Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS<__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID
30 septembre 2016
Les interactions ARN-protéine sont au cœur de nombreux processus cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique et identifier de nouvelles protéines qui lui sont associées. Cela pourrait jeter un nouvel éclairage sur la façon dont les ARN sont régulés dans la cellule.
L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement un ARN spécifique avec les protéines qui lui sont associées in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le métabolisme et la régulation des ARN, telles que : quels sont les protéines spécifiques liées à un transcrit particulier ? Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité élevée d'isolement, ce qui permet d'identifier par la suite des protéines associées à des ARNm particuliers.
La méthodologie rapide utilise une souche de levure qui surexprime simultanément un ARNM marqué avec MS2 et une protéine de fusion composée d'une protéine de liaison MS2 et d'une protéine de liaison à la streptavidine. Faire croître 500 millilitres de cellules de levure à 30 degrés Celsius dans un milieu sélectif de dextrose synthétique ou SD jusqu'à une DO600 comprise entre 0,8 et 1,0. Lorsque les cellules sont prêtes, centrifuger à 3000 ×g pendant 4 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant.
Lavez les cellules dans du PBS et centrifugez à nouveau. Jetez le surnageant et re-suspendez les cellules dans un volume équivalent de SD sans méthionine. Incubez pendant 45 à 60 minutes à 30 degrés Celsius pour induire l'expression de la protéine de fusion.
Après 45 à 60 minutes, mettre de côté 10 millilitres des cellules pour l'extraction d'ARN et utiliser les cellules restantes pour une purification rapide. Pour commencer cette procédure, ajouter aux cellules 1,35 millilitre de formaldéhyde à 37 %, afin d'obtenir une concentration finale de 0,1 % pour réticuler les complexes ARN-protéines. Poursuivre l'incubation à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Pour arrêter la réticulation, ajouter 26,5 millilitres de glycine 2,5 molaire, afin d'obtenir une concentration finale de 0,125 molaire, et incuber à 30 degrés Celsius pendant 3 minutes. À partir de ce moment, garder tout sur de la glace et travailler rapidement pour minimiser la dégradation de l'ARN. Centrifuger les cellules à 3000 fois G pendant 4 minutes à 4 degrés Celsius.
Jetez le surnageant, ajoutez 45 millilitres de PBS froid et centrifugez à nouveau. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans 5 millilitres de tampon de lyse rapide contenant une concentration élevée d'inhibiteurs d'ARNase. Répartissez la suspension cellulaire en aliquots de 500 microlitres dans des tubes microcentrifugeables à vis et ajoutez environ 400 milligrammes de billes de verre prérefroidies à chaque aliquot.
Lysat les cellules dans un homogénéisateur à billes pendant trois minutes. Placer immédiatement le lysat sur de la glace. Transférer le lysat dans de nouvelles tubes microcentrifuge.
Coupez le haut d'une seringue de 5 millilitres et placez-la sur un tube vide de 15 millilitres afin de servir d'adaptateur pour les tubes à vis. Utilisez une aiguille chauffée pour percer un petit trou dans le fond de chaque tube, puis placez-les au-dessus des tubes de 15 millilitres adaptés. Faites centrifuger les ensembles de tubes à 3000 ×g pendant une minute à 4 degrés Celsius afin d'éluer le lysat dans les tubes de 15 millilitres.
Transférez le flux sortant de chaque tube de 15 millilitres vers un nouveau tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 10 000 × g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Rassemblez le surnageant provenant de tous les tubes de 1,5 millilitre dans un seul tube de 15 millilitres. Prélevez un cinquantième et un centième du volume du lysat pour l'isolement de l'ARN et des protéines, respectivement.
Commencez la procédure rapide d'isolement des complexes ARN-protéine en ajoutant 300 microgrammes d'avidine au lysat cellulaire. Incubez pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante. Pendant que le lysat cellulaire est incubé avec l'avidine, pré-lavez les billes de streptavidine, transférez environ 300 microlitres de la suspension de billes de streptavidine dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, centrifugez le mélange, puis retirez le surnageant supérieur, ce qui donnera 250 microlitres de billes.
Ajouter 1 millilitre de tampon de lyse rapide aux billes et centrifuger à 660 × g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec le tampon de lyse rapide. Pour bloquer les billes, ajouter 0,5 millilitre de tampon de lyse rapide, 0,5 millilitre d'albumine sérique de bœuf (BSA) et 10 microlitres d'ARNt de levure, puis incuber pendant 1 heure à 4 degrés Celsius avec une rotation constante.
