Name: Phagosome Clôture Assay pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez la formation et la fermeture des phagosomes en 3D dans les macrophages vivants par microscopie TIRF. Cette technique combine TIRF et épifluorescence pour suivre l'extension des pseudopodes et la fusion des pointes avec une haute résolution.

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Nous remercions le Dr Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) pour les discussions initiales sur l’approche expérimentale et le Dr Jamil Jubrail pour la lecture du manuscrit. Nadège Kambou et Susanna Borreill sont récompensées pour avoir réalisé des expériences avec la méthode dans notre laboratoire. Ces travaux ont été soutenus par des subventions du CNRS (Programme AIP), de la Ville de Paris et de l’Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 dont une bourse doctorale pour FMA) au FN, et de l’Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS) dont une bourse doctorale pour JM.

Remarque: Le plasmide utilisé Lifeact-mCherry est un cadeau genre de Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, généré après 17. 1. Cellules et Transfection Nota: Les macrophages RAW264.7 sont cultivées à la sous confluence dans un milieu complet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, pyruvate de sodium 1 mM, 50 uM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 10% de FCS ( sérum de veau foetal)) dans une plaque de 100 mm. Ils sont transfectées avec des plasmides codant pour des protéines marquées par fluorescence par électroporation. Routinière environ 5 - 6 x 10 6 cellules sont transfectées avec 20 pg ou 10 pg de plasmide pour chaque transfection ou la co-transfection , respectivement. A noter que d&#39;autres moyens de transfection à base de lipofection ou une électroporation peuvent être utilisés comme solutions de rechange. <ol><li> Racler les cellules avec un dispositif de levage de cellules et remettre en suspension dans 10 ml de milieu de culture par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Centrifugeuse lesuspension cellulaire 300 xg, 5 min à température ambiante en oscillant angle rotor. </li><li> Préchauffage 10 ml de milieu complet supplémenté avec 10 pg / ml de gentamicine à 37 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de &quot;tampon A de lavage&quot; du kit d&#39;électroporation. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire 300 xg, 5 min à température ambiante dans oscillante angle rotor. </li><li> Dans l&#39;intervalle préparer le mélange d&#39;ADN à température ambiante: 120 pi de 2 x tampon B, 20 pg de plasmide ADN codant pour la protéine d&#39;intérêt, qsp 240 ul de H 2 O. </li><li> Après centrifugation, jeter tout le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d&#39;ADN et de 4 mm transférer dans des cuvettes d&#39;électroporation. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Électroporation à 250 V, 900 pF. </li><li> remettre en suspension les cellules immédiatement au préchauffée (37 ° C) du milieu complet additionné de gentamicine et de la plaquem dans une boîte de 100 mm. </li><li> Incuber les cellules transfectées pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain matin, à remplacer le milieu complet avec 10 ml de milieu de microscopie sans sérum (RPMI 1640 sans rouge de phénol, 10 mM HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM, 50 uM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine). </li></ol> 2. Opsonisation des globules rouges Remarque: En tant que modèle de la cible de particule pour les macrophages, les cellules sanguines rouges de mouton (GRM) de l&#39;utilisation. Habituellement, environ 7 x 10 6 GRM par boîte de 35 mm de fond de verre est utilisé. <ol><li> Laver les GRM avec 100 ul de PBS 1x (tampon phosphate salin) /0.1% BSA (sérum albumine bovine) et centrifuge (600 xg, 4 min). </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans 