Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

L'objectif général de ce travail est de révéler la distribution à l'échelle nanométrique du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique cellulaire à l'aide de la microscopie de localisation fluorescente au niveau de la molécule unique. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant la signalisation par les phosphoinositides. Par exemple, quelle est l'organisation à l'échelle nanométrique des phosphoinositides au sein du complexe de signalisation dans la membrane cellulaire ?

Les principaux avantages de cette technique sont la haute résolution spatiale et le contournement du traitement par détergent, ce qui constitue un point majeur de préoccupation dans les études morphologiques des phospholipides. Cette approche comprend trois étapes principales. Étape 1 : la préparation de feuillets de membrane plasmique à partir de cellules vivantes.

Étape deux : Marquage des phosphoinositides et imagerie de fluorescence à l'échelle d'une molécule unique. Étape trois : Localisation à l'échelle d'une molécule unique et reconstruction de l'image. Le jour de l'expérience, recouvrir les lamelles d'une demi-millilitre à un millilitre de PDL.

Une ou deux heures plus tard, absorbez l'excès de PDL avec du papier absorbant sur le bord du lamelle. Ensuite, conservez les lamelles sur une plaque métallique à quatre degrés Celsius. Puis lavez les cellules INS-1 pré-perméabilisées, cultivées sur les lamelles, avec un demi-millilitre à un millilitre de PBS glacé contenant un millimolaire d'EGTA.

Répétez ce lavage trois fois et absorbez l'excès de PBS. Placez maintenant à l'aide de pinces les lamelles contenant les cellules cultivées sur les lamelles recouvertes de PDL, côté cellules vers le bas. Effectuez cette étape sur la plaque métallique refroidie.

Ensuite, transférez la plaque à quatre degrés Celsius pendant sept à dix minutes afin de laisser aux cellules le temps de s'attacher. Puis, utilisez une pince pour retirer délicatement la lame recouverte de cellules, ce qui laissera une fine couche de membrane cellulaire sur la lame revêtue de PDL. Lavez ensuite délicatement les feuillets membranaires avec un demi à un millilitre de PBS glacé.

Fixez maintenant chaque feuille de membrane dans environ 150 microlitres de PFA à quatre pour cent glacé contenant 0,2 pour cent de glutaraldéhyde dans du PBS. Laissez les membranes fixer pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la fixation, procédez immédiatement à l’imagerie ou recouvrez les préparations de PBS glacé et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Si des sondes de pH sont utilisées, il est fortement recommandé de procéder immédiatement à l'imagerie. Pour cette procédure, un système SMLM basé sur un microscope TIRF est utilisé. Avant l'imagerie des membranes, diluez un microlitre de solution de billes fluorescentes dans 10 millilitres de PBS contenant 50 millimolaire de chlorure de magnésium.

Ensuite, chargez un échantillon dans la chambre d'imagerie et ajoutez 200 microlitres de la solution diluée, puis attendez 10 minutes. Rincez ensuite l'échantillon trois fois avec du PBS. Démarrez maintenant le système d'imagerie PALM.

Dans le logiciel d'imagerie associé, sélectionnez le bouton du canal iRFP. Ensuite, repérez la membrane cellulaire exprimant les sondes de pH dans le canal iRFP et utilisez les billes fluorescentes pour la correction de la dérive. Réglez un angle TIRF normal sur 2140, ce qui correspond à 1,5 unités au-dessus de l'angle critique TIRF, et qui devrait être l'angle par défaut.

Ensuite, utilisez le bouton de capture pour acquérir une image TIRF conventionnelle dans le canal iRFP comme référence. Puis passez au canal PAm-Cherry1 en cliquant sur le bouton du canal RFP. Réglez ensuite le curseur du panneau AOTF complètement à droite pour une illumination maximale et appliquez le laser pendant environ 10 à 20 secondes afin de blanchir la fluorescence de fond de la membrane.

Ensuite, réglez le paramètre optimal de la caméra dans l'onglet format sur le binning 2 par 2. Puis définissez le protocole d'acquisition rapide dans l'onglet Acquisition de séquence ND sur 30 000 images à 20 hertz. Appliquez ensuite une puissance de 0,1 à un pour cent au laser de 405 nanomètres pendant l'acquisition d'images afin que les points spatialement isolés dans chaque image soient facilement identifiables.

Acquérez maintenant les images de PAm-Cherry1 en cliquant sur le bouton Exécuter maintenant. Le nombre de molécules pouvant être activées diminuera progressivement pendant les acquisitions. En réponse, augmentez progressivement l'intensité du laser de 405 nanomètres pour maintenir une densité optimale de signaux.

Acquérir des images jusqu'à ce que tout le signal PAm-Cherry1 soit activé. Ensuite, lors du traitement d'image et de la reconstruction, identifier et localiser les événements moléculaires individuels dans chaque image. Régler le seuil d'intensité de filtrage à l'aide du nombre seuil dans l'ondelette.

Des détails supplémentaires sont fournis dans le protocole écrit. La distribution spatiale de PIP2 est sensible à différentes méthodes de fixation, une fixation appropriée étant décrite dans le texte ; les sondes PIP2 ont montré une distribution cohérente lorsqu'elles étaient marquées par un anticorps anti-PIP2 ou par des domaines pH spécifiques. Par comparaison, les cellules vivantes marquées avec des domaines pH portant une étiquette EGFP n'apparaissent pas très différentes en imagerie.

Tous les échantillons présentaient une distribution uniforme des sondes. En revanche, une fixation non optimale entraînait la formation d'amas denses et nets de PIP2 ainsi qu'une diminution de l'intensité du signal. Dans des conditions de fixation optimales, les images de super-résolution du PIP2 dans les cellules fixées révélaient une distribution homogène des sondes sur une partie importante de la membrane plasmique, avec des gradients de concentration limités.

Des plaques membranaires enrichies en sondes PIP2 étaient réparties de manière dispersée et présentaient des tailles variées. Les images PALM de cellules vivantes montraient une distribution spatiale similaire à celle des cellules fixées. Une analyse détaillée des signaux PIP2 a révélé que leurs dynamiques étaient rapides au niveau local, sans toutefois entraîner de changements significatifs de leur abondance globale.

Cette technique introduit une nouvelle approche permettant aux chercheurs spécialisés dans le domaine des phospholipides d'explorer la distribution et l'activité d'autres sous-types de phosphoinositides dans des conditions physiologiques.