Lavez les billes deux fois avec 1 millilitre de tampon de lyse rapide. Ajoutez 250 microlitres des billes de streptavidine préalablement lavées au lysat contenant de l'avidine et incubez pendant 1 heure à 4 degrés Celsius avec une rotation constante. Cette durée d'incubation constitue un compromis entre un temps de liaison suffisant et la minimisation des risques de dégradation de l'ARN.
Après une heure, centrifuger à 660 ×g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius pour clarifier les billes de streptavidine. Transférer le surnageant dans un tube de 15 millilitres. Réserver un volume équivalent à 1/50e et 1/100e du lysat respectivement pour l'isolement de l'ARN et des protéines.
Ajouter 1 millilitre de tampon de lyse rapide aux billes. Mélanger par pipetage, transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 660 ×g pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Laver trois fois supplémentaires avec le tampon de lyse rapide.
Après le dernier lavage avec le tampon de lyse rapide, éliminer le surnageant, ajouter 1 millilitre de tampon de lavage rapide et incuber sous agitation pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Centrifuger et effectuer 2 autres lavages avec le tampon de lavage rapide. Laver les billes avec 1 millilitre de PBS et centrifuger comme précédemment.
Éliminer le surnageant, ajouter aux billes 120 microlitres de PBS et incuber 5 minutes dans un rouleau. Centrifuger comme précédemment et récupérer tout le surnageant pour l'extraction d'ARN et de protéines en tant qu'échantillon de lavage. Pour éluer l'ARN et les protéines associées à l'ARN, ajouter 120 microlitres de biotine à 6 millimolaire dans du PBS aux billes, puis incuber 45 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante.
Centrifuger les billes et transférer le matériau élué dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Centrifuger à nouveau l'échantillon élué et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 millilitre afin de s'assurer qu'aucune bille n'est transférée. Prélever des échantillons pour l'extraction d'ARN ou de protéines.
Pour déterminer l'efficacité d'isolement et la qualité de l'ARN, une analyse Northern a été réalisée sur deux ARN marqués, PMP1 et FPR1, provenant de la lyse des cellules fixées, de la lyse rapide des cellules et après élution avec de la biotine. Les ARN ribosomaux ont été détectés par coloration au bromure d'éthidium, et l'absence d'ARN ribosomaux dans l'échantillon d'élution indique la sévérité de la purification.
La sévérité et la spécificité de la purification sont davantage démontrées par l'absence de signal d'un ARNm non marqué dans les échantillons d'élution. Le signal apparent dans la piste FPR1, qui n'a pas la taille d'ACT1, provient d'une hybridation antérieure avec la sonde MS2L. Bien que l'ARN d'entrée soit quelque peu plus dégradé par rapport à l'ARN purifié selon le protocole au phénol chaud, une quantité significative d'ARN marqué de pleine longueur est spécifiquement isolée, comme le montre le signal intense dans les fractions d'élution.
Les échantillons protéiques peuvent être analysés par électrophorèse SDS-PAGE et coloration argentée avant l'analyse protéomique. La protéine de fusion MS2-CP-GFP-SBP, indiquée par la flèche, démontre une charge protéique équivalente. Les astérisques indiquent des bandes présentant des intensités différentielles qui ont été ultérieurement découpées dans le gel pour une analyse par spectrométrie de masse.
Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de porter des gants, de s'assurer d'avoir un espace de travail propre, de préparer les solutions avec de l'eau exempte d'ARN, et de travailler rapidement et efficacement afin de réduire la durée du protocole. N'oubliez pas que l'utilisation de réactifs comme le phénol et le formaldéhyde peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que le travail sous hotte chimique doivent toujours être prises pendant l'exécution de cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de purifier efficacement l'ARN de fayn-tress et de son organite associé.
Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'ARN-Seq peuvent être réalisées afin de détecter les ARN qui se lient au transcrit d'intérêt.
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Aperçu
Cet article présente une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique ainsi que les protéines associées. Cette technique vise à améliorer notre compréhension de la régulation des ARN au sein des cellules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Interactions ARN-protéine
- Processus cellulaires
- Métabolisme de l'ARN
Contexte
- Les interactions ARN-protéines sont cruciales pour diverses fonctions cellulaires.
- La compréhension de ces interactions peut fournir des informations sur la régulation des ARN.
- Les méthodes existantes peuvent manquer d'efficacité pour isoler des complexes spécifiques ARN-protéines.
- Cette étude présente une nouvelle approche utilisant des souches de levure.
Objectif de l'étude
- Isoler un ARN spécifique et identifier les protéines associées in vivo.
- Répondre à des questions relatives au métabolisme et à la régulation des ARN.