100 ul de 1 x PBS / 0,1% de BSA et de centrifugation (600 x g, 4 minutes). </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans 1x PBS / BSA à 0,1% avec IgG de lapin anti-GRMà la concentration de sous-agglutinant. Utiliser 500 pi d&#39;une solution contenant un anticorps / 5 pi de GRM. Remarque: La concentration sous-agglutinante d&#39;anticorps correspond à la concentration la plus faible qui ne provoque pas d&#39;agglutination détecté en tant que formation d&#39;un réseau. D&#39;une manière générale, la concentration en sous-agglutinant est de 8,2 ug / ml. <ol><li> Déterminer la concentration d&#39;anti-GRM IgG nécessaires pour opsoniser les GRM par un test d&#39;hémagglutination. En série diluer l&#39;IgG anti-GRM (stock à 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 dans une microplaque. Ajouter 2 x 10 6 GRM dans chaque puits. Incuber la plaque dans l&#39;obscurité à la température ambiante pendant plusieurs heures. </li></ol></li><li> Incuber à température ambiante pendant 30 minutes avec rotation lente. </li><li> Après deux lavages dans 1 x PBS / BSA à 0,1%, comme décrit ci-dessus, remettre en suspension les globules rouges opsonisés IgG (IgG-GRM) dans un milieu exempt de sérum microscopie préchauffée (2 ml / boîte). </li></ol> Coating 3. Poly-lysine de Lamelles <ol><li> Pendant ce temps, Traiter des plats de 35 mm de fond de verre avec 2 ml de 0,01% de poly-L-lysine pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver les plats deux fois avec 2 ml de PBS 1x. </li></ol> 4. Fixation non covalente de GRM sur verre Plats Bas <ol><li> Verser 2 ml de GRM suspension par 35 mm de verre plat en bas. </li><li> Centrifugeuse avec un rotor oscillant à 500 g pendant 2 min sur des boîtes de fond 35 mm de verre. </li><li> Retirer le surnageant et laver une fois avec 2 ml de 1 x PBS / BSA à 10%. </li><li> Incuber les particules pendant 30 min avec 2 ml de 1 x PBS / BSA à 10% par boîte. </li><li> Laver la vaisselle trois fois avec 2 ml de PBS 1x. </li><li> Remplacer 1 x PBS avec 2 ml d&#39;préchauffée (37 ° C) Agent de microscopie sans sérum. </li></ol> 5. La phagocytose visualisées par TIRFM <ol><li> Microscope Remarque: TIRFM a été réalisée à l&#39; aide d&#39; un microscope équipé d&#39;un objectif à immersion (N 100X, NA1.49), une chambre de chauffage avec le CO 2, et deux chanterle caméras de détection de photons EMCCD (Electron Charge Multipliant Coupled Device) couplé à une lentille de 1.5X. <ol><li> La veille de la session de microscope TIRF, allumer la chambre de chauffage à 37 ° C pour permettre un chauffage homogène de la platine du microscope. </li></ol></li><li> Critical Détermination Angle Remarque: le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d&#39;image FRBR. <ol><li> Placer une boîte à fond de verre de 35 mm contenant SRBC opsonisées avec du milieu sans sérum microscopie au microscope. </li><li> Racler les cellules et les remettre en suspension dans le milieu avant de les ajouter (100 - 500 ul) dans le plat. </li><li> Utilisez le logiciel &quot;Acquisition Live&quot; pour contrôler le microscope et effectuer une excitation avec un 491 nm et / ou un laser 561 nm pour identifier les cellules exprimant des protéines marquées par fluorescence. </li><li> Identifier une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence. </li><li> Placez-le dans le milieu du terrain et d&#39;acquérir 500 imvieillit à une longueur d&#39; onde d&#39;excitation, avec des angles différents à partir de 0 ° à 5 °, avec un incrément de 0,01 ° (figure 2A). Les angles sont modifiés automatiquement par le système de microscope. </li><li> Déterminer l&#39;angle critique permettant la lumière incidente d&#39;être totalement réfléchi à la / interface support de verre et de générer l&#39;onde évanescente. En utilisant le logiciel ImageJ Color Profiler, ouvrez la séquence d&#39;images en cliquant sur &quot;Fichier&quot;, &quot;Ouvrir&quot; et sélectionnez le fichier. </li><li> Sélectionnez une région d&#39;intérêt (ROI), avec l&#39;outil rectangulaire, dans la cellule avec une fluorescence homogène (figure 2B jaune 1). </li><li> Tracer le «profil de l&#39; axe Z&quot; intensité moyenne de fluorescence mesurée dans le retour sur investissement avec la fonction des angles sur l&#39;axe des x en cliquant sur ​​l&#39; onglet &quot;Image&quot;, &quot;Stacks&quot; dans le menu déroulant et &quot;Plot axe Z Profil&quot; vers le bas (figure 2B rouge 2). Remarque: L&#39;angle critique est l&#39;angle menant à la mafluorescence ximum avant une forte diminution de la fluorescence. </li><li> Utilisez une valeur d&#39;angle sur l&#39;axe des x supérieur à l&#39;angle critique au cours de la session de microscopie pour obtenir un signal de FRBR comme exemple 2.00 (figure 2C). </li></ol></li><li> Acquisitions <ol><li> Utilisation d&#39;un logiciel d&#39; acquisition en direct, configurer les paramètres d&#39;acquisition avec le module &quot;Protocole Editor&quot; (figure 3A). <ol><li> Créer un protocole avec une &quot;boucle&quot; comprenant &quot;Canaux multi&quot; acquisition pour acquérir signal fluorescent de protéines d&#39;intérêt dans la région de la FRBR. Entrer l&#39;angle TIRF (par exemple 2,00), le temps d&#39;exposition (par exemple 50 ms) et l&#39;intensité du laser (par exemple 50%) (figure 3B 1). </li><li> L&#39;introduction d&#39;un &quot;Z move&quot; de l&#39;objectif 3 pm au-dessus de la région FRBR pour obtenir l&#39;acquisition du signal en épifluorescence avec l&#39;outil &quot;Multi-Canaux&quot;. Entrez un angle inférieur til angle critique (par exemple 1,00), le temps d&#39;exposition (50 ms) et l&#39;intensité du laser (50%) (figure 3B, 2 et 3). </li><li> Ensuite , ajoutez un &quot;z mouvement&quot; de l&#39;um objectif 3 ci - dessous, pour revenir dans la région de la FRBR (figure 3B 4). Ajouter un «instantané» de la cellule en pleine lumière LED (Light-Emitting Diode) (Figure 3B 5). </li></ol></li><li> Trouvez une cellule d&#39;intérêt avec un niveau modéré de fluorescence expression de protéine marquée qui initie la phagocytose des SRBC en étendant la membrane plasmique autour de la particule. </li><li> Placez-le au milieu du champ. </li><li> Lancer l&#39;acquisition de 500 flux - 1000 cadres. Dans l&#39;onglet &quot;compte de boucles&quot;, entrez &quot;750 frames&quot; (figure 3B 1). Remarque: le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d&#39;image FRBR. </li><li> Ouvrez les images de séquence dans l&#39;image J logiciel en cliquant&quot;Fichier&quot;, &quot;Ouvrir&quot; et en choisissant le fichier. </li><li> Séparer les canaux en cliquant sur l&#39;onglet &quot;Image&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; dans le menu déroulant et sur la fonction &quot;Stack HyperStack&quot;. Remplissez la fenêtre apparue: Ordre: xyctz; Channel (c): nombre de canaux (ex: &quot;2&quot; si vous avez deux fluorochromes); Tranches (z): nombre de tranches dans l&#39;axe z (ex: &quot;1&quot; s&#39;il n&#39;y a pas de mouvement dans l&#39;axe z); Cadres (t): nombre d&#39;images divisées par le nombre de canaux; Mode d&#39;affichage: Niveaux de gris. Note: Deux séquences d&#39;images séparées sont générées, correspondant aux deux canaux différents. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole expérimental décrit ici propose une méthode inédite pour suivre en temps réel et dans des cellules vivantes, avec une haute résolution, la formation d’un phagosome et en particulier sa fermeture. Plusieurs aspects techniques doivent être abordés. Tout d’abord, le test est très sensible à la température. Il est très important de vérifier que la chambre de chauffe est à 37 °C et que tous les fluides, appareils ou cellules sont conservés à l’intérieur de la chambre pour éviter les changements de température qui...

