Name: Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS __ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez la méthode RaPID pour isoler des ARN spécifiques et leurs protéines associées in vivo dans des levures. Cette technique permet d'identifier de nouvelles protéines liées à l'ARN et d'étudier la régulation de l'ARN.

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Nous remercions le Professeur Jeff Gerst et Boris Slobodin pour leurs conseils utiles pour la mise en place du protocole RaPID et en fournissant les plasmides nécessaires. Nous remercions également le Dr Avigail Atir-Lande pour son aide dans l&#39;établissement de ce protocole et le Dr Tamar Ziv du Smoler Proteomics Centre pour son aide dans l&#39;analyse LC-MS / MS. Nous remercions le Professeur TG Kinzy (Rutgers) pour l&#39;anticorps YEF3. Ce travail a été soutenu par la subvention 2011013 de la Fondation binationale Science.

Remarque: Insérez une séquence composée de 12 MS2 sites de liaison (boucles MS2; MS2L) dans le locus génomique désiré, habituellement entre le cadre de lecture ouvert (ORF) et 3 &#39;UTR. Un protocole détaillé pour cette intégration est prévue ailleurs 22. Vérifier une insertion correcte et à l&#39; expression par PCR, analyse de Northern ou par RT-PCR 20,23. Il est important de vérifier que l&#39;intégration ne sont pas intervenus avec la synthèse du 3&#39;UTR. En outre, un MS2-CP plasmide exprimant fusionné à SBP sous l&#39;expression d&#39;un promoteur inductible (depletion de methionine) devrait également être introduit dans les cellules 24. Une souche identique, à l&#39;exception des boucles de MS12 introduit, doit être utilisé en tant que contrôle pour la détection des signaux non spécifiques. 1. RaPID Purification <ol><li> Cultiver 500 ml de cellules de levure ( en utilisant 250-1,000 ml de cellules de levure en fonction du niveau du gène d&#39;intérêt de l&#39; expression) exprimant l&#39; ARNm MS2 marqués 20 etMS2-CP-GFP-SBP protéine de fusion 24 à OD 600 de 0,8 à 1,0 à 30 ° C dans le milieu de croissance approprié (par exemple, synthétique dextrose (SD) milieu sélectif). </li><li> Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) centrifuger comme précédemment (étape 1.2), remettre en suspension dans un volume égal (étape 1.1) de SD sans méthionine et laisser incuber pendant 45-60 min à 30 ° C pour induire l&#39; expression de la MS2 -CP-GFP-SBP protéine de fusion. Remarque: plus long temps d&#39;induction peut provoquer une agrégation de la GFP. </li><li> Mettre de côté 10 ml de cellules et extraire l&#39; ARN à partir de cet échantillon en utilisant la méthode simple &quot;de phénol chaud&quot; 25. Attention: Phénol est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. Note: Cet ARN est une bonne référence pour la qualité de l&#39; ARN isolé (figure 1A). </li><li> Pour 500 ml de cellules, ajouter 1,35 ml 37% de formaldéhyde à une c finaleoncentration de 0,1% pour réticuler les complexes ARN-protéine. Continuer l&#39; incubation à 30 ° C pendant 10 min. Attention: Formaldéhyde est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. </li><li> Ajouter 26,5 ml de 2,5 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et on incube pendant 3 minutes pour arrêter la réticulation. De cette étape, tout mettre sur la glace pour minimiser la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à 4 ° C et lavage avec 45 ml froid 1x PBS. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RaPID par 100 ml de culture cellulaire initiale. </li><li> Diviser en aliquotes de 500 pi dans des tubes de microcentrifugation bouchons à vis et ajoutez ~ 400 mg de perles de verre réfrigéré à chaque aliquote (environ 0,2 ml de plein tube PCR). </li><li> Lyse des cellules dans un cordon batteur pendant 3 min. Immédiatement mettre le lysat sur la glace. Remarque: la lyse des cellules de presse RNases cellulaires, qui sont la principale cause de la dégradation de l&#39;ARN. tampon RaPID Lysis contient une forte concentration de RNase INHIexpo-, tels que l&#39;héparine non spécifique de l&#39;inhibiteur de RNase et d&#39;inhibiteurs spécifiques. Travailler rapidement et garder tout froid est également recommandé. </li><li> Transférer le lysat à de nouveaux tubes. Percer un petit trou dans le fond de chaque tube de centrifugeuse avec une aiguille chaude (0,8 mm x 40 mm) et placez les tubes de microcentrifugation au-dessus des tubes de 15 ml. Utilisez la tête d&#39;une seringue de 5 ml d&#39;adaptateur entre les tubes de microcentrifugation et les tubes de 15 ml. Centrifuger l&#39;assemblage de tubes à 3000 xg pendant 1 min à 