- Améliorer l'efficacité des techniques d'isolement des complexes ARN-protéine.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une souche de levure coexprimant un ARNm marqué avec MS2.
- Protéine de fusion entre la protéine de liaison MS2 et la protéine de liaison à la streptavidine.
- Culture des cellules de levure dans un milieu synthétique au dextrose.
- Centrifugation pour isoler les complexes ARN-protéine.
Résultats principaux
- Une haute efficacité dans l'isolement des complexes ARN-protéine a été obtenue.
- L'identification de nouvelles protéines associées aux ARNm a été facilitée.
- La méthode permet un traitement rapide des échantillons.
- Des informations sur la régulation des ARN ont été obtenues grâce à cette approche.
Conclusions
- Cette méthode fournit un outil précieux pour l'étude des interactions ARN-protéines.
- Elle améliore notre compréhension du métabolisme et de la régulation des ARN.
- Des applications futures pourraient conduire à des découvertes dans les processus cellulaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'identification des protéines liant l'ARN (RBPs) associées à des transcrits spécifiques est essentielle pour la validation de cibles en thérapeutique ARN et la découverte de biomarqueurs. La méthodologie RaPID permet l'isolement efficace de complexes ARN-protéine in vivo, soutenant la réduction des risques mécanistiques en précisant les interactions fonctionnelles dans un système pertinent pour la maladie. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en fournissant des données quantitatives et reproductibles sur les associations RBP-ARNm.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en identifiant les protéines liant l'ARN (RBP) associées à des ARNm pertinents pour la maladie, comme l'ARNm de PMP1 associé au réticulum endoplasmique.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole reproductible pour l'isolement de complexes natifs ARN-protéine à partir de levure, réduisant ainsi les faux positifs issus des méthodes in vitro.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les cibles grâce à une capture spécifique et hautement efficace d'interactions in vivo, facilitant le tri des projets dans un portefeuille.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des systèmes biologiques validés (souches de levure exprimant un ARN marqué avec MS2 et une protéine de fusion) pour des applications de criblage ultérieures.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement complexe par capture sur billes de streptavidine, améliorant ainsi la reproductibilité entre les expériences.
- Préparation du test : Produit des fractions purifiées d'ARN et de protéines adaptées à une analyse quantitative par spectrométrie de masse ou par Northern blot.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie l'identification des protéines liant l'ARN en phase de découverte à la validation préclinique en permettant des analyses complémentaires telles que l'ARN-Seq et l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE).
- Réduction des risques mécanistiques : Démontre la rigueur et la spécificité par l'absence de signaux d'ARN ribosomique et d'ARNm non marqués dans les échantillons élutés.
- Système pertinent pour les maladies : Applicable aux modèles de levure du métabolisme de l'ARN, avec une possibilité d'adaptation à des systèmes mammifères pour la validation de cibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode RaPID s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la vérification des hypothèses et la réduction des risques biologiques avant l'identification des candidats médicaments et la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en isolant des complexes spécifiques ARN-protéine à partir de conditions in vivo, précisant ainsi les associations fonctionnelles.
- Écrantage : Permet le développement de tests grâce à l'isolement standardisé de complexes ARN-protéine, soutenant des criblages reproductibles de composés ou de facteurs génétiques.
- Analytique : Génère des résultats quantitatifs par spectrométrie de masse et analyse Northern blot, permettant de comparer l'abondance des protéines liant l'ARN (RBP) selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant des complexes purifiés pour une validation ultérieure dans des modèles de maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour la découverte de RBP associées à plusieurs transcrits, réduisant ainsi les développements méthodologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à la régulation de l'ARN.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité grâce à des étapes définies de réticulation, de lyse et de purification sur billes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant des données fiables sur les interactions ARN-protéines liantes, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en se fondant sur des associations validées entre protéines liantes d'ARN dans des contextes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie moléculaire, en culture de levure et en techniques d'interaction ARN-protéine.
- Requiert des équipements pour la réticulation (formaldéhyde), la séparation sur billes magnétiques et la centrifugation à plusieurs vitesses.
- Implique une standardisation interéquipes de la composition du tampon de lyse et de l'utilisation d'inhibiteurs d'ARNase afin d'assurer la reproductibilité.
- Suppose des adaptations lors du transfert du système levure à d'autres modèles, notamment en ce qui concerne le marquage et l'expression des protéines de fusion.
- Comprend des limites pratiques telles que le risque de dégradation de l'ARN pendant le traitement et la nécessité d'une manipulation rapide et à froid pour préserver l'intégrité des complexes.