La phagocytose est une fonction cellulaire importante qui commence par la reconnaissance et la liaison de matière à la surface des récepteurs, ce qui conduit alors à l&#39;internalisation et la dégradation de la matière ingérée. Alors que les eucaryotes unicellulaires tels que le moule Dictyostelium discoideum et amibes utilisent phagocytose pour l&#39; alimentation sur les bactéries, les organismes supérieurs ont évolué avec des cellules professionnelles. Macrophages ou les cellules dendritiques sont la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans divers tissus et organes, et sont essentiels pour activer le système immunitaire adaptatif par la présentation de l&#39; antigène et la production de cytokines 1-4. Dans certaines circonstances , la phagocytose peut être effectuée par des cellules phagocytaires non professionnelles, par exemple, les cellules endothéliales et épithéliales. Ce processus est important pour maintenir l&#39;homéostasie au cours du développement et à l&#39;âge adulte pour le chiffre d&#39;affaires des tissus normaux et le remodelage. phagocytes Enfin, spécialisés tels que les cellules de Sertoli dans le testicule ou rétinienneles cellules épithéliales pigmentaires sont extrêmement puissants phagocytes 5. La formation d&#39;un phagosome où la dégradation des micro-organismes ou des débris cellulaires se produit commence par le regroupement des récepteurs phagocytaires sur la surface de la cellule phagocytaire. les événements de signalisation en aval des récepteurs suivants regroupement opsoniques tels que les récepteurs Fc (FcR) ou compléter les récepteurs (CR) ont été bien caractérisés. Cependant, il y a aussi de nombreux récepteurs non-opsoniques y compris les récepteurs Toll-like (TLR), des lectines, des récepteurs mannose et les récepteurs scavenger. Ces récepteurs reconnaissent les déterminants sur la surface des particules telles que des résidus de mannose ou fucose, la phosphatidylsérine et des lipopolysaccharides 1,6-9. la reconnaissance des pathogènes ou des débris cellulaires implique la liaison et le regroupement de plusieurs types de récepteurs phagocytaires, qui mènent ensuite à un remodelage intense et transitoire de l&#39;actine. En parallèle, l&#39;exocytose focal du Compartiment à intracellulairets contribue à la libération de la tension de la membrane et est importante pour la phagocytose efficace des grosses particules. Les événements de signalisation conduisant à la polymérisation et de la membrane de déformation actine ont été disséqués dans des modèles expérimentaux qui ont déclenché un seul récepteur phagocytaire. Au cours de la phagocytose FcR-médiée, il y a polymérisation de l&#39;actine intense qui est réglementée par les petites GTPases (Rac, Cdc42). Parmi les effecteurs en aval, la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduit à l&#39; activation de l&#39;Actine-protéine associée au complexe 2/3 (Arp2 / 3) qui nucléation filaments d&#39;actine 1,2,4,10. La production locale de phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) est crucial pour la polymérisation de l&#39; actine initial qui entraîne la formation de pseudopodes. Sa conversion en PI (3,4,5) P 3 est nécessaire pour l&#39; extension pseudopode et phagosome fermeture 11. Plusieurs voies contribuent à la disparition de PI (4,5) P2. Tout d&#39;abord détachement de phosphatidylinositol phosphate kinaSES (PIPKIs) de l&#39;arrestation de phagosome PI (4,5) P2 synthèse. En second lieu , il peut être phosphorylée et consommé par PI3K de classe I kinase (PI3K) et convertie en PI (3,4,5) P3 12. Un rôle pour phosphatases et phospholipases a également été impliqué dans PI (4,5) P 2 hydrolyse et élimination F-actine lors de la phagocytose dans les cellules de mammifères et Dictyostelium 13,14. La phospholipase C (PLC) δ hydrolyse PI (4,5) P2 en diacylglycérol et le phosphate de tris inositol-1,4,5-. La phosphatase OCRL PI (4,5) P2 et PI (3,4,5) P3 (Syndrome de Lowe de Lowe) a également été impliquée dans la formation du phagosome. formation locale précise de F-actine et son dépolymérisation est étroitement régulée dans l&#39;espace et le temps et nous avons montré que le recrutement des compartiments intracellulaires est important de fournir localement la phosphatase OCRL, contribuant ainsi à la dépolymérisation de l&#39;actine locale à la base de la coupe phagocytaire <sup&gt; 13,15. Pour cela, nous avons utilisé le expérimental a décrit ici. Les joueurs de mécanisme et moléculaires nécessaires à la clôture de phagosome et de scission membrane restent mal définies en raison des difficultés à visualiser et surveiller le site de la fermeture de phagosome. Jusqu&#39;à récemment, la phagocytose a été observée sur des cellules fixes ou vivant qui internalisent des particules sur leur face dorsale ou sur leurs côtés, ce qui rend la visualisation en temps opportun du site de phagosome fermeture difficile. En outre, les méthodes de fixation pourraient provoquer la rétraction des membranes et biaiser les résultats sur l&#39;extension de pseudopodes et la fermeture. En revanche, le test que nous avons mis en place et de décrire ici nous permet de visualiser l&#39; extension pseudopode et l&#39;étape de fermeture de la phagocytose dans les cellules vivantes 13, basée sur la microscopie interne totale de réflexion (TIRFM) 16. Cette technique optique utilise une onde évanescente pour exciter les fluorophores dans une zone mince à l&#39;interface entre un transparent, de sortecouvercle (lamelle) et un liquide (milieu de culture cellulaire). L&#39;épaisseur de la profondeur d&#39;excitation est d&#39;environ 100 nm à partir de la surface solide, ce qui permet la visualisation des événements moléculaires à proximité de la membrane plasmique. TIRFM permet un rapport signal-bruit de fond, et limite la fluorescence hors-focus collectées et la cytotoxicité due à l&#39;éclairage des cellules. En profitant de la TIRFM, on a développé le &quot;dosage de fermeture phagosome&quot;, dans lequel les lamelles sont activées par la poly-lysine et ensuite revêtue de globules rouges opsonisés IgG (IgG-GRM). Macrophages exprimant des protéines transitoirement marquées par fluorescence d&#39;intérêt sont alors autorisés à engloutir les IgG-GRM. Alors que les cellules se détachent les particules cibles qui ne sont pas liés de façon covalente à la surface du verre, les pointes des pseudopodes peuvent être observés et enregistrés en mode TIRF. acquisitions TIRF sont combinées avec des acquisitions dans le mode épifluorescence, après le passage du stade 3 um ci-dessus, qui permet à la visualization de la base de la coupe phagocytaire. L&#39;addition de médicaments pharmacologiques tels que ceux inhibant actine ou dynamine au cours du processus est également possible de disséquer le processus au niveau moléculaire. Le protocole décrit en détail ici est une lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 et des particules opsonisées, mais pratiquement, il peut être adapté à toute autre cellule phagocytaire et avec d&#39;autres cibles telles que des billes. Cette méthode permettra de mieux caractériser la régulation dans le temps et l&#39;espace des acteurs moléculaires impliqués dans l&#39;extension pseudopode et la fermeture de phagosome lors de divers processus phagocytaires.