4 o C. </li><li> Transférer l&#39;écoulement du tube de 15 ml dans un nouveau tube de 1,5 ml et on centrifuge à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> surnageants Piscine de tous les tubes de 1,5 ml dans un seul tube de 15 ml, et mis de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l&#39;ARN et de l&#39;isolement de la protéine, respectivement. Note: Ceux - ci serviront les échantillons &quot;d&#39;entrée&quot; pour une analyse ultérieure (Figure 1). </li><li> Ajouter 300 pg d&#39;avidine par 500 ml de iculture de levure et incuber pendant préside d&#39; abord 30 minutes (ce qui peut être réduit à 10 min) à 4 ° C sous roulement constant (10 rpm). Remarque: les blocs avidine biotine et protéines biotinylées de se lier aux billes de streptavidine. </li><li> Pré-laver les billes de streptavidine avant l&#39;incubation avec le lysat cellulaire. <ol><li> Transférer environ 300 pi de la streptavidine perles suspension à un tube de 1,5 ml et retirer le surnageant supérieur. Cela se traduira par 250 ul de billes. Laver les billes deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide. Centrifuger les billes de streptavidine à 660 g pendant 2 min à 4 ° C entre chaque étape. </li><li> Bloquer les billes par incubation pendant 1 heure avec 0,5 ml de tampon de lyse rapide, 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA et 10 ul de 10 mg / ml d&#39;ARNt de levure. Les perles peuvent être laissées O / N dans une solution de blocage à 4 ° C avec rotation si nécessaire. </li><li> Laver deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide. Nota: Les billes magnétiques peuvent également être utilisés pour réduire le temps et background. Ceux-ci, cependant, ont une capacité inférieure à celle des billes de sépharose. </li></ol></li><li> Ajouter 250 ul des billes de streptavidine prélavés au lysat contenant de l&#39;avidine (étape 1.14) et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm). Remarque: Ce temps d&#39;incubation est un compromis entre la fourniture de temps de liaison suffisante et en minimisant les chances de dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Centrifuger à 660 g pendant 2 min à 4 ° C pour effacer les billes de streptavidine et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Mettez de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l&#39;ARN et de protéines d&#39;isolement, respectivement. Remarque: Ce seront les échantillons &quot;non consolidé&quot;. </li><li> Laver les billes avec 1 ml de tampon Lysis RaPID, secouer doucement, transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger comme dans l&#39;étape 1.17. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Laver les billes avec 1 ml de tampon RaPID Wash, et cette fois-rotation (10 rpm) pendant 5 min à 4 ° C. Répéter deux fois cette étape. </li&gt; <li> Laver les billes avec 1 ml de 1 x PBS et centrifugation comme ci-dessus. </li><li> Laver les billes à nouveau avec 120 ul de PBS 1x. Centrifugeuse comme ci-dessus, et prendre la totalité du surnageant pour l&#39;ARN et l&#39;extraction des protéines que l&#39;échantillon &quot;Wash&quot;. Note: Ce dernier échantillon de lavage indiquera la rigueur des lavages et devrait être du même volume que l&#39;échantillon d&#39;élution. Cela simplifiera le traitement et le chargement dans des essais ultérieurs. </li><li> Éluer l&#39;ARN et des protéines associées à ARN de la colonne, ajouter 120 pl de 6 mM de biotine dans 1 x PBS et on incube pendant 45 min à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm). </li><li> Centrifuger les perles comme ci-dessus et le transfert du matériel élue dans un nouveau tube de 1,5 ml. Spin l&#39;échantillon élue à nouveau et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml pour assurer qu&#39;aucun report de perles. </li><li> Prélever des échantillons pour l&#39;ARN ou l&#39;extraction des protéines. Remarque: Le volume prélevé doit dépendre de l&#39;essai et le niveau d&#39;expression de l&#39;ARN ou protéine d&#39;intérêt suivant. À titre indicatif, pour l&#39; analyse du Nord 26, prendre 80% de l&#39;échantillon, pour Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, prendre 20%, et pour la spectrométrie de masse 29 pour découvrir de nouvelles protéines, prendre la totalité de l&#39; échantillon. </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Ajouter un volume égal de 2x Réticulation Reversal tampon et incuber pendant 45 min à 65 ° C. Continuer directement pour l&#39;extraction de l&#39;ARN. Remarque: Le Réticulation Reversal Buffer contient de l&#39; acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ce