"Phagosome Clôture Assay" pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

L'objectif général de ce protocole est de visualiser la formation du phagosome, ainsi que le site précis de la scission du phagosome en 3D, dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, ou microscopie TIRF. Cette méthode combine la microscopie TIRF avec l'épifluorescence afin de suivre étape par étape la localisation de deux protéines fluorescentes différentes au cours de l'extension des pseudopodes et de la fusion des extrémités. La technique fournit une méthode systématique pour déterminer l'angle critique et obtenir un signal TIRF, essentiel pour tirer des conclusions concernant les événements proches de la membrane plasmique.

La veille de la séance au microscope TIRF, allumez la chambre chauffante à 37 degrés Celsius afin d'assurer un chauffage homogène de la platine du microscope. Le lendemain matin, utilisez 100 microlitres de PBS, complété avec 0,1 % de BSA, pour laver deux fois 7 × 10⁶ globules rouges de mouton (SRBC) par boîtier de 35 millimètres à fond en verre. Après la deuxième centrifugation, resuspendez les cellules dans 500 microlitres d’IgG de lapin anti-SRBC à une concentration sous-agglutinante, dans du PBS complété avec 0,1 % de BSA par 5 microlitres de cellules, puis incubez les cellules pendant 30 minutes avec une rotation lente.

À la fin de l'incubation, laver les GRCS deux fois dans du PBS contenant du BSA, puis resuspendre les cellules dans 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius par boîtier. Ensuite, traiter les boîtiers de 35 millimètres à fond en verre avec 2 millilitres de poly-L-lysine à 0,1 % pendant 30 minutes à température ambiante, suivis de deux lavages avec 2 millilitres de PBS. Pour la fixation non covalente des GRCS, verser 2 millilitres des cellules opsonisées par l'IGG dans chacun des boîtiers revêtus de polylysine et centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse à rotor oscillant.

Jetez les surnageants et lavez les particules une fois avec 2 millilitres de PBS contenant 10 % de BSA. Incubez ensuite les particules avec 2 millilitres de PBS frais contenant 10 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante, puis effectuez trois lavages avec 2 millilitres de PBS. Après le dernier lavage, remplacez le PBS par 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius.

Placer une boîte recouverte de CRBS sur la platine du microscope. Ensuite, racler les cellules transfectées d'intérêt depuis le fond de la boîte de culture et pipeter les cellules plusieurs fois pour obtenir une suspension monocellulaire. Ajouter les cellules transfectées à la boîte recouverte de CRBS.

Démarrer le logiciel d'acquisition en direct. Repérer une cellule exprimant les protéines marquées par un fluorophore, puis ajuster la position de la boîte de façon à ce qu'une cellule d'intérêt se trouve au centre du champ. Acquérir 500 images à différents angles allant de zéro à 5 % par incréments de 0,01 degré, à une longueur d'onde d'excitation.

Pour déterminer l'angle critique pour lequel la lumière incidente est entièrement réfléchie à l'interface verre-milieu et générer une onde évanescente, ouvrez la séquence d'images dans le logiciel d'imagerie approprié. Sélectionnez une région d'intérêt dans la cellule présentant une fluorescence uniforme. Ensuite, sous l'onglet Image, sélectionnez Stacks, puis Plot Z Axis Profile.

Pour tracer l'intensité moyenne de fluorescence du profil selon l'axe z, mesurée dans la région d'intérêt, en fonction des angles sur l'axe des x. N'importe quelle valeur d'angle sur l'axe des x, supérieure à l'angle critique, peut ensuite être utilisée pendant la session de microscopie pour obtenir un signal TIRF. Ensuite, dans le logiciel d'acquisition en direct, utilisez l'éditeur de protocole pour régler les paramètres d'acquisition.

Y compris le nombre de séquences d'acquisition de boucle, les canaux fluorescents et leur intensité laser, l'angle TIRF, ainsi que le temps d'exposition. Réglez le déplacement Z de l'objectif pour atteindre le plan du mode épifluorescence. Ensuite, en mode épifluorescence, réglez l'angle TIRF à 1, puis remettez le déplacement Z de l'objectif sur le plan TIRF.

Ensuite, obtenez une image de la cellule en mode LED lumière vive. Recherchez maintenant une cellule d'intérêt présentant un niveau modéré d'expression de la protéine marquée par fluorescence, en cours de phagocytose avec un globule rouge de mouton (SRBC), et déplacez la cellule au centre du champ. Notez qu'une telle cellule peut être identifiée par une membrane plasmique étendue autour de la particule.

Saisissez le nombre d'images dans l'onglet Nombre de boucles pour démarrer une acquisition en continu de 500 à 1 000 images. Si nécessaire, modifiez l'intensité du laser et le temps d'exposition afin de vous adapter aux différents niveaux de fluorescence dans la cellule. Pour générer deux séquences d'images distinctes correspondant aux deux canaux, ouvrez les séquences dans le logiciel d'imagerie et cliquez sur l'onglet Image.

Dans le menu Hyperstacks, sélectionnez Stack to Hyperstack. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle, saisissez xyctz pour l'Ordre, le nombre de fluorochromes utilisés pour les Canaux, le nombre de tranches sur l'axe z, le nombre d'images divisé par le nombre de canaux sous Images, et Niveaux de gris pour le Mode d'affichage. Ensuite, séparez les canaux.

Ici, un exemple représentatif de film en microscopie TIRF en temps réel d'un essai de fermeture de phagosome dans des macrophages RAW 264.7 en cours d'ingestion d'un globule rouge SRBC opsonisé par l'IgG est présenté. Lorsque les extrémités des pseudopodes s'opposant à la lame de verre entourent le SRBC, un anneau d'actine F est détecté dans la zone TIRF et se rétrécit progressivement jusqu'à sa fermeture. Parallèlement, le signal flou d'actine F détecté en épifluorescence, après déplacement de la platine de trois micromètres au-dessus de la zone TIRF, correspond à la dépolymérisation à la base de la cupule phagocytaire.

Après trois minutes, les CRBS sont totalement internalisés, comme le confirme l'imagerie en lumière transmise. Grâce à cette méthode, il est possible de démontrer la présence d'actine à la base de la cupule phagocytaire, où se produit l'exocytose focale des compartiments intracellulaires. Après leur acquisition, les cellules peuvent être traitées ultérieurement pour une microscopie électronique corrélative, ou l'ensemble de la population cellulaire peut être fixée et congelée pour être traitée en vue d'une microscopie en immunofluorescence classique.

Il est important de garder à l'esprit que la phagocytose est très sensible à la température, et par conséquent, la température à l'intérieur de la chambre de chauffage ainsi que celle du milieu dans la boîte de culture doivent être maintenues constantes à 37 degrés Celsius tout au long de la procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'opsoniser les particules, d'enduire des lamelles avec ces particules, de déterminer les angles critiques pour la microscopie TIRF, et d'observer la localisation des protéines d'intérêt durant la phagocytose en cellules vivantes.