Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

L’objectif global de cette procédure est de former, de modeler et d’encapsuler des cellules dans des matrices extracellulaires à base de polymères synthétiques. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions biologiques critiques liées à l’identification de signaux extracellulaires qui régulent les réponses cellulaires au sein de micro-environnements hétérogènes. Le principal avantage de cette technique est qu’une matrice synthétique robuste est générée pour l’encapsulation et la culture cellulaires à l’aide de protocoles et de matériaux accessibles.

Cette méthode peut être utilisée pour la culture cellulaire contrôlée et pour étudier la réponse cellulaire in vitro. Il peut être appliqué à d’autres systèmes, notamment l’administration de médicaments et l’ingénierie tissulaire. Préparer les matériaux pour la formation d’hydrogel comme décrit dans le protocole de texte.

Fixez une lentille de collimation à l’extrémité du guide de lumière rempli de liquide pour assurer une intensité lumineuse relativement uniforme sur tous les échantillons. Ajustez la distance entre le guide de lumière et les échantillons pour obtenir une taille de spot qui couvrira les échantillons d’intérêt. Pour fabriquer des hydrogels sans motifs, préparez des hydrogels épais moulés dans des pointes de seringue en pipetant 10 à 20 microlitres de la solution de précurseur de gel dans l’extrémité d’une seringue stérile coupée.

Préparez un seul gel par seringue pour qu’il ait une épaisseur d’environ 0,5 à 1,5 millimètre, en fonction du volume et du diamètre de la seringue. Préparez des hydrogels minces dans des moules à lames de verre en plaçant le joint en caoutchouc sur les bords de la lame de verre non revêtue. Ensuite, pipetez cinq à 10 microlitres de la solution de précurseur de gel sur la lame de verre non revêtue.

Et placez la lame de verre recouverte d’un anti-adhésif sur la solution de gel. Fixez les lames de verre avec de petites pinces à reliure pour les stabiliser. Réglez l’intensité de la lampe pour atteindre 10 milliwatts par centimètre carré à la surface du gel pour les moules à pointe de seringue ou les moules à lames en verre.

Utilisation d’un radiomètre pour détecter l’intensité. Et placez les moules sous la lampe. Appliquez la lumière pendant une à cinq minutes pour permettre la polymérisation complète des gels.

Utilisez un temps de polymérisation plus court pour les gels à teneur plus élevée en téréphtalate de polyéthylène glycol. Et un temps plus long pour les gels à faible teneur pour produire des hydrogels entièrement polymérisés avec des modules dans la gamme des tissus mous. Placez les gels des moules à pointe de seringue dans une plaque stérile non traitée à 48 puits et placez les lames de verre dans un plat stérile.

Pour préparer des hydrogels à motifs, préparez la solution précurseur comme décrit dans le protocole textuel et pipetez vigoureusement la solution pour assurer un mélange uniforme de la solution. Ensuite, couvrez des gels préformés avec un peptide penton dans une solution photoinitiatrice de phosphate de lithium et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirez l’excédent de solution.

Si les gels sont moulés dans l’embout d’une seringue, utilisez une spatule pour transférer soigneusement de la plaque à 48 puits à une lame de verre stérile pour le motif. Placez un masque photo avec le motif souhaité directement sur les gels moulés à la seringue et à la lame de verre. Assurez-vous que la partie imprimée du masque touche le gel pour une fidélité optimale du motif.

Placez les échantillons sous la lampe et rayonnez pendant une minute. Après la mise en modèle, placez les gels moulés à la seringue dans une plaque stérile de 48 puits non traitée pour la culture tissulaire. Placez les gels moulés sur lames de verre qui sont collés aux lames de verre dans un plat stérile.

Rincer trois fois, 15 minutes avec un milieu de culture ou le tampon approprié en fonction des expériences prévues. Pour préparer la détection et la quantification des thiols libres dans les hydrogels photomotifs, préparez d’abord les solutions et effectuez les calculs comme décrit dans le protocole de texte. Formez de minces hydrogels pour modeler comme précédemment.

Plus précisément, fabriquez des gels avec un excès de thiols libres et tracez la moitié de ces échantillons avec le peptide penton à l’aide d’une lamelle transparente pour exposer complètement l’ensemble du gel avec de la lumière. Placez les gels à motifs et sans motifs dans les puits d’une plaque à 48 puits. Rincer pendant 15 minutes, trois fois avec le tampon de réaction d’Ellman, pour permettre la diffusion des espèces réagies finales hors du gel et le gonflement d’équilibre.

Ajoutez du tampon de réaction d’Ellman supplémentaire aux gels de rinçage, de sorte que le volume de gel gonflé avec le tampon de réaction soit un multiple de 20 microlitres. Par exemple, si le volume de gel gonflé prévu est de 15 microlitres, ajoutez cinq microlitres de tampon de réaction. Et si le volume de gel gonflé prévu est de 30 microlitres, ajoutez 10 microlitres de tampon de réaction.

Pipeter les étalons sixtine dans des puits individuels d’une plaque de 48 puits en multiples de 20 microlitres. En fonction du volume utilisé à l’étape précédente. Par exemple, si l’étape précédente avait un volume de gel gonflé, plus un tampon de réaction supplémentaire égal à 40 microlitres, ajoutez 40 microlitres de chaque étalon dans des puits vides individuels.