qui améliore considérablement l&#39; extraction d&#39;ARN 20. </li><li> Utilisez le standard au phénol: méthode de chloroforme 26 pour extraire l&#39; ARN à partir de la &quot;entrée&quot; et des échantillons &quot;non liés&quot; (étapes 1.13 et 1.17). Note: Ces échantillons contiennent une grande quantité de l&#39;héparine inhibiteur de RNase, qui peut inhiber la suite inverse Transcriptase- (RT) des essais utilisant (par exemple, RT-PCR), par conséquent, LiCl précipitations 30 est conseillé de l&#39; enlever. Le &quot;wash &quot;et&quot; &quot;échantillons d&#39;élution (étapes 1.21 et 1.24) contiennent de faibles quantités d&#39;ARN et sont précipités à travers les étapes suivantes. </li><li> Ajouter un volume égal de 8M guanidinium-HCl (GuHCl) et deux volumes d&#39;éthanol à 100% pour le «lavage» et «échantillons d&#39;élution&quot;. Incuber à -80 ° C pendant au moins 2 heures. Remarque: guanidinium va efficacement dénaturer les protéines, et ainsi inhiber les RNases et protéases dans l&#39;échantillon. </li><li> Centrifuger à 20 000 x g, 4 ° C pendant 30 minutes et éliminer le surnageant. Laver le culot avec de l&#39;éthanol à 80% froid et centrifuger de nouveau à 20 000 x g, 4 ° C pendant 15 min. </li><li> Dissoudre le culot d&#39;ARN dans 400 ul de RNase eau libre et précipiter à nouveau pour enlever tout GuHCl restes ou d&#39;autres contaminants. Ajouter 40 ul d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 800 ul d&#39;éthanol à 100%, on incube à -20 ° C pendant au moins 1 h. </li><li> Centrifugeuse et laver comme à l&#39;étape 2.4 et de supprimer tous les éthanol avec une pointe de 10 pi. Reprendre le pell ARNet dans 10 ul d&#39;eau libre de RNase. Prendre des précautions supplémentaires comme le culot d&#39;ARN est généralement pas visible. Nota: Les échantillons peuvent être utilisés pour une analyse de Northern , comme décrit dans 23 (figure 1). </li></ol> 3. Protéines Préparation de Western blot ou analyse de spectrométrie de masse <ol><li> Ajouter 1/3 volume de tampon d&#39;échantillon Laemmli 4x (Pf) pour les échantillons de protéines et incuber 45 min à 65 ° C pour inverser la réticulation de l&#39;ARN et des protéines. Note: Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li><li> Les protéines sur un gel de polyacrylamide - SDS (SDS-PAGE) 31. Ajuster le pourcentage de gel en fonction de la taille des protéines à analyser. Remarque: gel d&#39;acrylamide 10% donne une large gamme de séparation et est bonne en première approximation. </li><li> Transfert des protéines sur la membrane comme dans l&#39;analyse par immunoblot standard 27 pour le contrôle de l&#39; efficacité d&#39; isolement (figure 1C). Colorer soit avec le bleu de Coomassie R250 ou argent tache avant l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Remarque: la tache d&#39; argent est le choix préféré car il est plus sensible et permet une meilleure détection (figure 1B). La coloration peut être réalisée soit avec des solutions préparées manuellement ou kits commerciaux. Le temps d&#39;incubation du gel dans la solution finale de colorant doit être déterminée expérimentalement. incubation longue peut révéler des protéines de faible abondance, mais peut causer des protéines fortement exprimés tels que MS2-CP-SBP-GFP pour être plus colorées et peut masquer des protéines environnantes dans leur voisinage. De plus, un bruit de fond élevé peut se produire. Suivez la réaction avec soin, et ajouter la solution d&#39;arrêt au moment opportun. </li><li> Découpez des bandes du gel et de les transférer à tubes de 1,5 ml. Conserver les échantillons à -20 ° C, ou envoient pour l&#39; extraction de la protéine et digestion par la trypsine suivie d&#39; une analyse LC-MS / MS 32. </li><li> Comme autre approche protéomique pour exclure l&#39;étape de séparation sur gel, la digestion matériau élue à partir de l&#39;étape de manière à 1,24lution à l&#39; aide de la trypsine et soumises à une analyse LC-MS / MS 33. Remarque: Omettre la séparation SDS-PAGE simplifie le protocole et augmente le rendement. Cependant, les échantillons peuvent contenir des traces de détergent NP-40, qui inhibe l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Pour surmonter ce problème, procédez comme suit: <ol><li> Exécutez la protéine sur SDS-PAGE 31 10 - 15 min. </li><li> Découper la partie entière de la voie ( à savoir où se trouvent les protéines). Remarque: L&#39;échantillon de protéine pourrait inclure une quantité importante de la protéine MS2-CP-SBP qui peuvent masquer les signaux de protéines de faible abondance. </li></ol></li></ol>