<table><tbody><tr><td>Globules rouges anti-ovins IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine fraction de choc thermique, pH 7, &ge ; 98 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Élévateur de cellules</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes 4 mm</td><td>Cell project</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’électrotampon</td> à température ambiante <td>Cell project</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated TC-Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine solution</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Fond en verre Plats 35 mm non revêtus 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td> Objectif à immersion dans l’huile <td></td><td>(N 100X, NA1.49), chambre de chauffe avec CO2, une caméra détection de photons uniques EMCCD (Electron Dispositif multiplicateur à couplage de charge) et une lentille 1,5X</td></tr><tr><td>Solution de poly-L-Lysine 0,1 %</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td>Dilution à 0,01 % dans l’eau.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen GLUTAMAX&nbsp ; Supplément</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen, sans rouge de phénol (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Globules rouges d’omission (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservé dans un tampon Alsever à 4 &deg ; C avant utilisation</td></tr></tbody></table>

&quot;phagosome clôture assay&quot; pour visualiser formation phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale fluorescent microscopy (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

La phagocytose est un mécanisme utilisé par des cellules spécialisées pour internaliser et éliminer les micro-organismes ou les débris cellulaires. Il repose sur des réarrangements profonds du cytosquelette d’actine qui est la force motrice de l’extension de la membrane plasmique autour de la particule. De plus, l’engloutissement efficace de gros matériaux repose sur l’exocytose focale des compartiments intracellulaires. Ce processus est très dynamique et de nombreux acteurs moléculaires ont été décrits comme ayant un rôle dans la formation de la cupule phagocytaire. La régulation précise dans le temps et l’espace de toutes ces molécules reste cependant insaisissable. De plus, la dernière étape de la fermeture du phagosome a été très difficile à observer, car l’inhibition par l’interférence de l’ARN ou les mutants négatifs dominants entraîne souvent un blocage de la formation de cupules phagocytaires. 
Nous avons mis en place une approche expérimentale dédiée utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) associée à l’épifluorescence pour suivre étape par étape l’extension des pseudopodes et de leurs extrémités dans un phagosome se développant autour d’une particule faiblement liée à une lamelle. Cette méthode nous permet d’observer, avec une haute résolution, les extrémités mêmes des pseudopodes et leur fusion lors de la fermeture du phagosome dans des cellules vivantes pour deux protéines différentes marquées par fluorescence en même temps.

Le système expérimental décrit dans ce manuscrit est représenté schématiquement à la figure 1. Macrophages transfectées RAW264.7 exprimant les protéines d&#39;intérêt fusionné à un marqueur fluorescent sont placées en contact avec les moutons IgG-opsonisé globules rouges (GRM) qui étaient non covalente fixe sur la lamelle. Les macrophages peuvent détacher le SRBC de la lamelle à l&#39;engloutir. Le microscope TIRF utilisé permet l&#39;acquisition simultanée de signaux pr...

Nous décrivons un dispositif expérimental permettant de visualiser avec une haute résolution sans précédent la formation et la fermeture de phagosomes en trois dimensions dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Il permet de surveiller la base de la cupule phagocytaire, les pseudopodes en extension, ainsi que le site précis de scission du phagosome.

&quot;Phagosome Clôture Assay&quot; pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

