millilitre de milieu de culture cellulaire tamponné HEPES pour éliminer les cellules mortes et tous les composants cellulaires restants de la zone de la plaie. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu frais tamponné HEPES et fermez le plat. Placez maintenant la boîte de Pétri dans le microscope holographique numérique et sélectionnez l’objectif 10 x.

Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et sélectionnez le mode d’imagerie en fond clair. Réglez la chambre de chauffe à 37 degrés Celsius et placez la culture dans la chambre de chauffe. Ensuite, déplacez le champ de visualisation jusqu’à ce qu’une plaie appropriée avec une seule couche de cellules gigantesques et des bordures droites des deux côtés sans cellules mortes ni sérum puisse être visualisée dans la fenêtre de surveillance en direct.

Capturez une image en lumière blanche de la zone initiale de la plaie. Ensuite, éteignez l’éclairage à lumière blanche et sélectionnez le mode de microscopie holographique numérique. Allumez l’éclairage laser et sélectionnez un temps d’exposition inférieur à trois millisecondes pour l’enregistrement de l’hologramme.

Si les franges de brouillage holographiques hors accès apparaissent avec un contraste adéquat, capturez un hologramme échantillon et reconstruisez une image de phase quantitative avec le logiciel de reconstruction pour vérifier la qualité de l’image. Ensuite, démarrez une observation DHM en accéléré de la plaie en arrêtant l’enregistrement au point final approprié et obtenez une image finale de l’échantillon sous éclairage à lumière blanche. Pour l’induction aiguë du sulfate de sodium de dextran, ou induction de la colite DSS, fournissez trois grammes de DSS dissous dans 100 millilitres d’eau autoclavée aux souris ablibidim.

Après sept jours, obtenir des sections de sept micromètres d’épaisseur d’échantillons de côlon roulés suisses chez les animaux témoins et traités. Immergez chaque section dans 50 à 100 microlitres de PBS et recouvrez les échantillons de lamelles de verre individuelles. Confirmez que le dessous des lames est exempt de poussière et d’autres formes de contamination.

Ensuite, placez la première lame sur la platine du microscope et ajustez le champ de vision jusqu’à ce que la zone tissulaire d’intérêt soit visible. Faites la mise au point sur l’échantillon et capturez une image en fond clair dans le logiciel d’acquisition d’images. Ensuite, sélectionnez le mode d’imagerie DHM et passez à l’éclairage laser.

Réglez un temps d’exposition inférieur à trois millisecondes et vérifiez que les franges d’interférence holographiques hors accès apparaissent avec un contraste adéquat dans la fenêtre d’imagerie en direct. Ensuite, capturez un hologramme numérique du tissu. Sur le plan endoscopique, les signes de colite modérée à sévère comprennent un épaississement de la paroi du côlon, des altérations du motif vasculaire, des nédudations des fibres et une granularité de la surface de la muqueuse.

L’évaluation histologique conventionnelle des coupes du côlon révèle un œdème marqué dans la paroi colique des animaux traités par le DSS par rapport aux animaux témoins principalement situés dans la sous-muqueuse. Les images quantitatives de contraste de phase DHM correspondantes et les cartes d’indice de réfraction associées démontrent également que ces altérations tissulaires sans différences visibles dans les densités du menstroma épithélial sont particulièrement apparentes dans les échantillons de tissus natifs non colorés. L’indice de réfraction est significativement réduit dans l’épithélium, la sous-muqueuse et le stroma des souris colitiques par rapport aux témoins sains, avec une corrélation significative entre la perte relative de poids corporel et l’indice de réfraction chez les animaux de laboratoire.

Ici, le suivi continu représentatif d’un test de cicatrisation des plaies par microscopie holographique numérique sur 45 heures est présenté. Permettant de calculer la surface couverte des cellules, l’épaisseur moyenne des cellules et la masse sèche cellulaire au cours du processus de guérison. Nous avons montré que la DHM permet une surveillance continue de la cicatrisation des plaies épithéliales tout en fournissant simultanément des informations bio-core sur les altérations cellulaires induites par les cytokines.

De plus, nous démontrons l’évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite et les échantillons de tissu colique humain par DHM en mesurant les changements de l’indice de réfraction. Comme la DHM est basée sur la détection du retard de longueur du chemin optique, des paramètres biophysiques absolus, tels que la densité tissulaire, la masse sèche ou l’épaisseur cellulaire, peuvent être analysés par imagerie quantitative à contraste de phase sans colorant. L’aboutissement de la DHM avec des microscopes de recherche courants et la robustesse de la technique ouvrent la voie à des applications de routine de cette méthode en biologie cellulaire et en pathologie numérique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie holographique numérique pour l’analyse des tissus de cultures de cellules vivantes dans l’environnement du laboratoire biomédical. En conclusion, le DHM crée un outil précieux, nouveau et quantitatif pour l’évaluation des paramètres absolus de l’inflammation, ainsi que pour la quantification simplifiée de l’épithélium volontaire in vitro avec un fort potentiel d’utilisation diagnostique translationnelle.