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<li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells%3A+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li>
<li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
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<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li>
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<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14(2004).</li>
<li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR%2FCas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572(2015).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li>
<li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC+yeast%3A+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Diverses méthodes utilisent l&#39;isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées 11,34 35. Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l&#39; ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP 36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l&#39;identification...

Protéines liant l&#39;ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae 1,2 et environ 15% de protéines de mammifères 3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l&#39;ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous - groupe important de la RBP est les protéines d&#39;ARNm de liaison (mRNP) 6,7. Au cours de l&#39; ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l&#39; exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation 6-8. Ainsi, l&#39;ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort. L&#39;identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio - informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l&#39; ARNm (revu dans 9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l&#39;identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l&#39;ARNm d&#39;intérêt comme appât pour cribler une banque d&#39;expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter 12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l&#39;interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l&#39;ARN appât. Une alternative à l&#39;approche génétique est purifi affinitécation de l&#39;ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d&#39;oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L&#39;interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L&#39;utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l&#39;ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant 3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d&#39;acide nucléique avec la complémentarité à l&#39;ARNm cible 16,17. L&#39;acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d&#39;interaction. Après réticulation, l&#39;acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères 18. Un aptamère d&#39;ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d&#39;intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L&#39;aptamère-ARE L&#39;ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d&#39;être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l&#39;isolement des protéines associées à l&#39;ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo 19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d&#39;enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d&#39;ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l&#39;expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu&#39;à six MS2-CPs se lier simultanément à l&#39;ARN et d&#39;accroître l&#39;efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l&#39;identification de nouvelles protéines d&#39;ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse. Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm 20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 &#39;non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association 21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 &#39;UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l&#39;identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Phénol acide (pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Phénol acide : Chloroforme (5:1, pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phénylméthylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>ribonucléase&nbsp ; Inhibiteur</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0,4-0,6mm de diamètre&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Perles de streptavidine</td><td>GE Healthcare&nbsp ;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-HCL pH 6,8, 8 % SDS, 0,4 M DTT, 40 % glycérol, 0,04 % Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Tampon de lyse</td><td></td><td></td> phénolique à chaud <td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS&nbsp ;</td></tr><tr><td>3 M Acétate de sodium pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % et 70 % d’éthanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeau</td><td></td><td></td><td></td>sans</tr><tr><td>rase Tampon</td><td></td><td></td> de lyse RaPID <td>20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5 % NP-40, 5 mg/ml d’héparine, 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de phénylméthylsulfonyl fluorure (PMSF), 10 & micro ; g/ml de leupeptine, 10 & micro ; g/ml d’aprotinine, 10 & micro ; g/ml Inhibiteur de la trypsine de soja, 10 & micro ; g/ml de pepstatine, 20 U/ml de DNase I, 100 U/ml de ribonucléase. Inhibiteur.</td></tr><tr>2x tampon <td></td><td></td><td>d’inversion de réticulation</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de lavage RaPID</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp ; 300 mM NaCl, 0,5 % NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>161-0449</td><td>Pour la détection de protéines dans les gels de polyacrylamide</td></tr> : <tr><td>milieu sélectif SD</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Base azotée de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium, 5 g/l Sulfate d’ammonium, 2 % de glucose, 350 mg/l Thréonine, 40 mg/l Méthionine, 40 mg/l Adénine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophane, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td><td>Cadeau de Kinzy TG. (École de médecine Robert Wood Johnson de l’UMDNJ)</td><td>1:5 000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3 000</td></tr><tr><td>Anti lapin IgG-HRP conjugué</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10 000</td></tr></tbody></table>