L'objectif général de ce protocole est de visualiser la formation du phagosome, ainsi que le site précis de la scission du phagosome en 3D, dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, ou microscopie TIRF. Cette méthode combine la microscopie TIRF avec l'épifluorescence afin de suivre étape par étape la localisation de deux protéines fluorescentes différentes au cours de l'extension des pseudopodes et de la fusion des extrémités. La technique fournit une méthode systématique pour déterminer l'angle critique et obtenir un signal TIRF, essentiel pour tirer des conclusions concernant les événements proches de la membrane plasmique.La veille de la séance au microscope TIRF, allumez la chambre chauffante à 37 degrés Celsius afin d'assurer un chauffage homogène de la platine du microscope. Le lendemain matin, utilisez 100 microlitres de PBS, complété avec 0,1 % de BSA, pour laver deux fois 7 × 10⁶ globules rouges de mouton (SRBC) par boîtier de 35 millimètres à fond en verre. Après la deuxième centrifugation, resuspendez les cellules dans 500 microlitres d’IgG de lapin anti-SRBC à une concentration sous-agglutinante, dans du PBS complété avec 0,1 % de BSA par 5 microlitres de cellules, puis incubez les cellules pendant 30 minutes avec une rotation lente.À la fin de l'incubation, laver les GRCS deux fois dans du PBS contenant du BSA, puis resuspendre les cellules dans 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius par boîtier. Ensuite, traiter les boîtiers de 35 millimètres à fond en verre avec 2 millilitres de poly-L-lysine à 0,1 % pendant 30 minutes à température ambiante, suivis de deux lavages avec 2 millilitres de PBS. Pour la fixation non covalente des GRCS, verser 2 millilitres des cellules opsonisées par l'IGG dans chacun des boîtiers revêtus de polylysine et centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse à rotor oscillant.Jetez les surnageants et lavez les particules une fois avec 2 millilitres de PBS contenant 10 % de BSA. Incubez ensuite les particules avec 2 millilitres de PBS frais contenant 10 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante, puis effectuez trois lavages avec 2 millilitres de PBS. Après le dernier lavage, remplacez le PBS par 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius.Placer une boîte recouverte de CRBS sur la platine du microscope. Ensuite, racler les cellules transfectées d'intérêt depuis le fond de la boîte de culture et pipeter les cellules plusieurs fois pour obtenir une suspension monocellulaire. Ajouter les cellules transfectées à la boîte recouverte de CRBS.Démarrer le logiciel d'acquisition en direct. Repérer une cellule exprimant les protéines marquées par un fluorophore, puis ajuster la position de la boîte de façon à ce qu'une cellule d'intérêt se trouve au centre du champ. Acquérir 500 images à différents angles allant de zéro à 5 % par incréments de 0,01 degré, à une longueur d'onde d'excitation.Pour déterminer l'angle critique pour lequel la lumière incidente est entièrement réfléchie à l'interface verre-milieu et générer une onde évanescente, ouvrez la séquence d'images dans le logiciel d'imagerie approprié. Sélectionnez une région d'intérêt dans la cellule présentant une fluorescence uniforme. Ensuite, sous l'onglet Image, sélectionnez Stacks, puis Plot Z Axis Profile.Pour tracer l'intensité moyenne de fluorescence du profil selon l'axe z, mesurée dans la région d'intérêt, en fonction des angles sur l'axe des x. N'importe quelle valeur d'angle sur l'axe des x, supérieure à l'angle critique, peut ensuite être utilisée pendant la session de microscopie pour obtenir un signal TIRF. Ensuite, dans le logiciel d'acquisition en direct, utilisez l'éditeur de protocole pour régler les paramètres