Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

L’objectif global de ce travail est d’émettre la distribution à l’échelle nanométrique du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique cellulaire en utilisant la microscopie de localisation de fluorescence à molécule unique. Cette méthode permet de répondre à des questions clés sur la signalisation du phosphoinositide. Par exemple, quelle est l’organisation à l’échelle nanométrique des phosphoinositides sous le complexe de signalisation dans la membrane cellulaire ?

Les principaux avantages de cette technique sont la haute résolution spatiale et le contournement du traitement détergent qui est une préoccupation majeure dans les études morphologiques des phospholipides. Cette approche comprend trois grandes étapes. Première étape : La préparation de la feuille de membrane plasmique à partir de cellules vivantes.

Deuxième étape : Marquage au phosphoinositide et imagerie de la florescence d’une molécule unique. Troisième étape : Localisation d’une molécule unique et reconstruction par imagerie. Le jour de l’expérience, le manteau glisse avec un demi-millilitre à un millilitre de PDL.

Une ou deux heures plus tard, absorbez l’excédent de PDL avec du papier de soie sur le bord de la lamelle. Rangez ensuite les lamelles sur une plaque métallique à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules INS-1 pré-transpistées qui ont été cultivées sur des lamelles avec un demi-millilitre à un millilitre de PBS glacé contenant un millimolaire d’EGTA.

Répétez ce lavage trois fois et absorbez l’excès de PBS. Maintenant, à l’aide d’une pince à épiler, placez les lamelles avec les cellules cultivées sur les lamelles enrobées de PDL, côté cellule vers le bas. Faites-le sur la plaque métallique refroidie.

Transférez ensuite la plaque à quatre degrés Celsius pendant sept à dix minutes pour donner aux cellules le temps de se fixer. Ensuite, utilisez une pince à épiler pour retirer doucement la lamelle chargée de cellules, ce qui laissera une fine couche de membrane cellulaire sur la lamelle recouverte de PDL. Ensuite, lavez délicatement les feuilles de membrane avec un demi-millilitre à un millilitre de PBS glacé.

Fixez maintenant chaque feuille de membrane dans environ 150 microlitres de PFA glacé à quatre pour cent avec 0,2 pour cent de glutaraldéhyde dans du PBS. Laissez les membranes se fixer pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la fixation, soit vous passez immédiatement à l’imagerie, soit vous recouvrez les préparations de PBS glacé et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Si des sondes de pH sont utilisées, une imagerie immédiate est fortement recommandée. Pour cette procédure, un système SMLM basé sur un microscope TIRF est utilisé. Avant d’imager les membranes, diluez un microlitre de solution de billes fluorescentes dans 10 millilitres de PBS avec 50 millimolaires de chlorure de magnésium.

Ensuite, chargez un échantillon dans la chambre d’imagerie et ajoutez 200 microlitres de la solution diluée, puis attendez 10 minutes. Ensuite, lavez l’échantillon avec du PBS trois fois. Démarrez maintenant le système d’imagerie PALM.

Dans le logiciel d’imagerie associé, sélectionnez le bouton de canal iRFP. Ensuite, trouvez la membrane cellulaire exprimant les sondes de pH dans le canal iRFP, utilisez les billes fluorescentes pour la correction de la dérive. Définissez un angle TIRF normal à 2140, qui est 1,5 plus profond que l’angle critique TIRF et doit être l’angle par défaut.

Utilisez ensuite le bouton de capture pour collecter une image TIRF conventionnelle dans le canal iRFP comme référence. Passez ensuite au canal PAm-Cherry1 en cliquant sur le bouton Canal RFP. Ajustez ensuite la barre de défilement du pavé AOTF complètement vers la droite pour un éclairage complet et appliquez le laser pendant environ 10 à 20 secondes pour blanchir la fluorescence de la membrane d’arrière-plan.

Réglez ensuite le paramètre optimal de l’appareil photo sous l’onglet format sur binning deux par deux. Réglez ensuite le protocole d’acquisition rapide sous l’onglet Acquisition de séquence ND sur 30 000 images à 20 hertz. Appliquez ensuite une puissance de 0,1 à 1 % au laser de 405 nanomètres pendant l’acquisition de l’image afin que les points isolés dans l’espace dans chaque image soient facilement identifiables.

Acquérez maintenant des images PAm-Cherry1 en cliquant sur le bouton Exécuter maintenant. Le nombre de molécules pouvant être activées diminuera progressivement au cours des acquisitions. En réponse, augmentez progressivement l’intensité du laser de 405 nanomètres pour maintenir une densité optimale de signaux.

Acquérez des images jusqu’à ce que tout le signal PAm-Cherry1 soit activé. Plus tard, lors du traitement et de la reconstruction de l’image, identifiez et localisez les événements moléculaires individuels de chaque image. Réglez le seuil d’intensité de filtrage avec le numéro de seuil dans l’ondelette.

De plus amples détails sont fournis dans le protocole texte. La distribution spatiale de PIP2 est sensible à différentes fixations avec une fixation appropriée décrite dans le texte, les sondes PIP2 ont montré une distribution cohérente lorsqu’elles sont marquées par l’anticorps PIP2 ou des domaines de pH spécifiques. En comparaison, les cellules vivantes marquées avec des domaines de pH marqués EGFP n’imagent pas beaucoup différemment.

Tous les échantillons ont montré une répartition uniforme des sondes. En revanche, une fixation non optimale a entraîné des grappes PIP2 à forte densité et une diminution de l’intensité du signal. Dans des conditions de fixation optimales, les images à super résolution de PIP2 dans les cellules fixes ont révélé une distribution homogène des sondes dans une partie significative de la membrane plasmique avec seulement des gradients de concentration limités.

Certains patchs membranaires enrichis de sondes PIP2 étaient peu répartis et avaient des tailles différentes. Les images PALM de cellules vivantes ont montré une distribution spatiale similaire à celle des cellules fixes. Une analyse détaillée des signaux PIP2 a révélé que leur dynamique était rapide dans les zones locales, mais cela n’a pas entraîné de changements significatifs dans leur abondance globale.

Cette technique offre aux chercheurs dans le domaine des phospholipides une nouvelle façon d’explorer la distribution et l’activité d’autres sous-types de phosphoinositides dans des conditions physiologiques.