novel protéines __gvirt_np_nn_nnps&lt;__ arn-binding isolation par la méthodologie rapid

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

<classe p='jove_content'>Les protéines de liaison à l’ARN (RBP) jouent un rôle important dans tous les aspects du métabolisme et de la régulation de l’ARN. Leur identification est un défi majeur de la biologie moderne. Seules quelques méthodes in vitro et in vivo permettent d’identifier des RBP associées à un ARNm cible particulier. Cependant, leurs principales limites sont l’identification des RBP dans un environnement non cellulaire (in vitro) ou l’isolement à faible efficacité de l’ARN d’intérêt (in vivo). Une méthodologie de purification et d’identification des protéines de liaison à l’ARN (RaPID) a été conçue pour surmonter ces limitations chez la levure et permettre l’isolement efficace des protéines associées in vivo. Pour ce faire, l’ARN d’intérêt est marqué avec des boucles MS2 et co-exprimé avec une protéine de fusion d’une protéine de liaison à MS2 et d’une protéine de liaison à la streptavidine (SBP). Les cellules sont ensuite soumises à la réticulation et lysées, et les complexes sont isolés par des billes de streptavidine. Les protéines qui co-purifient avec l’ARN marqué peuvent ensuite être déterminées par spectrométrie de masse. Nous avons récemment utilisé ce protocole pour identifier de nouvelles protéines associées à l’ARNm PMP1 associé au RE. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de RaPID et discutons de certaines de ses limites et avantages.

RaPID permet l&#39;isolement d&#39;un ARN cible spécifique avec ses protéines associées. Critique pour son succès est de garder l&#39;ARN intact, autant que possible, de façon à obtenir une quantité suffisante de protéines. Pour déterminer l&#39;efficacité de l&#39; isolement et de la qualité de l&#39; ARN, on effectue une analyse de Northern (figure 1A). analyse Northern a l&#39;avantage de rendre compte directement l&#39;efficacité et la qualité des RaPID. Ainsi, les q...

Les interactions ARN-protéine sont au cœur de nombreux processus cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique et identifier de nouvelles protéines qui lui sont associées. Cela pourrait jeter un nouvel éclairage sur la façon dont les ARN sont régulés dans la cellule.

Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement un ARN spécifique avec les protéines qui lui sont associées in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le métabolisme et la régulation des ARN, telles que : quels sont les protéines spécifiques liées à un transcrit particulier ? Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité élevée d'isolement, ce qui permet d'identifier par la suite des protéines associées à des ARNm particuliers.La méthodologie rapide utilise une souche de levure qui surexprime simultanément un ARNM marqué avec MS2 et une protéine de fusion composée d'une protéine de liaison MS2 et d'une protéine de liaison à la streptavidine. Faire croître 500 millilitres de cellules de levure à 30 degrés Celsius dans un milieu sélectif de dextrose synthétique ou SD jusqu'à une DO600 comprise entre 0,8 et 1,0. Lorsque les cellules sont prêtes, centrifuger à 3000 ×g pendant 4 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant.Lavez les cellules dans du PBS et centrifugez à nouveau. Jetez le surnageant et re-suspendez les cellules dans un volume équivalent de SD sans méthionine. Incubez pendant 45 à 60 minut

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En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et...

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Transcrits d'ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d'action trans protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l'échelle du transcriptome à l'échelle des sites liaison à l'ARN de pratiques commerciales restrictives.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

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Méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

Cette vidéo présente un test de pull-down d’ARN in vitro pour identifier les protéines de liaison à l’ARN (RBP), qui interagissent avec les séquences d’éléments riches en adénylate-uridylate (ARE) dans l’ARNm. Les RBP cibles d’un lysat cellulaire sont mélangées à une sonde d’ARN pour former des complexes ARN-protéines. Les complexes sont isolés par purification d’affinité en utilisant l’affinité du marquage à la desthiobiotine de la sonde d’ARN avec une bille magnétique marquée à la...

Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

Dans cette vidéo, nous décrivons l’évolution systématique des ligands par la méthode d’enrichissement exponentiel (SELEX) pour identifier des séquences spécifiques de liaison à l’ARN pour une protéine cible d’intérêt. La protéine est incubée avec un grand nombre de séquences d’ARN randomisées, et les séquences d’ARN de liaison aux protéines sont isolées, amplifiées par PCR et séquencées pour identifier leurs sites de liaison aux protéines.

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Ce manuscrit décrit une approche permettant d’isoler certains RNP apparentés formés dans des cellules eucaryotes via un enrichissement spécifique dirigé par des oligonucléotides. Nous démontrons l’applicabilité de cette approche en isolant un RNP apparenté lié à la région rétrovirale 5' non traduite qui est composée de DHX9/ARN hélicase A.

L&#39;isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

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Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Un tandem RNA isolation (TRIP) pour la récupération des complexes protéine-ARNm endogène formé décrit. Plus précisément, complexes ARN-protéine sont réticulés en vivo, polyadénylé RNAs sont isolés des extraits avec oligo (décollement) perles et ARNm particulier est capturés avec des oligonucléotides antisens RNA mis à jour le. Protéines liés à l’ARNm sont détectés par l’analyse par immunotransfert.

Une procédure d’Isolation RNA axée sur les oligonucléotides Tandem pour récupérer des Complexes protéine-ARNm eucaryotes

Dans cette méthode, nous quantifions l'affinité de liaison des protéines de liaison d'ARN (RBPs) aux emplacements de liaison de cognate et non-cognate utilisant un simple, vivant, test de journaliste dans les cellules bactériennes. L'exemple est basé sur la répression d'un gène journaliste.

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

Ici, nous présentons une méthode in vitro optimisée pour découvrir, quantifier et valider les interacteurs protéiques de séquences d’ARN spécifiques, en utilisant l’extrait protéique total de cellules humaines, des billes de streptavidine recouvertes d’ARN biotinylé et une analyse par spectrométrie de masse.

Une analyse quantitative optimisée des protéines de liaison à l’ARN à l’aide d’ARN biotinylé court

Découvrez la méthode RaPID pour isoler des ARN spécifiques et leurs protéines associées in vivo dans des levures. Cette technique permet d'identifier de nouvelles protéines liées à l'ARN et d'étudier la régulation de l'ARN.

Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS<__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

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