d'acquisition.Y compris le nombre de séquences d'acquisition de boucle, les canaux fluorescents et leur intensité laser, l'angle TIRF, ainsi que le temps d'exposition. Réglez le déplacement Z de l'objectif pour atteindre le plan du mode épifluorescence. Ensuite, en mode épifluorescence, réglez l'angle TIRF à 1, puis remettez le déplacement Z de l'objectif sur le plan TIRF.Ensuite, obtenez une image de la cellule en mode LED lumière vive. Recherchez maintenant une cellule d'intérêt présentant un niveau modéré d'expression de la protéine marquée par fluorescence, en cours de phagocytose avec un globule rouge de mouton (SRBC), et déplacez la cellule au centre du champ. Notez qu'une telle cellule peut être identifiée par une membrane plasmique étendue autour de la particule.Saisissez le nombre d'images dans l'onglet Nombre de boucles pour démarrer une acquisition en continu de 500 à 1 000 images. Si nécessaire, modifiez l'intensité du laser et le temps d'exposition afin de vous adapter aux différents niveaux de fluorescence dans la cellule. Pour générer deux séquences d'images distinctes correspondant aux deux canaux, ouvrez les séquences dans le logiciel d'imagerie et cliquez sur l'onglet Image.Dans le menu Hyperstacks, sélectionnez Stack to Hyperstack. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle, saisissez xyctz pour l'Ordre, le nombre de fluorochromes utilisés pour les Canaux, le nombre de tranches sur l'axe z, le nombre d'images divisé par le nombre de canaux sous Images, et Niveaux de gris pour le Mode d'affichage. Ensuite, séparez les canaux.Ici, un exemple représentatif de film en microscopie TIRF en temps réel d'un essai de fermeture de phagosome dans des macrophages RAW 264.7 en cours d'ingestion d'un globule rouge SRBC opsonisé par l'IgG est présenté. Lorsque les extrémités des pseudopodes s'opposant à la lame de verre entourent le SRBC, un anneau d'actine F est détecté dans la zone TIRF et se rétrécit progressivement jusqu'à sa fermeture. Parallèlement, le signal flou d'actine F détecté en épifluorescence, après déplacement de la platine de trois micromètres au-dessus de la zone TIRF, correspond à la dépolymérisation à la base de la cupule phagocytaire.Après trois minutes, les CRBS sont totalement internalisés, comme le confirme l'imagerie en lumière transmise. Grâce à cette méthode, il est possible de démontrer la présence d'actine à la base de la cupule phagocytaire, où se produit l'exocytose focale des compartiments intracellulaires. Après leur acquisition, les cellules peuvent être traitées ultérieurement pour une microscopie électronique corrélative, ou l'ensemble de la population cellulaire peut être fixée et congelée pour être traitée en vue d'une microscopie en immunofluorescence classique.Il est important de garder à l'esprit que la phagocytose est très sensible à la température, et par conséquent, la température à l'intérieur de la chambre de chauffage ainsi que celle du milieu dans la boîte de culture doivent être maintenues constantes à 37 degrés Celsius tout au long de la procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'opsoniser les particules, d'enduire des lamelles avec ces particules, de déterminer les angles critiques pour la microscopie TIRF, et d'observer la localisation des protéines d'intérêt durant la phagocytose en cellules vivantes.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit TIRF, une technique basée sur la microscopie à réflexion interne totale pour visualiser la dynamique de polymérisation de l’actine et des microtubules. La méthode permet l’imagerie à haute résolution de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules en temps réel, ce qui est essentiel pour comprendre les interactions cellulaires.