Ensuite, diluez le réactif d’Ellman et le tampon de réaction. Ajoutez le réactif d’Ellman dilué dans des puits contenant des étalons et des échantillons. Pour des échantillons de 20 microlitres, ajoutez 183,6 microlitres de solution dans chaque puits.

Incuber ou placer sur un agitateur pendant une heure et trente minutes, ou jusqu’à ce que la couleur de la solution corresponde à la couleur des gels par inspection visuelle, pour assurer une diffusion suffisante du dianion jaune 2-Nitro-5-thiobenzoïque, qui est généré lors de la réaction du réactif d’Ellman avec les thiols libres du gel. Prélever 100 microlitres de solution dans les échantillons et les étalons et les placer dans des puits d’une plaque de 96 puits. Lire l’absorption à 405 nanomètres sur un lecteur de plaques.

Pour visualiser les motifs photo, retirez l’excès de tampon de réaction en essuyant doucement les bords de l’hydrogel avec un mouchoir en papier. Pipetez le réactif d’Ellman directement sur la surface du gel. Image immédiate au microscope optique à 10x ou au stéréomicroscope avec une caméra couleur.

Collectez les cellules et préparez-les pour l’encapsulation comme décrit dans le protocole texte. Immédiatement après l’aspiration du PBS, suspendre les cellules granulées dans la solution précurseur à une concentration finale de cinq mille cellules par microlitre. Laissez une concentration appropriée de thiols libres pour une réaction ultérieure avec le peptide penton.

Si vous souhaitez un motif photo. Moulez, polymérisez et modélisez les hydrogels comme auparavant. Rincez les gels pendant 10 minutes, trois fois, dans un milieu de croissance après la formation des motifs pour éliminer les espèces n’ayant pas réagi et l’excès de photo-initiateur de phosphate de lithium.

Incuber les gels dans un milieu de croissance à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 jusqu’au point de temps souhaité pour une analyse plus approfondie. Réapprovisionnez le milieu toutes les 48 heures, ou selon les applications. Pour déterminer la viabilité des cellules encapsulées, retirez d’abord le milieu de croissance des gels et rincez pendant 15 minutes, trois fois, avec du PBS pour permettre la diffusion du milieu à partir des gels.

Ajoutez deux microlitres de l’homodimère-1 d’éthidium de deux millimolaires décongelés et 0,5 microlitre de solutions d’AN de calcium de quatre millimolaires décongelées à un millilitre de PBS stérile. Vortex pour assurer un mélange complet. Ajoutez 300 microlitres de solution stagnante à chaque moule de seringue dans les plaques à 48 puits, ou suffisamment pour couvrir la surface du gel sur une lame de verre dans un plat stérile.

Et incubez pendant 45 minutes. Retirez l’excès de solution sur pied et rincez pour éliminer l’excès de colorant des gels. Imagez les cellules au microscope confocal.

Ou sur un microscope à épifluorescence avec une capacité à 10x. Et 488 nanomètres d’excitation et 525 nanomètres d’émission. La concentration en thiols libres des hydrogels non structurés et à motifs quantifiée à l’aide de la méthode d’Ellman a démontré que les hydrogels initialement polymérisés pendant une minute et pendant cinq minutes ont des concentrations de thiols libres statistiquement similaires, indiquant une réaction rapide et une gélification complète en une minute.

La structuration en vrac ultérieure des gels incubés avec des peptides de penton pendant 30 minutes, et pendant une heure et 30 minutes, a une réduction de 60 à 80 pour cent de la concentration de thiol libre, indiquant une modification efficace de l’excès de thiol. Des motifs photographiques formés par la lumière brillante à travers des échantillons recouverts de masques, imprimés ici avec des lignes, peuvent être observés en deux dimensions avec l’application du réactif d’Ellman. Soit, en trois dimensions avec l’incorporation de peptides fluorescents dans l’imagerie ultérieure.

Des cellules souches humaines adultes encapsulées dans des hyrogels ont été traitées avec des colorants de viabilité et d’hydrotoxicité. Et imagé avec la microscopie confocale. Les cellules viables sans dommages à la membrane sont étiquetées en vert et indiquent la survie des cellules un jour après l’encapsulation.

Les cellules commencent à se propager dans la matrice six jours après l’encapsulation. Comme le montre l’image en médaillon. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des procédures de manipulation stériles et prudentes pour éviter d’endommager les cellules après l’encapsulation par l’introduction de contaminants ou de voilage mécanique.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunomarquage, la cytométrie en flux et l’expression génique peuvent être effectuées pour étudier la fonction et le destin des cellules en réponse à l’environnement extracellulaire. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie, de la bio-ingénierie et de la médecine, à l’étude de l’érosion des régions tissulaires ou de la progression de la maladie dans des matrices extracellulaires synthétiques avec contrôle des propriétés définies par l’utilisateur, vers le développement de nouvelles stratégies de traitement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’encapsuler les cellules et de modéliser des matrices souples pour les études de culture cellulaire contrôlée.