Microscopie TIRF pour visualiser la dynamique du couplage de l’actine et des microtubules

Cette vidéo présente une technique de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) à haute résolution pour la visualisation en temps réel de la formation et de la fermeture des phagosomes pendant la phagocytose médiée par les macrophages de globules rouges (GR) opsonisés par les IgG fixés à la surface d’une boîte à fond de verre. Les macrophages étendent les pseudopodes autour des globules rouges et les engloutissent à l’intérieur des phagosomes, les détachant de la surface du...

Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

Source : Daniele, F., et. al Sondes TIRFM et GFP sensibles au pH pour évaluer la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y : imagerie cellulaire et analyse des données. J. vis. exp. (2015). Cette vidéo montre l’imagerie de cellules de neuroblastome humain à l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les vésicules synaptiques marquées au fluorophore. Les cellules sont d’abord focalisées en mode...

Imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo fait la démonstration de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les événements exocytaires dans les neurones corticaux. Un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP) sensible au pH devient fluorescent lors de la fusion...

Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires 

À polarisation selon une réflexion interne totale microscopie de fluorescence (pTIRFM) permet la détection en temps réel de la dynamique de la membrane cellulaire. Cet article décrit la mise en œuvre de pTIRFM pour l'étude du remodelage de la membrane lors de l'exocytose régulée. La technique est généralisable à d'autres processus en biologie cellulaire qui impliquent directement ou indirectement changements dans la forme de la membrane.

Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

endocytose médiée par la clathrine, un processus rapide et hautement dynamique internalise de nombreuses protéines, y compris les récepteurs de signalisation. Le protocole décrit ici visualise directement la cinétique des événements endocytaires individuels. Ceci est essentiel pour comprendre comment les membres centraux de la machinerie endocytaire se coordonnent les uns avec les autres, et comment la cargaison de protéines influence ce processus.

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Nous présentons un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie interférence-réflexion et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de protéines associées à des microtubules marquées par fluorescence.

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Découvrez la formation et la fermeture des phagosomes en 3D dans les macrophages vivants par microscopie TIRF. Cette technique combine TIRF et épifluorescence pour suivre l'extension des pseudopodes et la fusion des pointes avec une haute résolution.

Phagosome Clôture Assay pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM) (Vidéo) | JoVE Journal

"Phagosome Clôture Assay" pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

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